杜仲松脂醇二葡萄糖苷的體內(nèi)合成、分布、積累與提取純化研究進(jìn)展

劉 倩，肖深根，陳陽(yáng)峰，譚潔瑩，李師陽(yáng)

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，長(zhǎng)沙410128）

杜仲松脂醇二葡萄糖苷的體內(nèi)合成、分布、積累與提取純化研究進(jìn)展

劉 倩，肖深根*，陳陽(yáng)峰，譚潔瑩，李師陽(yáng)

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，長(zhǎng)沙410128）

綜述了松脂醇二葡萄糖苷合成、分布、積累以及提取純化等方面的研究進(jìn)展，以期為提高杜仲原藥用部位松脂醇二葡萄糖苷含量及擴(kuò)大藥源提供參考，達(dá)到杜仲資源高效、全面、綜合利用的目的。

杜仲；松脂醇二葡萄糖苷；合成；分布；積累；提取純化

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是我國(guó)特有的一種孑遺經(jīng)濟(jì)落葉喬木，含豐富天然活性物質(zhì)，這些物質(zhì)廣泛分布在杜仲各個(gè)器官中。松脂醇二葡萄糖苷［（+）-1-pinoresinol 4，4′-di-O-β-D-glucopyranoside］是杜仲中一類以一些初生代謝產(chǎn)物為“原料”，經(jīng)一系列酶催化而形成的杜仲非生長(zhǎng)所必需的小分子有機(jī)化合物，對(duì)杜仲在復(fù)雜環(huán)境中生存、適應(yīng)和發(fā)展起著重要作用。

松脂醇二葡萄糖苷（Pinoresinol Diglucoside，PDG）屬雙環(huán)氧木脂素類，由2個(gè)四氫呋喃型木脂素（tetrahydrofuran）中脂肪烴鏈上的羥基縮合以順式相駢而形成［1］。結(jié)構(gòu)中含4個(gè)手性碳，屬順式結(jié)構(gòu)，遇酸后易發(fā)生異構(gòu)化，從而改變其旋光活性。PDG分子式為C32H42O16，分子量682.66628，熔點(diǎn)為225～227℃；PDG含糖基，因而易溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，在丙酮或三氯甲烷中溶解，不溶于氯仿、乙醚及石油醚；呈白色或類白色粉末或結(jié)晶性粉末，無(wú)臭［2］。PDG的分子結(jié)構(gòu)式如圖1。

圖1 PDG結(jié)構(gòu)式圖［3］

《中國(guó)藥典》2015年版中將PDG含量作為杜仲藥材質(zhì)量控制指標(biāo)，其作為杜仲皮的關(guān)鍵功能成分，能調(diào)節(jié)骨代謝、減輕腦缺血—再灌注損傷等［4，5］，而最受關(guān)注的在于它是杜仲中發(fā)揮降壓作用的主要藥效成分，具有雙向調(diào)節(jié)血壓這一特殊功效。目前研究發(fā)現(xiàn)其存在3種可能的降壓機(jī)制，認(rèn)為主要是通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮產(chǎn)生舒血管物質(zhì)，從而發(fā)揮舒張血管作用來(lái)實(shí)現(xiàn)降壓［6］。生產(chǎn)上，PDG主要從多年生長(zhǎng)的杜仲干皮中獲得。盡管后期發(fā)展起來(lái)的杜仲環(huán)剝皮再生技術(shù)一定程度上實(shí)現(xiàn)了杜仲資源的可持續(xù)利用，但也需4～5年的生長(zhǎng)周期才能進(jìn)行二次剝皮。由于原材料的限制，提取所得的PDG遠(yuǎn)不能滿足醫(yī)藥事業(yè)迅速發(fā)展的需求。筆者綜述了杜仲PDG體內(nèi)生物合成、分布、積累及提取純化幾個(gè)方面的研究成果，以期為擴(kuò)大杜仲藥用部位選擇范圍及提高原藥用部位PDG含量提供參考，達(dá)到杜仲資源高效、全面、綜合利用的目的。

1 杜仲PDG體內(nèi)生物合成途徑

當(dāng)前的研究成果已基本建立起PDG體內(nèi)生物合成的結(jié)構(gòu)，大致分為3個(gè)階段：1）杜仲中葡萄糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化形成苯丙氨酸，再經(jīng)苯丙烷途徑合成一種活性木脂素的前體物質(zhì)—松伯醇（coniferyl alco-hol）［7］。2）2分子松柏醇單體經(jīng)松脂醇合酶催化，通過嚴(yán)格的立體特異性選擇聚合生成1分子松脂醇（pinoresinol）［8］。該反應(yīng)是木脂素生物合成的限速步驟，促使木脂素單體代謝流趨向木脂素的生源合成方向，由此進(jìn)入木脂素代謝途徑，但反應(yīng)涉及的酶體系還未完全鑒定出來(lái)［9］。3）松脂醇在酶的作用下發(fā)生特定的糖基化修飾生成PDG，在植物細(xì)胞和組織中積累貯存［10］。但其糖基化途徑相關(guān)代謝酶類并不清楚，需要再進(jìn)一步探索。

2 杜仲PDG體內(nèi)分布

PDG是杜仲在適應(yīng)環(huán)境過程中與環(huán)境應(yīng)力（生物的和非生物的）相互作用的結(jié)果，存在生育期差異和部位差異，本身及前體合成呈區(qū)域化分布［11］。杜仲不同部位、不同采收期各成分分布有明顯差異，就PDG而言，各部位分布并不均勻。王麗楠等［12，13］測(cè)定出杜仲不同部位PDG含量：內(nèi)皮＞栓皮＞枝＞葉，另于4月至9月6個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)杜仲干皮、枝、葉PDG含量進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)干皮中PDG含量在5、6月較高，葉中4月較高。楊林軍等［14］采用RPHPLC法也測(cè)得杜仲干皮中PDG含量大于枝皮，與前人研究結(jié)果相符，為傳統(tǒng)上以干皮入藥提供了科學(xué)依據(jù)。由于PDG形成及儲(chǔ)藏位點(diǎn)都嚴(yán)格地限制在杜仲一定的發(fā)育期或特殊器官中［11］，但目前所涉及到的研究部位還不夠全面，可以考慮實(shí)行對(duì)杜仲更多部位一整年不同生育期PDG含量的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，以更好地探索PDG分布規(guī)律。

3 杜仲PDG積累

PDG是杜仲中一種特殊植保素，其積累與杜仲遺傳基因、發(fā)育程度等有關(guān)，環(huán)境刺激也能通過影響杜仲體內(nèi)生物合成基因表達(dá)而控制PDG積累。目前闡述環(huán)境條件誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物積累機(jī)制假說(shuō)有多種，存在較多爭(zhēng)議，較為被接受的幾種假說(shuō)之間也有部分觀點(diǎn)存在差異，甚至彼此矛盾，但普遍認(rèn)為一定程度的環(huán)境脅迫有利于植株體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物量的積累和釋放［15］。馮鎖民等［16］報(bào)道了杜仲首次環(huán)剝皮的再生皮中PDG含量略高于原生皮，推測(cè)是受傷刺激加快了再生皮的生長(zhǎng)速度，杜仲以PDG含量和分布部位變化產(chǎn)生生理補(bǔ)償效應(yīng)。

也有研究證實(shí)，不利于杜仲初生代謝的脅迫生態(tài)環(huán)境利于次生代謝產(chǎn)物的積累，其機(jī)制可能是由于脅迫刺激誘導(dǎo)體內(nèi)某些酶的表達(dá)，增加了代謝過程中前體物質(zhì)消耗，從而促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的積累［17］。因此，可以考慮人為地對(duì)杜仲生長(zhǎng)環(huán)境創(chuàng)造脅迫條件，營(yíng)造具有一定環(huán)境壓力的次適宜生態(tài)環(huán)境，在保證杜仲能正常生長(zhǎng)的前提下，使PDG盡可能多積累，或者更確切地向某些部位積累。吳茜等［18］發(fā)現(xiàn)經(jīng)裸根莖和露曬根脅迫處理后的杜仲，處理部位皮中PDG含量都有一定程度提高，雖仍未達(dá)入藥標(biāo)準(zhǔn)，但由此說(shuō)明通過干預(yù)措施可使各部位PDG積累情況發(fā)生改變，也為未來(lái)研究指明了改進(jìn)方向。在此基礎(chǔ)上，可以篩選并優(yōu)化促進(jìn)積累的脅迫處理?xiàng)l件，延長(zhǎng)處理時(shí)間，考察PDG與前體物質(zhì)平衡關(guān)系等，力求在提高杜仲干皮部位PDG含量的同時(shí)，使更多其它部位也能達(dá)到藥用標(biāo)準(zhǔn)。

4 PDG提取方法

4.1 常規(guī)溶劑提取法

PDG是一種極性較強(qiáng)的水溶性成分，溶劑提取法經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單，能利用PDG易溶于甲醇、乙醇等極性溶劑的特性，將其從植物中提取出來(lái)，產(chǎn)品得率高。陳曉青等［19］用60%乙醇水溶液提取PDG，所得提取率為90.21%。但此法提取時(shí)間較長(zhǎng)，且對(duì)提取溫度也有一定要求。

4.2 超聲波輔助提取

超聲波的空化、振動(dòng)等效應(yīng)能有效地破壞杜仲膠，擊碎細(xì)胞壁，增強(qiáng)PDG在溶劑中的釋放速率，同時(shí)在提取過程中溫度升高不明顯，可抑制揮發(fā)，從而最大限度地提取PDG。潘亞磊等［20］采用二水平實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)對(duì)PDG提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，超聲波輔助技術(shù)的加入縮短了傳統(tǒng)提取工藝所需時(shí)間。鄧伶等［21］采用60%甲醇作為提取溶劑，在頻率40 kHz的超聲提取器中于60℃下提取20 min。此方法過程簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，且能達(dá)到比常規(guī)提取方法更理想的效果。

4.3 微生物發(fā)酵

劉超等［22］在前人研究的基礎(chǔ)上從杜仲中篩選出PDG高產(chǎn)菌株擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis sp.）菌株XP-8，利用其具備的多種生物轉(zhuǎn)化能力，使發(fā)酵轉(zhuǎn)化在較溫和的條件下進(jìn)行，最大限度保護(hù)PDG成分免遭破壞，增強(qiáng)藥理作用，但產(chǎn)物得率還較低。其相關(guān)研究尚在繼續(xù)深入，試圖通過代謝調(diào)控來(lái)增加PDG得率［23］。

5 PDG純化方法

5.1 溶劑萃取法

杜仲中所含的杜仲膠極性較低，而PDG有一定極性，可采用溶劑萃取法進(jìn)行兩相萃取，除去大量雜質(zhì)和固體物質(zhì)，在短時(shí)間實(shí)現(xiàn)分相［24］。王月茹等［25］認(rèn)為采用氯仿對(duì)杜仲提取液萃取3次，能夠有效地去除提取液中脂溶性雜質(zhì)的干擾。溶劑萃取法可進(jìn)行連續(xù)操作，富集比高、產(chǎn)量高、成本低，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

5.2 大孔樹脂柱吸附法

大孔吸附樹脂是一種親脂性固體吸附劑，不含交換基因，適合于分離提純水溶性化合物，其多孔性的高分子吸附劑能對(duì)混合物中待分離物質(zhì)進(jìn)行吸附、解析和篩選，從而達(dá)到分離和富集的目的。彭密軍等［26］通過使用大孔吸附樹脂-C18反相硅膠柱層析—正相硅膠柱層析聯(lián)用技術(shù)，很大程度上提高了杜仲PDG的純度。但該方法較為耗時(shí)，且樹脂材料的清洗也存在難度。

6 結(jié)語(yǔ)

關(guān)于杜仲PDG的前期研究主要集中于提取純化、藥理作用等方面。用以提取、純化PDG的技術(shù)方法除了一些相對(duì)成熟且常用方法外，還包括許多新興技術(shù)，而各種方法既有優(yōu)點(diǎn)，又存在局限性。因而在選擇方法的過程中，需要從研究設(shè)備條件、生產(chǎn)成本等多方面來(lái)綜合優(yōu)選最適工藝，同時(shí)也可以采用多種技術(shù)聯(lián)用的方式，以提高PDG的提取純化率，增加原料的利用率。

當(dāng)前對(duì)杜仲PDG體內(nèi)生物合成與代謝途徑的認(rèn)識(shí)仍不完整，關(guān)于其合成、積累機(jī)制與調(diào)控靶點(diǎn)也還處于探索當(dāng)中。隨著鬼臼類結(jié)構(gòu)木脂素生物合成途徑的逐步解析［27］，人們對(duì)PDG生物合成途徑的了解也將更深入。未來(lái)的研究工作應(yīng)全面認(rèn)識(shí)杜仲PDG的代謝網(wǎng)絡(luò)，一方面，掌握PDG合成和積累變化以及分布變化的機(jī)制和規(guī)律，明確與前體物質(zhì)的平衡關(guān)系，找準(zhǔn)調(diào)控靶點(diǎn)，以獲取大量的PDG合成與積累；另一方面，通過分析PDG積累機(jī)制，采用簡(jiǎn)單可行且易于推廣的輔助措施來(lái)提升杜仲其它部位PDG含量，以擴(kuò)大藥源，充分發(fā)揮杜仲資源的利用潛力。

［1］ Deyama T，NishibiS，Nakezawa Y.Constituents and pharmacological effects of Eucommia and Siberian ginseng［J］. Acta Pharmacol Sic，2001，22（12）：1057-1070.

［2］ 楊忠杰.松脂醇二葡萄糖苷藥代動(dòng)力學(xué)和代謝產(chǎn)物研究［D］.鄭州：河南大學(xué)碩士學(xué)位論文，2015.

［3］ 張 艷.綠豆促進(jìn)擬莖點(diǎn)霉代謝合成松脂醇二葡萄糖苷的作用機(jī)制解析［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文，2016.

［4］ Zhang ZF，Min JK，Wang D，etal.Pinoresinol diglucoside exhibits protective effect on dexamethasone-induced osteoporosis in rats［J］.Tropical Journal of Pharmaceutical Research，2016，15（11）：2451-2457.

［5］ 鄧 江，張 潔，羅 潔，等.杜仲提取物預(yù)處理對(duì)腦缺血—再灌注大鼠抗氧化能力及一氧化氮的影響［J］.中國(guó)新藥與臨床雜志，2012，31（8）：472-476.

［6］ 吳東兒，卞筱泓，許激揚(yáng)，等.松脂醇二葡萄糖苷對(duì)ECV-304細(xì)胞損傷的保護(hù)作用和CAV-1表達(dá)的影響［J］.藥物生物技術(shù)，2014，21（3）：218-221.

［7］ Vanholme R，Demedts B，Morreel K，et al.Lignin biosynthesis and structure［J］.Plant Physiol，2010，153（3）：895-905.

［8］ Suzuki S，Umezawa T.Biosynthesis of lignans and norlignans［J］.JWood Sci，2007，53：273-284.

［9］ Satake H，Ono E，Murata J.Recentadvances in themetabolic engineering of lignan biosynthesis pathways for the production of transgenic plant-based foods and supplements［J］.Agric Food Chem，2013，61：11721-11729.

［10］Morimoto K，Kim HJ，Ono E，et al.Effects of light on production of endogenous and exogenous lignans by Forsythia koreana wild type and transgenic cells［J］.Plant Biotechnol，2011，28：331-337.

［11］張康健，董娟娥.藥用植物次生代謝［M］.西安：西北大學(xué)出版社，2001.

［12］王麗楠，楊美華.杜仲不同部位主要有效成分含量比較［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21（1）：108-110.

［13］王麗楠，李 偉，覃潔萍，等.不同采收期杜仲不同部位主要有效成分的動(dòng)態(tài)研究［J］.中國(guó)藥業(yè)，2009，18（18）：29-31.

［14］楊林軍，黃文平，吳永忠，等.杜仲板皮和枝皮中4種有效成分差異性比較［J］.中草藥，2015，46（4）：584-587.

［15］蘇文華，張光飛，李秀華，等.植物藥材次生代謝產(chǎn)物的積累與環(huán)境的關(guān)系［J］.中草藥，2005，36（9）：1415 -1418.

［16］馮鎖民，甘志杰，翟西峰，等.杜仲原生皮與再生皮中松脂醇二葡萄糖苷的含量比較［J］.中藥材，2006，29（8）：792-794.

［17］王玉明，李 錦，張麗媛，等.藥用植物次生代謝產(chǎn)物積累規(guī)律的研究概況［J］.中南藥學(xué)，2012，10（2）：136 -139.

［18］吳 茜，肖深根，張水寒，等.根干模擬生長(zhǎng)處理對(duì)杜仲有效成分含量的影響［J］.作物研究，2015，29（2）：173-176.

［19］陳曉青，李宇萍，彭密軍，等.杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的提純［J］.中南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，34（3）：262-265.

［20］潘亞磊，郭玲麗，謝 培，等.杜仲松脂醇二葡萄糖苷的提取工藝優(yōu)化［J］.化學(xué)與生物工程，2016，33（5）：42-45，66.

［21］鄧 伶，李 江.杜仲藥材含量測(cè)定樣品處理方法優(yōu)化［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2017，13（2）：34-36.

［22］劉 超，師俊玲，周小娟，等.產(chǎn)PDG杜仲內(nèi)生菌的分離篩選和分類鑒定及生長(zhǎng)條件研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，39（1）：203-209.

［23］Zhang Y，Shi JL，Gao ZH，etal.Production of pinoresinol diglucoside，pinoresinol monoglucoside，and pinoresinol by Phomopsis sp.XP-8 usingmung bean and itsmajor components［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2015，99：4629-4643.

［24］Sain RS，Ray S，Basu S.Synergism in solvent extraction and solvent Extraction kinetics［J］.Journal of Chemical，Biological and Physical Sciences，2014，4（4）：3156 -3181.

［25］王月茹，謝 偉，王西芳，等.HPLC測(cè)定杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量［J］.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2009，29（6）：78-79.

［26］彭密軍，呂 強(qiáng)，彭 勝，等.杜仲總木脂素及松脂醇二葡萄糖苷的純化研究［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2014，34（6）：88-92.

［27］Lau W，Sattely ES.Six enzymes from mayapple that complete the biosynthetic pathway to the etoposide aglycone［J］.Science，2015，349：1224-1228.

R284.1

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1001-5280（2017）05-0553-04

10.16848／j.cnki.issn.1001-5280.2017.05.23

2017-04-11

劉 倩（1991-），女，碩士研究生，Email：393244971＠qq.com。*通信作者：肖深根，博士，教授，Email：2395265030＠qq.com。