茶小綠葉蟬代謝解毒基因CYP303A1的克隆及生物信息學(xué)分析

李良德，王定鋒，李慧玲，張 輝，曾明森，吳光遠(yuǎn)

茶小綠葉蟬代謝解毒基因CYP303A1的克隆及生物信息學(xué)分析

李良德，王定鋒，李慧玲，張 輝，曾明森，吳光遠(yuǎn)*

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015）

CYP303A1基因是細(xì)胞色素P450（簡稱P450）家族成員之一，它在昆蟲藥物代謝解毒過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過RT－PCR方法克隆了茶小綠葉蟬Empoasca flavescens CYP303A1基因編碼區(qū)ORF，并通過生物信息學(xué)軟件和在線網(wǎng)站對該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹、氨基酸多重序列比對、三級結(jié)構(gòu)及功能域進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，CYP303A1基因含有1503 bp開放閱讀框，編碼500個氨基酸，分子量為57.42 k Da，理論等電點為8.56。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，CYP303A1基因與同翅目的煙粉虱Bemisia tabaci親緣關(guān)系最近，與膜翅目的榕小蜂Ceratosolen solmsi親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。氨基酸系列比對結(jié)果表明，CYP303A1基因與其他物種昆蟲CYP303A1的保守性較差。三級結(jié)構(gòu)及功能域分析結(jié)果表明，該蛋白以β折疊為主，功能域由一信號肽和p450蛋白域（Pfam：p450）組成。該研究明確了茶小綠葉蟬CYP303A1的核苷酸序列及編碼蛋白特征。

茶小綠葉蟬；CYP303A1基因；克??；生物信息學(xué)；殺蟲劑

福建省現(xiàn)有茶園370萬畝，茶樹害蟲種類繁多。茶小綠葉蟬Empoasca flavescens，隸屬同翅目（Homoptera）葉蟬科（Cicadellidae），是茶樹上的頭號害蟲，也是茶樹病蟲害防治工作的首要對象［1］。目前，可供選擇防治該蟲的藥劑極少，導(dǎo)致了茶農(nóng)長期單一使用同一類殺蟲劑，從而導(dǎo)致茶小綠葉蟬抗藥性增強，防效顯著下降，蟲害連年暴發(fā)。如2000年初，王念武等發(fā)現(xiàn)壽寧茶場的小綠葉蟬對阿克泰、莫比朗、吡蟲啉等農(nóng)藥產(chǎn)生了不同程度的抗性，特別是阿克泰的抗性達(dá)到了13.3倍［2］；2009年，莊家祥等發(fā)現(xiàn)在武夷山茶場和福安茶場茶小綠葉蟬對啶蟲脒的抗性倍數(shù)達(dá)到了52.3和97.4倍，抗性水平進(jìn)一步提升［3］；最近，李建宇等發(fā)現(xiàn)福州、南平、泉州和寧德主產(chǎn)茶區(qū)的茶小綠葉蟬對聯(lián)苯菊酯和啶蟲脒已達(dá)到高抗水平［4］。由此可見，茶小綠葉蟬的抗藥性出現(xiàn)了逐年加重的現(xiàn)象。

害蟲具有較為復(fù)雜的抗藥性機制，導(dǎo)致害蟲抗性產(chǎn)生的主要原因有：殺蟲劑對表皮的穿透力降低，昆蟲對殺蟲劑的解毒代謝增強和殺蟲劑對作用靶標(biāo)的敏感性降低。其中昆蟲細(xì)胞色素P450酶（Cytochrome P450 enzyme，簡稱P450）對殺蟲劑的解毒代謝作用增強，是導(dǎo)致昆蟲對靶標(biāo)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的主要原因［5］。1958年最早發(fā)現(xiàn)P450蛋白是一類含有亞鐵血紅素和硫醇鹽的蛋白酶，它能與CO結(jié)合并在450 nm處有較強吸收峰，因此而得名［6，7］。到目前為止，已在數(shù)十種昆蟲中發(fā)現(xiàn)多種P450家族成員（如CYP3，CYP4和CYP6等），且每個家族又具有多個亞族基因，其中CYP3家族與農(nóng)藥的解毒代謝及昆蟲免疫密切相關(guān)。

研究表明，CYP3主要通過相應(yīng)的酶活性的增加或其酶表達(dá)量的增加，導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生抗藥性［8，9］。例如，棉鈴蟲Helicoverpa armigera CYP337B3具有催化氰戊菊酯的羥基化作用，最終導(dǎo)致棉鈴蟲對氰戊菊酯產(chǎn)生抗藥性［5］。又如對擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗性的棉鈴蟲與CYP337B3的上調(diào)表達(dá)密切相關(guān)［10］。因此，開發(fā)基于以茶小綠葉蟬CYP303A1為靶標(biāo)的新殺蟲劑對解決茶小綠葉蟬抗藥性具有重要的意義。本研究采用RT－PCR技術(shù)從茶小綠葉蟬中克隆得到CYP303A1基因的編碼區(qū)ORF全長，并對該基因編碼的蛋白序列進(jìn)行了分子量、等電點和疏水性分析；同時構(gòu)建了該基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹并比對了氨基酸序列圖譜；最后，對其特殊的三級結(jié)構(gòu)及蛋白功能域進(jìn)行了分析模擬。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx及取樣

試驗昆蟲茶小綠葉蟬，采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗茶園（福建省福安市社口鎮(zhèn)，北緯27°8′～27°13′，東經(jīng)119°32′～119°38′）。采用捕蟲網(wǎng)來回S型路線繞茶園將茶小綠葉蟬收集于捕蟲網(wǎng)中，并收集3～4齡茶小綠葉蟬若蟲于1.5 m L離心管中（每管150頭），保存于－80℃中備用。

1.2 主要試劑

總RNA提?。‥.Z.N.A.TMTotal RNA Kit）及反轉(zhuǎn)試劑盒（Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit）、DNA回收凝膠試劑盒購自Sigma公司；瓊脂糖凝膠、d NTPs（濃度2.5 mmol·L－1）、Taq DNA聚合酶、DNA Marker（DL2000）、載體p MD20－T和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）均為Ta KaRa公司購買。本試驗所用引物的合成和菌樣的測序均由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。

1.3 總RNA提取及cDNA模板的合成

將預(yù)先備好的3～4齡茶小綠葉蟬若蟲（每管150頭）液氮冷凍后，參照總RNA提取試劑盒說明書，研磨提取總RNA，并用電泳檢測（2%瓊脂糖凝膠）所提取RNA的完整性。參照總RNA反轉(zhuǎn)試劑盒說明書，于20μL混合體系中加入1μg總RNA反轉(zhuǎn)構(gòu)建cDNA模板。

1.4 茶小綠葉蟬CYP303A1基因RT－PCR擴增

根據(jù)已獲得的茶小綠葉蟬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，從中挑選出茶小綠葉蟬CYP303A1的基因片段，分析得知該片段包含完整編碼區(qū)ORF。為驗證獲得的堿基序列，首先在ORF的起始密碼子兩端設(shè)計一對兼并引物CAGGCTATATCCTGCAAA／TGAC ATCGTCTTGCGACC進(jìn)行RT－PCR擴增。進(jìn)而在終止密碼子的兩端設(shè)計另一交叉兼并引物ACGAGTGTATCAAGGAGAT／CAACATCTTT ATTGCTATA，RT－PCR擴增獲得茶小綠葉蟬CYP303A1的ORF全序列。擴增反應(yīng)程序為：95℃3 min；95℃30 s，62℃1 min，72℃45 s，40個循環(huán)；72℃6 min；4℃，保存?zhèn)溆?。最后，將所克隆的目的條帶用瓊脂糖凝膠回收并與p MD20－T載體進(jìn)行重組，導(dǎo)進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，挑取陽性白斑進(jìn)行序列測序。

1.5 茶小綠葉蟬CYP303A1基因生物信息學(xué)分析

茶小綠葉蟬CYP303A1序列由DNAstar軟件去除重復(fù)序列拼接獲得；蛋白質(zhì)理化信息通過ProtParam在線網(wǎng)站分析獲得；氨基酸多重序列比對由Multalin 5.4.1在線網(wǎng)站比對獲得；系統(tǒng)進(jìn)化樹由MEGA 7.0采用1000次重復(fù)分析制作獲得（比對方法：neighbor－joining，NJ）；三級結(jié)構(gòu)由Swiss Model在線網(wǎng)站模擬獲得；蛋白功能域由SMART在線網(wǎng)站分析獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶小綠葉蟬CYP303A1基因的克隆

通過設(shè)計的兩對簡并引物，分別擴增獲得大小為465 bp（圖1：泳道2）和1884 bp（圖1：泳道1）的前后兩個條帶，再將所獲得的前后條帶去除重復(fù)序列，拼接得到2161 bp的全序列。

圖1 茶小綠葉蟬CYP303A1基因的克隆Fig.1 Cloning of CYP303A1 cDNA from Empoasca flavescens

采用DNAstar軟件對該基因進(jìn)行拼接，結(jié)果表明CYP303A1基因含有1503 bp開放閱讀框，編碼500個氨基酸（圖2）。采用ProtParam在線網(wǎng)站對編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明該蛋白分子式為C2608H4062N682O720S29，總平均疏水性為－0.219，理論等電點為8.56，分子量為57.42 kDa。

圖2 茶小綠葉蟬CYP303A1編碼的氨基酸序列Fig.2 Aminoacid sequence of CYP303A1 from E.flavescens

2.2 茶小綠葉蟬CYP303A1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過NCBI Blast比對后發(fā)現(xiàn)，茶小綠葉蟬CYP303A1基因與煙粉虱Bemisia tabaci（XM＿ 019040732.1）、溫帶臭蟲Cimex lectularius（XM＿014391468.1）、茶翅蝽Halyomorpha halys（XM＿014430413.1）、柑橘木虱Diaphorina citri（XM＿017445374.1）、紅火蟻Orussus abietinus（KM217008.1）、豌豆長管蚜Acyrthosiphon pisum（XM＿001951058.4）、白背飛虱Sogatella furcifera（KX660712.1）、小菜蛾P(guān)lutella xylostella（XM＿011554832.1）、蠅蛹金小蜂Nasonia vitripennis（NM＿001167774.1）、蕪菁葉蜂Athalia rosae（XM＿012401354.2）、灰飛虱Laodelphax striatell a（JX462969.1）、短管赤眼蜂Trichogramma pretiosum（XM＿014366947.1）、榕小蜂Ceratosolen solmsi（XM＿011496884.1）基因的親緣關(guān)系依次降低。將以上序列下載并制成fasta格式文檔，由MEGA 7.0軟件制作獲得系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。由圖中可知，該基因與同翅目的煙粉虱Bemisia tabaci親緣關(guān)系最近，與膜翅目的榕小蜂Ceratosolen solmsi親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 茶小綠葉蟬CYP303A1氨基酸多重序列比對

通過NCBI比對發(fā)現(xiàn)，茶小綠葉蟬CYP303A1基因與其他物種昆蟲CYP303A1的保守性較差，其中與同翅目煙粉虱Bemisia tabaci（XM＿019040732.1）和白背飛虱Sogatella furcifera（KX660712.1）保守性最高，為67%，與半翅目茶翅蝽Halyomorpha halys（XM＿014430413.1）、溫帶臭蟲Cimex lectularius（XM＿014391468.1）、豌豆蚜Acyrthosiphon pisum（XM＿001951058.4）和褐飛虱Nilaparvata lugens（KM217008.1）的保守性為66%、與鱗翅目小菜蛾P(guān)lutella xylostella（XM＿011554832.1）的保守性為65%。將以上保守氨基酸下載制成fasta格式文檔，通過Multalin 5.4.1在線網(wǎng)站比對獲得了茶小綠葉蟬CYP303A1的氨基酸多重序列比對圖（圖4）。從圖4中分析得出，8個物種CYP303A1蛋白除個別氨基酸保所外（如308～319），其余部分基本不相同，表明茶小綠葉蟬CYP303A1與其他昆蟲較不保守。

2.4 茶小綠葉蟬CYP303A1三級結(jié)構(gòu)與功能域分析

將茶小綠葉蟬CYP303A1編碼蛋白導(dǎo)入Swiss Model在線網(wǎng)站進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)模擬，結(jié)果表明該蛋白主要以β折疊為主，中間以部分α螺旋進(jìn)行連接（圖5）。

采用Smart網(wǎng)站對該編碼序列進(jìn)行功能域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白功能域結(jié)構(gòu)單一，分別由1～20位氨基酸編碼的信號肽（signal peptide）和27～494位氨基酸編碼的p450蛋白域（Pfam：p450）組成（圖6）。

圖3 茶小綠葉蟬CYP303A1基因的進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of CYP303A1 gene from E.flavescens注：數(shù)字的大小表示不同物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

圖4 茶小綠葉蟬CYP303A1多重序列比對Fig.4 Multiple sequence alignment of CYP303A1 from E.flavescens注：保守性由紅色、藍(lán)色和黑色逐步降低。

圖5 茶小綠葉蟬CYP303A1蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiary structure of CYP303A1 from E.flavescens

3 結(jié)論與討論

本研究首次克隆了茶小綠葉蟬CYP303A1基因的全編碼區(qū)ORF，該序列全長2161 bp，含有1503 bp開放閱讀框，編碼500個氨基酸，分子量為57.42 k Da，理論等電點為8.56，這與其他物種昆蟲，如煙粉虱Bemisia tabaci、白背飛虱Sogatella furcifera、茶翅蝽Halyomorpha halys、豌豆蚜Acyrthosiphon pisum等的CYP303A1基因基本類似，明確了獲得的序列為茶小綠葉蟬CYP303A1基因。系統(tǒng)進(jìn)化樹比對表明，茶小綠葉蟬CYP303A1基因與同翅目昆蟲煙粉虱Bemisia tabaci親緣關(guān)系最近，這與茶小綠葉蟬隸屬同翅目昆蟲結(jié)果相符；但其氨基酸多重序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茶小綠葉蟬CYP303A1蛋白氨基酸序列除個別位點保守外，其余部分基本不相同，可能暗示茶小綠葉蟬CYP303A1基因在長期參與藥物解毒或免疫過程中受外來物質(zhì)的誘導(dǎo)，導(dǎo)致多處堿基發(fā)生突變。這種現(xiàn)象在抗性昆蟲中也有存在，如棉鈴蟲Helicoverpa armigera抗氰戊菊酯品系的CYP687基因編碼區(qū)共有14個堿基發(fā)生突變，并最終引起3個氨基酸發(fā)生改變［11］?？逛迩杈挣サ牡珟煳肅ulex pipiens pallens的P450 CYP4家族（CYP4C、CYP4D、CYP4 H）亦存在多基因位點突變［12］。本研究中茶小綠葉蟬多處堿基發(fā)生突變，可能因為該蟲采集于常規(guī)試驗茶園，推測其CYP303A1基因可能受長年施藥的誘導(dǎo)，導(dǎo)致保守性降低。

另外，信號肽具有引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的功能，它能引導(dǎo)靶標(biāo)蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)轉(zhuǎn)移，隨即被腔內(nèi)表面的信號肽酶水解脫離，最終被分泌到胞外。本研究對茶小綠葉蟬CYP303A1蛋白功能域分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有由20位氨基酸組成的一短信號肽，暗示茶小綠葉蟬CYP303A1信號肽在參與有毒物質(zhì)解毒、排毒過程中發(fā)揮了重要作用，但具體功能有待后續(xù)做進(jìn)一步研究。

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Cloning and Bioinformatics of Metabolic Detoxication Gene，CYP303A1，in Empoasca flavescens（Hemoptera：cicadas）

LI Liang-de，WANG Ding-feng，LI Hui-ling，ZHANG Hui，ZENG Ming-sen，WU Guang-yuan*
（Tea Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)u’an，F(xiàn)ujian 355015，China）

CYP303A1 gene belongs to the cytochrome P450 family.It plays an important role in metabolic detoxification of insecticides for insects.This study cloned the complete open reading frame（ORF）of CYP303A1 from Empoasca flavescens using RT－PCR.The physicochemical properties，phylogenetic tree，amino acid sequence，tertiary structure and functional domain of the gene were analyzed with the bioinformatics software and information from online sources.The results showed that the gene had a 1，503 bp ORF encoding 500 amino acids with a molecular weight of 57.42 kDa and a theoretical isoelectric point of 8.56.The phylogenetic tree analysis on the gene indicated that it had the highest genetic relationship with Bemisia tabaci（Homoptera）and the lowest with Ceratosolen solmsi（Hymenoptera）.The amino acid sequence of the gene poorly conserved with those of other insects，and the structure was primaryβ-sheet with its functional domain consisting of a signal peptide and pfam：p450.This study unveiled the nucleotide sequence and encoded amino acid characteristics of CYP303A1 from E.flavescens which would lead to the designing of a target insecticide for better control of E.flavescens on tea plants.

Empoasca flavescens；CYP303A1 gene；clone；bioinformatics；insecticide

S435.711

A

2096－0220（2017）02－0041－05

2017－03－21初稿；2017－04－29修改稿

福建省屬公益類科研院所基本科研專項（2017R1102、2014R1012－5）；國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS－23）；福建省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（2014NK04）。

李良德（1988－），男，助理研究員，主要從事昆蟲生理學(xué)和毒理學(xué)研究。E－mail：787834208＠qq.com

*通訊作者：吳光遠(yuǎn)（1962－），男，研究員，主要從事茶樹植保與害蟲生物防治研究。E－mail：gywupt＠163.com