大鼠骨折模型局部注射C型鈉尿肽(CNP)對(duì)骨折愈合的影響

宋正鑫 祝騰蛟 劉冰川 周 方 田 耘

(北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科，北京 100083)

·實(shí)驗(yàn)研究·

大鼠骨折模型局部注射C型鈉尿肽(CNP)對(duì)骨折愈合的影響

宋正鑫 祝騰蛟 劉冰川 周 方 田 耘*

(北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科，北京 100083)

目的探討局部注射C型鈉尿肽(C-type natriuretic peptide，CNP)對(duì)于大鼠骨折的愈合是否具有促進(jìn)作用。方法36只12周齡雄性SD大鼠，建立大鼠股骨干骨折模型，隨機(jī)分為3組，每組12只。組1大鼠在斷骨后，在骨折處局部注射溶于1 ml凝膠中的25 μg CNP；組2大鼠在斷骨后，在骨折處局部注射凝膠1 ml；組3大鼠在斷骨后，在骨折處局部注射醫(yī)用生理鹽水1 ml。在建模后每周對(duì)大鼠進(jìn)行X線掃描檢測(cè)。第3周時(shí)，隨機(jī)從每組中各選取7只大鼠，在接受X線掃描后處死，股骨接受Micro-CT掃描檢測(cè)。每組剩余的5只大鼠在第4周接受X線掃描后處死，股骨接受Micro-CT掃描檢測(cè)。收集建模后第3、4周股骨及骨折部位樣本進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè)。結(jié)果X線顯示組1在術(shù)后第3、4周均出現(xiàn)大鼠骨折部位骨橋的形成，組2、3所有大鼠直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束也未出現(xiàn)骨折端有骨橋形成。Micro-CT結(jié)果顯示術(shù)后第3周組1骨折端骨痂體積為(187.655±62.864)mm3，高于組2(137.703±52.592)mm3和組3(176.493±75.193)mm3，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.167，P=0.334)；術(shù)后第4周組1、2、3的骨折端骨痂體積分別為(242.853±139.252)、(242.460±64.844)、(226.274±77.418)mm3，3組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.045，P=0.956)。組1第3周時(shí)4只大鼠達(dá)到骨折愈合標(biāo)準(zhǔn)，組2、3未出現(xiàn)骨折愈合大鼠；組1第 4周時(shí)4只大鼠達(dá)到骨折愈合標(biāo)準(zhǔn)，組2、3未出現(xiàn)骨折愈合大鼠。生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示第3周時(shí)，組1中能夠完成生物力學(xué)檢測(cè)的大鼠為4只，組2為0只，組3為1只；第4周時(shí)，組1中能夠完成生物力學(xué)檢測(cè)的大鼠為4只，組2為0只，組3為0只。結(jié)論在骨折局部注射CNP對(duì)SD大鼠骨折的愈合有一定的促進(jìn)作用。

骨折愈合； C型鈉尿鈦； 動(dòng)物模型

骨折延遲愈合或不愈合一直是困擾骨科醫(yī)生的一個(gè)常見難題，其中如何恢復(fù)骨折端的血供是治療的關(guān)鍵之一。因此，許多醫(yī)生尋找各種方法來(lái)解決這一問(wèn)題，其中最被期待的是骨髓干細(xì)胞的移植，但基于細(xì)胞方法的研究結(jié)果并不滿意，出現(xiàn)了一些臨床并發(fā)癥[1]。因此，找到一種能夠安全有效促進(jìn)血管形成的方法顯得非常迫切。C型鈉尿肽(C-type natriuretic peptide，CNP)有助于增加血管內(nèi)皮細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)速率。既往的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明CNP可以通過(guò)激活跟NO同樣的離子通道，促進(jìn)蛋白激酶K從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)[2～7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明CNP可以促進(jìn)血管生成[8]。我們推測(cè)CNP可促進(jìn)血管形成的這一特點(diǎn)可能會(huì)對(duì)骨折的愈合有一定的促進(jìn)作用。本研究通過(guò)建立大鼠股骨干骨折模型，檢測(cè)骨折愈合早期的各項(xiàng)指標(biāo)，評(píng)估局部注射CNP對(duì)骨折愈合是否具有促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12周齡雄性Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)36只[動(dòng)物批號(hào)：SCXK(京)2012-0001]，體重400～500 g。大鼠飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物部，飼養(yǎng)濕度：30%～40%，飼養(yǎng)溫度：21～23 °C，光照周期：明12 h/暗12 h。標(biāo)準(zhǔn)固體飼料飼養(yǎng)，單籠單只飼養(yǎng)，每日更換一次墊料。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究和操作都經(jīng)過(guò)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物管理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號(hào)：LA2016007)。

1.2 骨折模型

取12周齡的大鼠，腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，注射量為3 ml/kg 體重。待大鼠完全麻醉后，備皮、消毒，于大鼠單側(cè)股骨關(guān)節(jié)處行0.5 cm縱行切口，并分離附著于骨骼上的筋膜、肌肉，暴露出股骨，于股骨干中遠(yuǎn)1/3處以1 mm后擺鋸截?cái)嗪?，立即使用醫(yī)用生理鹽水沖洗骨折斷面，并用克氏針逆行固定骨折，逐層縫合切口，最終完成大鼠股骨干骨折模型的建立。36只SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組12只。組1大鼠在斷骨后，在骨折處局部注射溶于1 ml凝膠中的25 μg CNP(美國(guó)Sigma公司)；組2大鼠在斷骨后，在骨折處局部注射1 ml凝膠(中國(guó)海貍生物科技有限公司)；組3大鼠在斷骨后，在骨折處注射1 ml醫(yī)用生理鹽水(圖1)。術(shù)后清潔環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，室溫22～24 °C，濕度30%～40%，定期紫外線消毒與排風(fēng)，常規(guī)給水及飲食，大鼠可自由活動(dòng)。在飼養(yǎng)過(guò)程中，大鼠每周均接受X線掃描檢測(cè)。第3周時(shí)，隨機(jī)從每組中各選取7只大鼠，在接受X線掃描后處死，股骨接受Micro-CT掃描檢測(cè)。剩余5只大鼠在第4周接受X線掃描后處死，股骨接受Micro-CT掃描檢測(cè)。對(duì)收集的股骨標(biāo)本進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè)。所有的手術(shù)操作由同一組手術(shù)醫(yī)生完成。

1.3 X線掃描

建模完成后，分別于術(shù)后即刻、術(shù)后1，2，3，4周腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，X線掃描儀對(duì)大鼠股骨進(jìn)行掃描觀察骨折端是否出現(xiàn)橋接骨痂來(lái)評(píng)估骨折愈合過(guò)程。整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)程由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的骨科醫(yī)師完成，2名操作人員并不了解研究目的及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.4 Micro-CT掃描

收集大鼠雙側(cè)股骨，取材后固定于70%乙醇1 d以上，使用Micro-CT系統(tǒng)(Inveon Scanners, 德國(guó)西門子公司)掃描樣品，通過(guò)Micro-CT的分析軟件(Inveon Research Workplace, 德國(guó)西門子公司)計(jì)算骨折端骨痂組織總量。通過(guò)Micro-CT評(píng)估橋接的骨痂，以至少2層皮質(zhì)上看到骨折端的連續(xù)骨痂為愈合的標(biāo)準(zhǔn)[9]。整個(gè)操作由2名不了解研究目的及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的骨科醫(yī)師完成。

1.5 生物力學(xué)檢測(cè)

收集實(shí)驗(yàn)大鼠雙側(cè)股骨，剔除軟組織，拔除內(nèi)固定克氏針。采用萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(Bionix，MTS System Corporation，美國(guó))行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，中央垂直(股骨與載荷成90°)施加載荷，速率2 mm/min，以確定樣品的最大彎曲破裂載荷(圖2)。股骨標(biāo)本單位應(yīng)變所承受的壓力使用抗彎剛度(EI)表示，計(jì)算每只實(shí)驗(yàn)大鼠造模股骨與對(duì)側(cè)股骨EI的比值。

1.6 觀察指標(biāo)

X線掃描評(píng)估骨折端的骨痂密度及是否形成骨折端的橋接；Micro-CT進(jìn)一步評(píng)估形成骨折端橋接的皮質(zhì)層數(shù)，確定骨折是否達(dá)到愈合的標(biāo)準(zhǔn)，并計(jì)算骨折端的骨痂體積；生物力學(xué)檢測(cè)大鼠股骨標(biāo)本的最大彎曲破裂載荷、抗彎剛度(EI)，并計(jì)算與對(duì)側(cè)股骨EI的比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 骨折端橋接骨痂

X線掃描顯示，在建模后第1、2周時(shí)，各組大鼠的骨折部位均未出現(xiàn)連接骨折兩端的骨橋。第3周時(shí)，組1大鼠的骨折部位逐漸有骨痂出現(xiàn)，并形成骨折端的橋接(12/12)，在這一階段，另外2組大鼠的骨折端仍相互分離(圖3)，均未見大鼠出現(xiàn)骨折端的橋接骨痂(0/12)。建模后第4周，組1大鼠骨折部位骨痂密度明顯升高(圖4)，裸眼觀察可以清楚區(qū)分第3周和第4周骨折部位骨痂密度的差異(圖3、4)。第4周時(shí)，組1大鼠的骨折線已經(jīng)模糊，骨折端的橋接骨痂明顯(5/5)。與組1相比，其他2組大鼠骨折部位雖然也顯示骨痂的生長(zhǎng)，但直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，組2、3大鼠骨折斷端的間隙仍然清晰可見(圖4)，仍未見骨折端的橋接骨痂(0/5)。

2.2 橋梁骨皮質(zhì)層數(shù)及骨折端局部的骨痂體積

Micro-CT掃描結(jié)果顯示，從第3周開始，組1大鼠骨折斷端開始出現(xiàn)新生骨的連接，在組2、3中，模型大鼠骨折間隙仍十分清晰(圖5)。第4周組1大鼠新生的非層板骨已經(jīng)重塑為松質(zhì)骨/密質(zhì)骨，另外2組大鼠的骨折斷端仍相互分離(圖6)。定量分析結(jié)果顯示組1大鼠第3、4周CT片上的橋梁骨皮質(zhì)層數(shù)明顯多于組2、3(表1、2)。此外，組1大鼠的局部骨痂體積在第3、4周均較其余2組高，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性差異(表3)。

2.3 股骨標(biāo)本的極限載荷及EI比值

通過(guò)生物力學(xué)檢測(cè)得出股骨標(biāo)本的極限載荷及EI比值。每組12只大鼠中，7只大鼠在第3周時(shí)處死，股骨接受Micro-CT掃描檢測(cè)。剩余的5只大鼠在第4周處死，股骨接受Micro-CT掃描檢測(cè)。由于部分股骨在提取軟組織之后骨折端未愈合使斷端分離，故無(wú)法接受生物力學(xué)檢測(cè)，最終結(jié)果以0表示。圖7為生物力學(xué)檢測(cè)位移與壓力關(guān)系示意圖。第3周時(shí)，組1能夠完成生物力學(xué)檢測(cè)的大鼠為4只，組2為0只，組3為1只；第4周時(shí)，組1中能夠完成生物力學(xué)檢測(cè)的大鼠為4只，組2為0只，組3為0只；測(cè)得的極限載荷及EI比值結(jié)果見表4。

表1 實(shí)驗(yàn)第3周時(shí)骨折部位骨痂處橋梁骨皮質(zhì)數(shù)量與骨折愈合大鼠數(shù)量(n=7)

表2 實(shí)驗(yàn)第4周時(shí)骨折部位骨痂處橋梁骨皮質(zhì)數(shù)量與骨折愈合大鼠數(shù)量(n=5)

表3 Micro-CT 掃描計(jì)算骨折端局部的骨痂體積 mm3

3 討論

美國(guó)每年約有超過(guò)800萬(wàn)人次骨折事件的發(fā)生[10]。盡管大部分患者的骨折經(jīng)過(guò)積極的治療最終會(huì)獲得愈合，但是仍有5%～10%的患者會(huì)出現(xiàn)骨折的延遲愈合或不愈合，這一部分患者的日常生活會(huì)受到嚴(yán)重的影響[11，12]。在骨折延遲愈合或不愈合的事件中，最讓臨床醫(yī)生感到懊惱的是即使骨折的治療過(guò)程非常嚴(yán)謹(jǐn)，包括滿意的骨折復(fù)位、穩(wěn)定的內(nèi)固定、盡可能多地保留骨折局部的血供和及時(shí)的康復(fù)治療，但因?yàn)楣钦郯l(fā)生時(shí)嚴(yán)重創(chuàng)傷造成的血供毀滅性破壞，使骨折治療的結(jié)果仍不滿意，而且骨科醫(yī)生在后續(xù)治療中也常常束手無(wú)策。

表4 生物力學(xué)檢測(cè)大鼠股骨標(biāo)本的極限載荷與EI比值

*組1第3、4周完成生物力學(xué)檢測(cè)的大鼠均為4只，數(shù)據(jù)用中位數(shù)(最小值～最大值)表示；**組3第3周完成生物力學(xué)檢測(cè)的大鼠為1只

在部分骨折延遲愈合或不愈合的患者中，有時(shí)找不到明確的原因，但在大多數(shù)情況下，我們還是能找到一些不利因素，比如較大的骨缺損、骨折局部的血供不足、嚴(yán)重的軟組織損傷，以及感染等。血供較少是骨折部位新生骨形成不足并最終導(dǎo)致骨折延遲愈合或不愈合的首要原因[13，14]。為此，我們提出在骨折端局部注射CNP以促進(jìn)血管生成來(lái)觀察其是否能夠促進(jìn)骨折愈合的新方法。

圖1 大鼠股骨骨折模型示意圖 圖2 生物力學(xué)檢測(cè)裝置及三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)示意圖 圖3 實(shí)驗(yàn)第3周時(shí)X線掃描3A.組1(接受CNP局部注射的大鼠)大鼠骨折部位逐漸開始愈合;3B、C.組2、3大鼠的骨折端仍相互分離 圖4 實(shí)驗(yàn)第4周時(shí)X線掃描 4A.組1大鼠的骨折已經(jīng)愈合，骨折線逐漸變得模糊;4B、C.組2、3大鼠骨折部位雖然也出現(xiàn)骨痂的生長(zhǎng)，但骨折部位的間隙仍然清晰可見 圖5 實(shí)驗(yàn)第3周Micro-CT掃描 5A.組1大鼠骨折斷端開始出現(xiàn)新生的骨連接；5B、C.組2、3大鼠骨折間隙仍十分清晰 圖6 實(shí)驗(yàn)第4周時(shí)Micro-CT掃描 6A.組1大鼠骨折端新生的非板層骨已經(jīng)重塑為皮質(zhì)骨;6B、C.組2、3大鼠的骨折斷端仍相互分離 圖7 生物力學(xué)檢測(cè)中，位移與壓力關(guān)系示意圖

骨折的愈合方式有2種，包括直接愈合和間接愈合。直接愈合是通過(guò)膜內(nèi)成骨來(lái)實(shí)現(xiàn)的，愈合過(guò)程中看不到骨痂形成及骨膜反應(yīng)，這種愈合方式非常少見。間接愈合是軟骨內(nèi)成骨的過(guò)程，包括血腫機(jī)化、局部炎癥反應(yīng)、新生血管長(zhǎng)入、軟骨形成、骨重建與塑型[15]。盡管這2種愈合過(guò)程是不一樣的，但新生血管的形成是其先決條件[16～19]。本研究通過(guò)建立大鼠股骨骨折模型，髓內(nèi)克氏針固定模擬臨床間接愈合的過(guò)程，觀察局部注射CNP對(duì)于骨折愈合是否具有促進(jìn)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示局部注射CNP的組1比其余2個(gè)對(duì)照組術(shù)后第1、2周時(shí)在X線片上沒(méi)有顯示出骨折愈合的優(yōu)勢(shì)，但是術(shù)后第3、4周的X線片顯示促進(jìn)了骨折端骨痂的橋接，顯示出一定的促進(jìn)骨折愈合的優(yōu)勢(shì)。進(jìn)一步Micro-CT的分析顯示，在局部骨折端骨痂體積上，組1在術(shù)后第3、4周均較其余2組稍高，盡管在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異(F=1.167,P=0.334;F=0.045,P=0.956)。更為重要的是，Micro-CT分析結(jié)果顯示組1術(shù)后第3、4周骨折愈合(均為4只)明顯多于其余2個(gè)對(duì)照組(均為0只)。X線和Micro-CT的結(jié)果顯示組1在影像學(xué)上能夠顯著促進(jìn)骨折愈合。此外，生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示CNP治療組顯著提高斷端骨痂的最大極限載荷和抗彎強(qiáng)度，意味著CNP治療不僅在骨折形態(tài)上促進(jìn)骨折的愈合，同時(shí)在力學(xué)性能上也能更快地恢復(fù)大鼠股骨的功能。本研究結(jié)果表明在大鼠骨折模型局部注射CNP不僅能夠促進(jìn)骨折在形態(tài)上愈合也能促進(jìn)功能上的恢復(fù)，其中原因很有可能是其促進(jìn)血管的形成。CNP的局部注射促進(jìn)了骨折端局部血供的形成，為骨折愈合提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)提供能夠分化成骨細(xì)胞的骨髓干細(xì)胞，更多新生血管的形成對(duì)新骨的形成起到了積極地作用。血管形成與骨形成二者之間的相互作用促進(jìn)了骨的修復(fù)[20，21]。

本方法操作簡(jiǎn)便、治療侵入性小，由于CNP促進(jìn)骨折愈合的分子機(jī)制及在骨折端促進(jìn)血管形成的具體原理仍不清楚，應(yīng)用CNP來(lái)促進(jìn)骨折愈合仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。本研究結(jié)果顯示局部注射CNP在大鼠骨折模型的愈合中有一定促進(jìn)作用，為今后的骨折治療提供一種新的治療方法。

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(修回日期：2017-06-26)

(責(zé)任編輯：李賀瓊)

TheInfluenceofLocalInjectionofC-typeNatriureticPeptideonFractureHealinginaRatModel

SongZhengxin,ZhuTengjiao,LiuBingchuan,etal.

DepartmentofOrthopaedics,PekingUniversityThirdHospital,Beijing100083,China

Correspondingauthor:TianYun,E-mail:tianyunbj@sina.com

ObjectiveTo evaluate the promoting effect of C-type natriuretic peptide (CNP) on facture healing in a rat model.MethodsA total of 36 Sprague-Dawley (SD) male rats were employed for induction of femoral fracture model in three randomly divided groups (12 for each group). Rats in Group 1

local injection of 1 ml gel containing 25 μg of CNP, rats in Group 2 were treated with local injection of 1 ml of gel, and rats in Group 3 were provided with 1 ml of saline solution at the same position. The X-ray was performed for each group after fracture at each week (0, 1st, 2nd, 3rd, and 4th weeks). Furthermore, legs of 7 rats in each group were harvested in the 3rd week and the remaining 5 rats in each group were obtained in the 4th week. The progression of fracture healing of each specimen was assessed by micro-CT. Mechanical tests of the femora and fractures were carried out at the 3rd and 4th weeks.ResultsThe X-ray showed that some rats of the Group 1 appeared the formation of bone bridge at the site of fracture at 3rd and 4th weeks after surgery, while the Group 2 and 3 did not appear bone bridge at the end of experiment in all rats. The results of micro-CT showed that the volume of callus in the Group 1 at the fracture site at 3rd week was (187.655±62.864) mm3, which was higher than that in the Group 2 (137.703±52.592) mm3and Group 3 (176.493±75.193) mm3, but the differences were not statistically significant (F=1.167,P=0.334). At the 4th week, the volumes of callus in the Group 1, 2, and 3 were (242.853±139.252) mm3, (242.460±64.844) mm3, and (226.274±77.418) mm3, respectively, and there were no significant differences among the 3 groups (F=0.045,P=0.956). Four rats in the Group 1 reached the standard of fracture healing at the 3rd week, but none in the Group 2 or Group 3. At the 4th week, there were another 4 rats reaching the standard of fracture healing in the Group 1, but none in the Group 2 or 3. The biomechanical test results showed that 4 rats in the Group 1 completed the biomechanical test at the 3rd week, none in the Group 2, and 1 rat in the Group 3. At the 4th week, 4 rats completed the biomechanical test in the Group 1 but none in the Group 2 or Group 3.ConclusionTreatment with local CNP injection accelerates fracture healing in a SD rat model.

Fracture healing; C-type natriuretic peptide; Animal model

A

：1009-6604(2017)09-0827-05

10.3969/j.issn.1009-6604.2017.09.018

2017-05-10)

*通訊作者，E-mail:tianyunbj@sina.com