大豆PM1蛋白抗氧化作用及提高酵母對銅耐受力

李承娜，高 陽，劉子明，劉國寶，鄭易之

深圳大學生命與海洋科學學院，深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東深圳518060

【生物工程/Bioengineering】

大豆PM1蛋白抗氧化作用及提高酵母對銅耐受力

李承娜，高 陽，劉子明，劉國寶，鄭易之

深圳大學生命與海洋科學學院，深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東深圳518060

Cu2+是植物生長必需的微量元素之一，但土壤中過量的Cu2+會對植物細胞產生毒害作用．大豆GmPM1蛋白屬于第4組的胚胎晚期富集(late embroygenesis abundant, LEA)蛋白，該組蛋白序列中富含組氨酸殘基. 研究大豆GmPM1蛋白在提高植物耐Cu2+脅迫方面的保護作用及其機理. 對大豆幼苗進行150 μmol/L CuSO4脅迫實驗. 結果表明，Cu2+脅迫會造成大豆幼苗葉片失水萎蔫；在脅迫3 h和24 h時，幼葉內GmPM1基因表達上調. 構建了酵母表達載體pYES2-GmPM1，轉化Cu2+敏感型酵母(ΔYAP1)得到重組菌ΔYAP1-GmPM1. 檢測結果表明，表達GmPM1蛋白的酵母重組子對Cu2+脅迫耐受力得到提高. 采用Cu抗壞血酸體系，在體外檢測出GmPM1及富含組氨酸殘基的GmPM1-C端蛋白具有清除羥基自由基能力. 研究表明，大豆GmPM1蛋白可通過其C端的組氨酸殘基結合過多的Cu2+，清除由Cu2+脅迫造成的細胞內產生的過量羥基自由基，提高植物及其細胞對Cu2+脅迫的耐受性.

大豆；GmPM1蛋白；組氨酸；Cu2+脅迫；清除羥基自由基；酵母重組子

胚胎晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant，LEA)是參與生物體抵抗非生物脅迫的一類重要蛋白質[1]. 根據 LEA 蛋白保守序列的特點，可將LEA蛋白分為7組. 大多數(shù)的LEA蛋白具有高度親水性和熱穩(wěn)定性[2]. LEA蛋白不僅在種子發(fā)育后期大量表達，也可被低溫、缺水、高鹽、滲透和重金屬等脅迫條件誘導表達[3]. 目前對第1～第3組LEA蛋白的保護功能已經進行了較多研究，但是對同樣在植物體內高表達的第4組的LEA蛋白(LEA4蛋白)研究較少，如棉花GossypiumhirsutumD-113蛋白在成熟的種子中的濃度可達286μmol/L[4].

有研究表明，經質量濃度為250g/L聚乙二醇(polyethylene glycol)處理12h的擬南芥幼苗體內的3個LEA4基因(AtLEA4-1、AtLEA4-2和AtLEA4-5)mRNA表達量大量增加[5]；與對照植株相比，AtLEA4-5基因的過表達植株在缺水處理時具有較高的相對含水量；當AtLEA4-5基因插入突變后，突變體幼苗及成苗對滲透脅迫及干旱的耐受力都有所減弱，可見，在抵抗非生物脅迫過程中LEA4蛋白可能有著重要功能[5]. 一些體外實驗也證明，擬南芥的AtLEA4-2和AtLEA4-5蛋白在凍融條件下可保護乳酸脫氫酶活性[6].

大豆GmPM1蛋白屬LEA4蛋白. 體外實驗證明，在干燥情況下GmPM1蛋白可結合海藻糖或蜜三糖；也能阻止干燥誘導的多聚賴氨酸聚集；且能起穩(wěn)定細胞膜的作用. 可見，在干燥脅迫下，GmPM1蛋白通過參與細胞內玻璃化結構的形成來保護蛋白質和細胞膜結構[7]. LEA4蛋白缺乏重復的基序，其N-端高度保守，C-端保守性略低. 計算軟件預測，N-端具有形成高比例兼性α-螺旋的潛能，而C-端則呈無規(guī)則卷曲結構[6]. 本實驗前期工作證明，GmPM1蛋白可結合Fe3+、Ni2+、Cu2+和Zn2+等離子，參與GmPM1同源寡聚體形成[8]. 然而，GmPM1蛋白能否提高植物對重金屬(如Cu2+)脅迫的耐受性，其作用機制還不清楚.

本研究首先檢測了Cu2+脅迫下大豆幼葉形態(tài)變化及GmPM1的相對表達量. 又檢驗了轉GmPM1基因的酵母突變體對Cu2+脅迫耐受力. 比較了GmPM1蛋白及其N端和C端蛋白清除羥基自由基的能力，并檢測結合Cu2+對GmPM1蛋白結構的影響. 證明了GmPM1蛋白在抵抗Cu2+脅迫中可能發(fā)揮重要保護功能.

1 材料方法

1.1植物材料、菌株和質粒

“白農六號”大豆(GlycinemaxL.)種子. 重組菌BL-Pet28a-GmPM1由本實驗室保存. 突變體菌株ΔYAP1是源于BY4742野生型酵母，購自Euroscarf(http://www.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/)， 菌株信息見表1. 酵母表達載體pYES2購自美國Invitrogen公司.

表1 酵母突變株及基因型

1.2方法

1.2.1大豆幼苗的培養(yǎng)及Cu2+脅迫處理

大豆種子萌發(fā)后移栽到霍格蘭氏營養(yǎng)液中培養(yǎng). 待生長至兩片真葉期時，用150μmol/LCuSO4進行脅迫處理，在不同時間點取幼葉進行液氮速凍.

1.2.2熒光實時定量PCR

大豆葉片RNA的提取及熒光實時定量聚合酶鏈式反應(quantitativereal-timepolymerasechainreaction,RT-PCR)參照Wang等[9]的實驗方法進行.GmPM1的正反向引物為GmPM1-F(GCTACAAACATTGGTGCTTCTG) 和GmPM1-R(GCTCCGCCTGGTTCATCT)，并以大豆actin基因為內參，對應的引物為actinF(GTGCACAATTGATGGACCAG)和actinR(GTGCACAATTGATGGACCAG). 用2-△△Ct方法進行RT-PCR數(shù)據分析.

1.2.3酵母表達載體的構建與轉化

根據GmPM1基因序列設計引物Y-PM1F(GATAGAGCTCATGCAGGGAGGAAAGAAAGCG)和Y-PM1R(CCGGAATTCTTAAGTACCCCCAGTCCCATA)，以重組質粒pET28a-GmPM1為模板進行PCR擴增. 將擴增的PCR片段進行HindIII和SacI酶切，再連接至酵母表達載體pYES2-CT. 采用醋酸鋰法，將空載體pYES2-CT和重組表達載體pYES2-GmPM1轉化Cu2+敏感型酵母 (ΔYAP1)， 獲得重組酵母ΔYAP1-pYES2和ΔYAP1-GmPM1.

1.2.4Cu2+脅迫固體平板酵母生長的測定

挑取對照菌ΔYAP1-pYES2和重組菌ΔYAP1-GmPM1的單克隆，在SCR(syntheticcompletemediumcontainingraffinose)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3d，按體積比為1∶50接種到誘導液體培養(yǎng)基(以20g/L半乳糖為碳源的SC-U(syntheticcompletemediumlackofura)培養(yǎng)基)中，置于200r/min30℃培養(yǎng)24h. 待菌液長至對數(shù)生長期，即光密度值D(600)為0.6～1.2，將其稀釋至D(600)=0.6， 再以10倍為梯度進行稀釋. 取稀釋的菌液4μL滴至含不同濃度CuSO4的SC-U半乳糖固體培養(yǎng)基上. 于28℃培養(yǎng)2～3d，并拍照記錄.

1.2.5羥基自由基的清除

參照Hara等[10]的實驗方法，采用Cu2+抗壞血酸鈉體系檢測羥基自由基活性.

1.2.6圓二色譜(circulardichroism,CD)測定

配置500μL的樣品溶液：1mmol/LHepes(pH=7.0)，50mmol/LNa2SO4，10μmol/L的GmPM1、GmPM1-N或GmPM1-C蛋白，不同濃度(0、10、50和100μmol/L)的CuSO4溶液.25℃孵育10min，用J810圓二色譜儀(日本JASCO公司)測定. 用OriginPro8.0處理數(shù)據，并根據式(1)計算PII結構(polyprolineIItypehelicalstructure)含量[11].

[θ]=fH[θ]H+fⅡ[θ]II+fU[θ]U

(1)

其中， [θ]為特定溫度下測定的222nm處的橢圓率；fH、fⅡ和fU分別為α-helix、PII和unordered的百分含量； [θ]H、[θ]II和[θ]U分別為α-helix、PII和unordered在222nm處的摩爾橢圓率常數(shù)，分別為-30000、+9580和-5560deg·cm2·dmol-1.

2 結果與分析

2.1CuSO4脅迫下大豆幼苗形態(tài)及GmPM1基因表達的變化

2.1.1 CuSO4脅迫下大豆幼苗表型變化

大豆種子發(fā)芽后，移到改良的霍格蘭氏營養(yǎng)液中. 兩片真葉期時，對大豆幼苗進行150 μmol/L CuSO4處理，觀察大豆幼葉表型變化(圖1). 當CuSO4脅迫0 h時，真葉堅挺伸展；脅迫3 h時，葉片有些下垂；脅迫6 h時葉片再次開始堅挺；脅迫24 h時幼苗葉片基本上已恢復堅挺，但葉邊緣開始卷曲；脅迫48～72 h時葉片邊緣已經萎蔫，且葉片脫水嚴重.

圖1 CuSO4脅迫下大豆幼苗表型變化Fig.1 Phenotype of soybean seedlings under CuSO4 stress

2.1.2 CuSO4脅迫大豆幼苗葉中GmPM1基因的相對表達量

采用熒光實時定量RT-PCR檢測Cu2+脅迫后大豆幼苗GmPM1基因的表達水平(圖2). 結果表明，Cu2+脅迫3 h后的幼葉GmPM1基因表達量上升；在脅迫6～12 h后表達量下降；脅迫24 h后再次上升；脅迫48～72 h后該基因相對表達量再次下降. 可見，Cu2+脅迫后，GmPM1基因的相對表達量與葉表型變化有一定對應關系.

圖2 大豆幼葉中GmPM1基因的相對表達量Fig.2 Relative transcript level of GmPM1 gene in soybean seedling leaves

2.2GmPM1蛋白表達提高Cu2+敏感型酵母(ΔYAP1)對Cu2+耐受力

將空載體pYES2-CT和重組表達載體 pYES2-GmPM1轉化Cu2+敏感型酵母(ΔYAP1). 提取ΔYAP1-pYES2和ΔYAP1-GmPM1重組菌的可溶性蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)，結果如圖3. 從中可見，與對照菌相比，ΔYAP1-GmPM1重組酵母可表達一特異條帶(21 ku, 1 u =1 Da)，如圖3箭頭所示. 該條帶與文獻[8]報告的大腸桿菌表達的GmPM1蛋白大小一致，表明GmPM1能在重組酵母中正常表達.

圖3 GmPM1蛋白在重組酵母中表達Fig.3 Expression of GmPM1 protein in the recombinant yeast

將ΔYAP1-pYES2和ΔYAP1-GmPM1重組菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，再分別接種到正常固體培養(yǎng)基及含80和100 μmol/L CuSO4的脅迫培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～3 d. 結果表明，在正常培養(yǎng)基上，對照菌和重組菌生長狀況接近. 但在80和100 μmol/L CuSO4培養(yǎng)基上，ΔYAP1-GmPM1重組菌長勢明顯優(yōu)于轉空載體對照菌，意味著GmPM1蛋白表達可提高ΔYAP1酵母對Cu2+脅迫耐受力(圖4).

圖4 對照菌ΔYAP1-pYES2和重組菌ΔYAP1-GmPM1的生長情況Fig.4 Growth situation of ΔYAP1-pYES2 and ΔYAP1-GmPM1

2.3GmPM1、GmPM1-N和GmPM1-C蛋白具有清除羥基自由基的能力

參照Hara等[10]的實驗方法，檢測GmPM1蛋白及其N端和C端蛋白清除Cu2+產生的羥基自由基的能力. 用熒光檢測劑香豆素-3-羧酸來檢測羥基自由基量的變化，在反應初始階段熒光值會上升，但隨時間延長熒光值將會保持不變. 以反應30 min時的熒光值為縱坐標，蛋白濃度為橫坐標，做出擬合曲線，圖5(a)至(d)分別是加入牛血清蛋白(albumin from bovine serum，BSA；對照)、GmPM1、GmPM1-N和GmPM1-C后熒光值變化的擬合曲線. 由圖5(a)至(d)可知，樣品的熒光值隨蛋白濃度增加而降低，表明GmPM1、GmPM1-N和GmPM1-C蛋白清除羥基自由基能力有劑量依賴性.

圖5 BSA、GmPM1、GmPM1-N和GmPM1-C蛋白清除羥基自由基能力Fig.5 Activities of scavenging hydroxyl radicals of BSA, GmPM1, GmPM1-N and GmPM1-C

以熒光強度達到最大值的50%對應的蛋白濃度(inhibitory concentration 50%, IC50)表示羥基自由基清除能力，如圖5(e)，即IC50值越小，該蛋白清除羥自由基能力越強，以未加入蛋白樣品時熒光值為最大熒光強度. 由圖5(e)知，BSA、GmPM1、GmPM1-N 和GmPM1-C的IC50分別為1.34、0.66、4.93和1.37 μmol/L，表明GmPM1蛋白及其短肽蛋白的清除羥基自由基能力順序為：GmPM1>GmPM1-C> GmPM1-N蛋白.

2.4Cu2+對GmPM1、GmPM1-N和GmPM1-C蛋白結構變化的影響

GmPM1蛋白屬固有無序蛋白. 在正常生理狀態(tài)下的GmPM1主要為無序結構狀態(tài). 本研究以CD光譜法檢測在不同Cu2+濃度下，GmPM1、GmPM1-N和GmPM1-C蛋白的二級結構變化.c(Cu2+)=0 μmol/L時，GmPM1、GmPM1-N和GmPM1-C的CD譜在198 nm附近存在一負峰，這是典型的無規(guī)則卷曲結構，如圖6(a)至(c). 加入高濃度Cu2+(10、50和100 μmol/L)后，GmPM1和GmPM1-N的CD圖譜未發(fā)現(xiàn)明顯改變. 與其不同，GmPM1-C的CD圖譜在205 nm處出現(xiàn)一等漫射點，如圖6(c)箭頭處，這為典型的多聚脯氨酸II型螺旋結構特征[12].

繪制GmPM1-C蛋白CD差異譜，如圖6(d)，即在190～210 nm有1個負峰，210 ～230 nm有1個正峰，且在215 nm處差異達最大，進一步證實GmPM1-C蛋白存在PII結構[12]. 利用公式計算PII結構含量[11]. 加入100 μmol/L Cu2+后，GmPM1-C蛋白的PII結構為從27%降低到18%. 可見，高濃度的Cu2+，可直接影響GmPM1-C蛋白的二級結構及其構象.

3 討 論

Cu2+是植物正常生長發(fā)育所必須的重要微量元素之一，但是，土壤中Cu2+過量存在會嚴重影響植物正常生長發(fā)育，甚至導致植物死亡. González-mendoza等[13]研究發(fā)現(xiàn)，銅脅迫會使亮葉白骨壤(Avicenniagerminans)葉的氣孔導度及葉綠素含量降低，從而減弱凈光合作用. Cu2+還可增加活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的產生，或降低植物細胞內抗氧化酶活性，導致ROS過量積累，造成氧化傷害[14]. 在長期進化中，植物體中產生了多種抵抗銅離子毒害的機制，如形成共生菌根和誘導表達金屬轉運蛋白，抗逆蛋白及植物絡合素合酶等[15]. 如香蕉MpDhn12蛋白(LEA2)在體外可結合Cu2+，過表達后可提高Cu2+敏感酵母Δsod1， 表明MpDhn12蛋白可能具有抗氧化功能[16].

圖6 GmPM1、GmPM1-N和GmPM1-C的CD圖譜Fig.6 CD spectrum of GmPM1, GmPM1-N and GmPM1-C

本研究表明，在Cu2+脅迫3 h和24 h時，大豆幼苗葉中GmPM1基因表達量兩次上升，意味著GmPM1基因的誘導表達可能存在快速應答和慢速應答，這與在高Cu2+脅迫下的植物葉片萎蔫反應有一定對應關系. 結合前人的有關報告[17]，筆者認為Cu2+脅迫3 h時GmPM1基因表達量第1次上升應為“快速應答”，為植物對周圍環(huán)境變化的應激性反應；而Cu2+脅迫24 h時GmPM1基因表達量第2次上升應為“慢速應答”，是對脅迫的耐受性，即在較長脅迫下植物體產生的適應性反應.

為準確地鑒定外源基因的功能，可利用酵母突變體及功能互補實驗.ΔYAP1是釀酒酵母YAP1基因的缺失株.YAP1基因可編碼堿性亮氨酸拉鏈類(basic leucine zipper, bZIP)轉錄因子，至少參與對32個氧化脅迫誘導基因的表達調控. 若YAP1基因突變，酵母突變株對氧化脅迫的敏感性將增強[18]. 本研究將GmPM1基因轉化ΔYAP1酵母后， GmPM1重組酵母對Cu2+脅迫耐受性提高. 還進一步證明GmPM1蛋白清除羥基自由基能力明顯高于GmPM1-C. GmPM1蛋白含10個組氨酸殘基，主要分布在其C端. 可見，大豆GmPM1蛋白清除羥基自由基能力與蛋白序列中組氨酸數(shù)目及蛋白的長度相關. 筆者推測，高濃度Cu2+會造成酵母細胞的離子毒害及氧化傷害. 酵母重組子表達的GmPM1蛋白可結合細胞內過多的Cu2+，并可清除過多的羥基自由基，從而減少Cu2+脅迫造成的過氧化傷害，這可能是GmPM1蛋白保護酵母細胞的機制之一.

多聚脯氨酸II型螺旋結構，即PII結構[19]. 在水溶液中，PII結構與自由卷曲間處于動態(tài)平衡. 文獻[20]研究指出，PII結構常位于蛋白質的表面，可作為固有無序蛋白分子間互作的位點. 部分LEA蛋白也存在PII結構. 如點突變使大豆Em蛋白中的PII結構含量降低時，在凍融條件下Em蛋白保護乳酸脫氫酶活性也降低[21]. 鹽芥(Thellungiellasalsuginea)的TsDHN-1和TsDHN-2蛋白在磷酸化時PII結構增加；在溫度升高時PII結構降低. 并推測PII結構的改變會影響蛋白與靶分子的結合[22]. 本研究結果顯示，與Cu2+結合后的大豆GmPM1蛋白的C端發(fā)生二級結構改變，反映在PII結構的含量減少. 由此推測，GmPM1蛋白通過C-端與Cu2+結合后，可能會使其二級結構或三維構象發(fā)生改變，這種結構的改變也可能影響GmPM1蛋白的功能.

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【中文責編：晨兮；英文責編：艾琳】

CharacteristicsofantioxidantactivityofsoybeanPM1proteinandenhancementoftoleranceofrecombinantyeasttocopperstress

LiChengna,GaoYang,LiuZiming,LiuGuobao,andZhengYizhi

CollegeofLifeSciencesandOceanography,ShenzhenUniversity,ShenzhenKeyLaboratoryofMicrobiologyandGeneEngineering,Shenzhen518060,GuangdongProvince,P.R.China

Cu2+is an essential micronutrient for plant growth, but it is toxic when plant growth under excess copper stress. Soybean GmPM1protein belongs to late embryogenesis abundant (LEA) group4(LEA4) proteins, which has a high proportion of histidine residues in the protein sequence. Firstly, we investigate the protective function and mechanisms of GmPM1protein in plant under Cu2+stress. The leaves of soybean seedling are withered under150μmol/L CuSO4stress, and at the meantime the expression ofGmPM1gene in the young leaves was up-regulated in3h and24h of the stress. Secondly, the yeast expression plasmid of pYES2-GmPM1is constructed and then transformed into the copper-sensitive yeast mutantΔYAP1to create recombinants ofΔYAP1-GmPM1. The recombinant yeast expressing GmPM1protein could enhance the tolerance to Cu2+stress. Then, the activities of scavenging hydroxyl radicals of GmPM1and GmPM1-C protein in vitro are determined by using Cu-ascorbic acid system, which is rich in histidine residual in their sequence. The results show that GmPM1could chelate Cu2+through histidine residual in the C-terminal of GmPM1protein and exert the activity of scavenge hydroxyl radicals, thus could improve the tolerance of plants to Cu2+stress.

soybean; GmPM1protein; histidine; Cu2+stress; scavenging hydroxyl radicals; recombinant yeast

2017-05-24；Accepted：2017-06-05

Professor Zheng Yizhi. E-mail：yzzheng@szu.edu.cn

Q 943.2；Q 71

：Adoi：10.3724/SP.J.1249.2017.05457

Foundation：National Natural Science Foundation of China(31370289)

：Li Chengna, Gao Yang, Liu Ziming, et al. Characteristics of antioxidant activity of soybean PM1 protein and enhancement of tolerance of recombinant yeast to copper stress[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(5): 457-463.(in Chinese)

國家自然科學基金資助項目(31370289)

李承娜(1991—)，女，深圳大學碩士研究生. 研究方向:植物抗逆分子生物學.E-mail: 1324471270@qq.com

引文：李承娜，高 陽，劉子明，大豆PM1蛋白抗氧化作用及提高酵母對銅耐受力[J]. 深圳大學學報理工版，2017，34(5)：457-463.