HER2腫瘤靶向親合體重組蛋白的構(gòu)建、表達純化及功能驗證

池小琴

福建省廈門市廈門大學附屬中山醫(yī)院肝膽實驗室，福建廈門 361004

HER2腫瘤靶向親合體重組蛋白的構(gòu)建、表達純化及功能驗證

池小琴

福建省廈門市廈門大學附屬中山醫(yī)院肝膽實驗室，福建廈門 361004

目的 實現(xiàn)重組親合體的高效表達和純化，并驗證其活性。 方法 選擇2016年1—12月該院收治的56例卵巢癌患者為研究對象，對HER2親合體編碼序列進行優(yōu)化，增加其與納米載體的連接位點，提高表達和純化效率。重組表達產(chǎn)物ZHER2:342經(jīng)過凝膠親和層析純化和質(zhì)譜檢測分子量，并將純化產(chǎn)物作為靶向分子連接納米藥物，檢測其對HER2高表達細胞的靶向能力。結(jié)果 ZHER2:342重組親合體產(chǎn)物純度約為97.8%，回收效率1.0 mg/mL。純化產(chǎn)物分子量為7.648 kDa，與理論值7.631 kDa誤差0.2%，表明構(gòu)建的Cys-ZHER2:342-6His重組親合體正確。細胞實驗表明其可顯著提高納米藥物對乳腺癌細胞的細胞毒性（P＜0.01），對HER2高表達的腫瘤細胞具有特定的靶向性。結(jié)論 重組表達產(chǎn)物ZHER2:342構(gòu)建正確，可實現(xiàn)高效表達純化并對HER2高表達的腫瘤細胞具有特定的靶向性。

腫瘤；靶向分子；重組親合體；表達純化；靶向能力分析

親合體是通過定向分子進化技術(shù)篩選獲得的一類新型的獨特的蛋白結(jié)合配體，親合體的結(jié)合位點與抗體相似且親和力強；分子量小，不易在體內(nèi)誘發(fā)免疫應答，組織穿透性好；性質(zhì)十分穩(wěn)定[1]。

親合體的這些獨特優(yōu)勢引起了科研工作者的關(guān)注，研究人員利用HER2親合體ZHER2作為HER2高表達腫瘤疾病（宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌（鱗癌）的特定靶向配體[2-5]。目前，將親合體ZHER2:342作為靶向分子進行靶向腫瘤能力的研究中，親合體主要是通過化學合成獲得的[6-7]。但化學合成親合體的方法成本較高，且雜質(zhì)多，不易純化。

該文對重組親合體的編碼序列按照大腸桿菌的密碼子偏好性進行堿基優(yōu)化,并在序列中添加腸激酶酶切位點、半胱氨酸密碼子、6His-Tag純化標簽等序列,增加重組親合體與納米載體的連接位點，并保證表達產(chǎn)物的準確性，提高了表達和純化效率,降低了生產(chǎn)成本；該文還通過細胞實驗驗證了表達產(chǎn)物對卵巢癌細胞的特定靶向能力。對2016年1—12月該院收治的56例卵巢癌患者進行了細胞學驗證，現(xiàn)將內(nèi)容總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

ATO購于北京華奉聯(lián)博科技有限公司，氨芐青霉素、IPTG、腸激酶rEK、透析袋、FITC等購于上海生工。交聯(lián)劑MAL-NHS、NAP-10凝膠柱、Superdex 75 10/300 GL凝膠柱、HisTrap HP預裝柱購于GE公司。所有細胞系購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 重組靶向親合體的構(gòu)建

1.2.1 重組親合體表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將HER2親合體的核苷酸序列進行了重組優(yōu)化設(shè)計，在序列前端加上BamHⅠ酶切位點、腸激酶酶切位點和半胱氨酸殘基，后端加上6His-Tag純化標簽和XhoⅠ酶切位點，方便表達產(chǎn)物的分離純化及與納米顆粒的連接（圖1）。并將重組親合體Cys-ZHER2:342-6His（以下簡寫為 ZHER2:342）的核苷酸序列按照大腸桿菌的密碼子偏好性進行堿基優(yōu)化，優(yōu)化后的序列

CATCATTAATAGCTCGAG下劃線部分為HER2親合體的編碼序列）送上海生工合成，由于后續(xù)實驗。

圖1 重組親合體ZHER2:342的核苷酸序列示意圖

重組親合體ZHER2:342基因片段與pET32a(+)表達型質(zhì)粒分別進行酶切連接，構(gòu)建重組親合體表達質(zhì)粒pET32a (+)-ZHER2:342，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切結(jié)果驗證。

1.2.2 利用大腸桿菌表達重組親合體ZHER2:342制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，并用IPTG誘導表達6 h。收集菌體，超聲破碎細胞，獲得胞內(nèi)可溶性表達產(chǎn)物，用Tricine SDS-PAGE電泳驗證表達產(chǎn)物。

1.2.3 重組親合體ZHER2:342的純化方法 超聲破碎后的上清液經(jīng)快速蛋白液相色譜 （Fast protein liquid chromat ography，F(xiàn)PLC）純化，純化柱用HisTrap HP預裝柱（GE），得到融合蛋白Trx-ZHER2:342。

將融合蛋白于4℃下透析；再用腸激酶rEK酶切12～24 h；最后用Superdex 75 10/300 GL凝膠柱(GE)層析分離得到目標產(chǎn)物：重組親合體ZHER2:342。蛋白含量采用BCA方法測定。最終純化產(chǎn)物用低溫真空冷凍干燥獲得重組親合體ZHER2:342的凍干粉，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 重組親合體ZHER2:342的鑒定及靶向能力分析

取少量重組親合體ZHER2:342純化產(chǎn)物置于透析袋中，用蒸餾水透析；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF）測定純化產(chǎn)物的精確分子量。

將1 nM HSNs（介孔空心SiO2納米顆粒）先與1 μM MAL-NHS在pH 8.5的硼酸鹽緩沖液中均勻混合，并于室溫下緩慢攪拌2 h，凝膠柱（NAP-10，GE）除去未結(jié)合的小分子；再加入0.1 μM ZHER2:342繼續(xù)攪拌使親合體與納米藥物連接，用NAP-10凝膠柱純化，獲得HSNs-ZHER2:342納米顆粒。將熒光分子FITC與HSNs表面的氨基反應，獲得HSNs-FITC、HSNs-FITC&ZHER2并將它們分別與兩種不同的細胞株 SKOV3（HER2高表達細胞株）、SMMC7721（HER2低表達細胞株）孵育24 h，流式細胞分析比較納米顆粒進入不同細胞的數(shù)量差異。

圖2 重組親合體ZHER2:342的構(gòu)建及表達純化

1.4 Ni,As@SiO2-ZHER2:342靶向納米藥物的合成

通過斯托伯格法制備Ni,As@SiO2納米顆粒[9]。并采用交聯(lián)劑MAL-NHS將靶向親合體與納米藥物Ni,As@SiO2偶聯(lián)，形成表面帶有靶向親合體的納米藥物：Ni,As@ SiO2-ZHER2:342。具體方法同1.3。通過反應前后納米藥物表面zeta電位的改變判定靶向分子是否已經(jīng)連接到了 Ni, As@SiO2納米藥物的表面。將制備好的靶向納米藥物重懸于PBS緩沖液便于后續(xù)體內(nèi)外生物實驗。

1.5 納米藥物的細胞毒性檢測

SKOV3細胞用含10%胎牛血清(FBS,Hyclone)的Mc-Coy's 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，SMMC7721細胞用含10%胎牛血清(FBS,Hyclone)的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。MTT法研究新型納米藥物與卵巢癌細胞的特異靶向能力。測定不同藥物對癌細胞的IC50，分析不同藥物對癌細胞的毒性差異，驗證納米藥物的選擇性殺傷力。

1.6 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Student’s t-test，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HER2重組親合體ZHER2:342的構(gòu)建及表達純化

HER2重組親合體ZHER2:342基因片段由經(jīng)人工合成后連接到pET32a(+)表達型質(zhì)粒上，經(jīng)酶切檢測大小正確（圖2A、2B）。將重組質(zhì)粒pET32a-ZHER2:342導入大腸桿菌BL21 (DE3)中，得到可高效表達 ZHER2:342的重組菌BL21(DE3)-pET32a-ZHER2:342。重組菌經(jīng)IPTG誘導后可溶性表達融合蛋白Trx-ZHER2:342。

重組大腸桿菌BL21(DE3)-pET32a-ZHER2:342的表達產(chǎn)物含有6His-tag純化標簽，因此用快速蛋白質(zhì)液相層析系統(tǒng)（FPLC，GE）結(jié)合鎳柱親和層析可初步純化融合蛋白Trx-ZHER2:342，純化后的融合蛋白用腸激酶切除前端Trx蛋白，再經(jīng)凝膠分離得到最終產(chǎn)物：重組親合體 ZHER2:342（圖2C）。取少量ZHER2:342純化產(chǎn)物置于透析袋中，用蒸餾水透析；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF）測定產(chǎn)物的精確分子量。得出結(jié)果ZHER2:342重組親合體產(chǎn)物純度均為97.8%，回收效率1.0 mg/mL。取2 μL透析后樣品與1 μL基質(zhì)混勻后上樣，測得純化產(chǎn)物的分子量為7.648 kDa（圖2D），與ZHER2:342的理論值7.631 kDa，誤差0.2%，表明構(gòu)建的Cys-ZHER2:342-6His重組親合體正確。

2.2 重組親合體ZHER2:342靶向卵巢癌細胞的特異性分析

通過熒光分子FITC驗證合成的重組親合體 ZHER2:342是否具有特異的靶向能力。選擇 HER2低表達的SMMC7721細胞和HER2高表達的SKOV3細胞做對比，將這3種細胞分別與HSNs-FITC、HSNs-FITC&ZHER2納米粒子孵育24 h，結(jié)果顯示相同納米顆粒濃度和相同孵育時間下，與HSNs-FITC&ZHER2共同孵育的SKOV3細胞其熒光信號比SMMC7721的強，證明ZHER2:342對HER2高表達的癌細胞具有特異靶向能力（圖3）。

圖3 重組親合體ZHER2:342對HER2高表達的癌細胞有靶向能力。A：SMMC7721；B：SKOV3。

2.3 靶向納米藥物Ni,As@SiO2-ZHER2:342對卵巢癌細胞的毒性更強

將自主合成的Ni,As@SiO2納米藥物與ZHER2:342重組親合體分子通過交聯(lián)劑MAL-NHS偶聯(lián)（圖4A），用凝膠柱（NAP-10）純化，獲得靶向納米藥物Ni,As@SiO2-ZHER2:342，用動態(tài)光散射儀測定靶向修飾前后納米藥物的表面電位。實驗結(jié)果顯示：Ni,As@SiO2表面電位為30.2 mV，連接靶向分子后Ni,As@SiO2-ZHER2:342的表面電位降為5.2 mV。這是由于重組親合體的等電點PI為6.17，在水溶液中顯負電，因此將其連接到納米藥物上后，降低了其表面電位。靶向前后表面電位的差異證明重組親合體已經(jīng)成功連接到了納米顆粒上。

對合成的靶向納米藥物Ni,As@SiO2-ZHER2:342進行細胞毒性和特異靶向能力的分析。MTT法測定不同藥物對肝癌細胞SMMC7721和卵巢癌細胞SKOV3的細胞毒性 （24 h，圖4B、4C）。納米藥物Ni,As@SiO2和ZHER2:342靶向納米藥物Ni,As@SiO2-ZHER2:342對SKOV3的IC50分別為（10.42±1.85）、（6.25±1.21）μM，二者差異有統(tǒng)計學意義；而這兩種納米藥物對SMMC7721的IC50分別為（8.33±0.81）、（7.5±0.73）μM。重組親合體靶向修飾后的納米藥物比未修飾納米藥物對HER2高表達的卵巢癌細胞SKOV3具有更強的細胞毒性，而在HER2低表達的肝癌細胞SMMC7721中差異無統(tǒng)計學意義，說明ZHER2:342重組親合體對HER2過表達的腫瘤細胞具有特定的靶向效果，提高了藥物對其抗癌活性。

3 討論

圖4 靶向分子增強了納米藥物Ni,As@SiO2-ZHER2:342對卵巢癌SKOV3的細胞毒性

隨著現(xiàn)代納米生物醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展，基于納米技術(shù)的靶向性輸送體系有望實現(xiàn)傳統(tǒng)腫瘤診斷和治療方法所無法企及的高效、低毒的效果，成為腫瘤診斷和治療的有效手段之一。靶向分子是構(gòu)建靶向性輸送體系的重要因素，親合體的獨特優(yōu)勢決定了其可作為高親和力靶向分子連接到納米載體上，實現(xiàn)主動靶向[9-10]。

Rosik D等[7]采用微波輔助的固相肽合成方法（microwaveassisted solid-phase peptidesynthesis）合成HER2親合體，回收效率僅70%，而該研究對HER2親合體ZHER2:342的編碼序列進行重組優(yōu)化設(shè)計，在大腸桿菌中實現(xiàn)了其高效表達和純化，降低了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)量；并增加了其與納米載體的連接位點，使其易于實現(xiàn)納米載體的靶向功能化，便于探索其各種潛在應用，包括腫瘤靶向成像和靶向治療，為后續(xù)的開發(fā)研究奠定了重要基礎(chǔ)。該研究還表明將ZHER2:342重組親合體與砷納米藥物連接，在卵巢癌中可實現(xiàn)高的特定靶向能力。實驗結(jié)果與目前已有的研究相同，有報道將ZHER2:342親合體與不同SPECT顯影劑，在卵巢癌中均能實現(xiàn)腫瘤部位的特定顯影能力[9-11]。該研究所構(gòu)建的靶向納米藥物Ni,As@SiO2-ZHER2:342對卵巢癌細胞的毒性更強，這可能是由于ZHER2:342重組親合體與卵巢癌SKOV3表面的HER2具有高度親和力，靶向納米藥物富集在SMMC7721細胞表面，更易被細胞攝取進入胞內(nèi)溶酶體中，再緩慢釋放出As離子，進而有效殺死腫瘤細胞。以上研究結(jié)果表明構(gòu)建的重組親合體ZHER2:342可作為高親和力的靶向分子與目標分子、納米藥物或探針連接，實現(xiàn)對卵巢癌細胞的靶向功能化，后續(xù)將對所構(gòu)建的靶向納米藥物對HER2高表達的不同癌細胞都進行研究比較，以驗證重組親合體ZHER2:342的特定靶向性。

該文建立了重組親合體ZHER2:342的高效表達和純化方法，并證實了它的有效生物活性，節(jié)約了實驗成本，為其進一步的應用開發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化研究提供了保障。

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Construction,Expression and Purification and Functional Verification of HER2 Tumor Target Affinity Recombinant Protein

CHI Xiao-qin
Hepatobiliary Laboratory,Zhongshan Hospital Affiliated to Xiamen University,Xiamen,Fujian Province,361004 China

Objective To realize the high efficient expression and purification of recombinant affinity and test its activity.Methods 56 cases of patients with oophoroma admitted and treated in our hospital from January to December 2016 were selected and the HER2 affinity coding sequence was optimized and the connection site with nanocarrier was enhanced,and the expression and purification efficacies were improved and the recombinant expression product ZHER2:342was purified by the gel affinity chromatography and molecular weight was tested by the mass spectrum,and the purification products were used as the targeting molecules to connect the nanodrugs,and the targeting ability of it to the HER2 high-expression cells was tested.Results The pure of ZHER2:342recombinant affinity product was about 97.8%and the recycle efficacy was 1.0 mg/mL,and the molecular weight of purification products was 7.648 kDa, and the error was 0.2%compared with the theoretical value 7.631 kDa,which shows that the construction of Cys-ZHER2:342-6His recombinant affinity was correct,and the cell test showed that it could obviously improve the cytotoxicity of nano-drugs to breast cancer cells（P<0.01）,and it had a specific target to the tumor cells with high HER2 high-expression.Conclusion The construction of recombinant expression product of ZHER2:342is correct,which can realize the high-efficiency expression and purification and has a certain target to the tumor cells with high HER2 high-expression.

Tumor;Targeting molecule;Recombinant affinity;Expression and purification;Targeting ability analysis

R14

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.03.06

2017-06-02；

2017-06-20

本論文受廈門市科技計劃項目（3502Z20164024,3502Z20144019）；福建省自然科學基金青年科技人才創(chuàng)新項目（2013D014）。作者簡介：池小琴（1983-），福建三明人，碩士，助理研究員，研究方向：納米醫(yī)學。