不同等級(jí)山藥種栽與其內(nèi)源激素(IAA、GA3)含量及蔗糖酶活性之間相關(guān)性研究△

張巖榮，董誠(chéng)明，薛南南，任龍飛,劉丹

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008)

·中藥農(nóng)業(yè)·

不同等級(jí)山藥種栽與其內(nèi)源激素(IAA、GA3)含量及蔗糖酶活性之間相關(guān)性研究△

張巖榮，董誠(chéng)明*，薛南南，任龍飛,劉丹

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008)

目的：由于山藥在種植過(guò)程中缺乏種栽標(biāo)準(zhǔn)，造成山藥的產(chǎn)量與質(zhì)量穩(wěn)定性差，本文主要通過(guò)研究不同等級(jí)山藥種栽中內(nèi)源激素(IAA、GA)和蔗糖酶含量的差異，以及內(nèi)源激素(IAA、GA)和蔗糖酶含量與各級(jí)種苗相關(guān)性，為建立山藥種栽標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。方法：根據(jù)藥用山藥種栽的長(zhǎng)度、直徑、重量、芽數(shù)、凈度、飽滿度等形態(tài)學(xué)指標(biāo)，運(yùn)用SPSS Statistics 17.0分析軟件進(jìn)行K-均值聚類(lèi)分析，對(duì)山藥種栽進(jìn)行分級(jí)，并對(duì)不同等級(jí)山藥種栽?xún)?nèi)源激素(IAA、GA3)含量、蔗糖酶活性之間相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果：制定了山藥種栽的等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)：一級(jí)：長(zhǎng)度：≥26.8 cm、直徑：≥2.40 cm、重量：≥51.0 g、芽數(shù)：≥3.0、凈度：100%、飽滿度：100%；二級(jí)：長(zhǎng)度：≥22.5 cm、直徑：≥2.10 cm、重量：≥36.0g、芽數(shù)：≥2.0、凈度：100%、飽滿度：100%；三級(jí)：長(zhǎng)度：≥18.3 cm、直徑：≥1.80 cm、重量：≥20.0 g、芽數(shù)：≥1、凈度：≥99.0%、飽滿度：≥99.0%；山藥種栽中內(nèi)源激素(IAA、GA3)含量、蔗糖酶活性與各級(jí)種苗之間存在相關(guān)性。結(jié)論：不同等級(jí)的山藥種栽中生理指標(biāo)的差異，為藥用山藥的規(guī)范化種植提供了理論和實(shí)踐依據(jù)。

藥用山藥；種栽；等級(jí)；內(nèi)源激素；酶活性

山藥為薯蕷科多年生纏繞草本植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖，始載于神農(nóng)本草經(jīng)，被列為上品，其性平，味甘，歸脾、胃、腎經(jīng)，功能補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益胃、補(bǔ)腎澀精[1]。為河南省著名道地藥材——四大懷藥之一，自夏、商時(shí)期起就有栽培山藥的歷史，到了明清以來(lái)逐漸形成道地藥材。河南焦作地區(qū)的溫縣、博愛(ài)、武陟、沁陽(yáng)等地是我國(guó)正品山藥的道地和主要產(chǎn)區(qū)，這里出產(chǎn)的山藥特稱(chēng)“懷山藥”，品質(zhì)優(yōu)良，久負(fù)盛名。

農(nóng)戶(hù)在山藥種植方面大多依靠傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)，加上國(guó)家尚未有相關(guān)的山藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，結(jié)果造成在山藥生產(chǎn)過(guò)程中沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)可依。目前，山藥種栽大致可以分為三種：山藥蘆頭、山藥塊莖、零余子。山藥蘆頭又稱(chēng)“山藥栽子”，是山藥塊莖的較細(xì)的先端，有一個(gè)隱芽和莖的斑痕，通常被用來(lái)做種栽；山藥塊莖也稱(chēng)山藥段子，將山藥塊莖按8～10 cm分切成段；山藥零余子是用上年選育貯藏的山藥零余子繁育后做成的種栽。這就造成了山藥種栽混亂、質(zhì)量好壞參差不齊，結(jié)果造成農(nóng)戶(hù)生產(chǎn)的山藥有效成分含量不達(dá)標(biāo)，產(chǎn)量也受到很大的影響，嚴(yán)重降低了山藥種植戶(hù)的經(jīng)濟(jì)效益。為此，結(jié)合實(shí)際山藥種植過(guò)程中存在的問(wèn)題，我們開(kāi)展了對(duì)藥用山藥種栽標(biāo)準(zhǔn)的研究[2]。

植物內(nèi)源激素調(diào)控著植物的生長(zhǎng)、發(fā)育與分化，其中吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)含量、蔗糖酶活性與山藥的生長(zhǎng)發(fā)育有著密切的聯(lián)系，朱海旺等[3]研究了長(zhǎng)山藥塊莖在休眠期的內(nèi)源激素的含量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在山藥的不同休眠期，內(nèi)源激素有較大的變化趨勢(shì)，為此，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同等級(jí)種栽中內(nèi)源激素(IAA、GA3)及蔗糖酶含量的變化，來(lái)研究不同等級(jí)的藥用山藥中內(nèi)源激素(IAA、GA3)及蔗糖酶活性是否存在較大差異，來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證山藥種栽分級(jí)劃分的合理性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

河南焦作溫縣收集的藥用山藥種栽蘆頭，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山藥種栽的形態(tài)學(xué)測(cè)定 長(zhǎng)度 用量程為50 cm的直尺測(cè)量取樣藥用山藥種栽的長(zhǎng)度，精確到0.1 cm。

重量 用電子天平，稱(chēng)量取樣山藥種栽的重量，精確到0.1 g。

圍徑 用數(shù)顯游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確量出每根山藥種栽最粗處的圍徑，精確到0.001 cm。

芽數(shù) 記錄各山藥種栽頂端的芽數(shù)。

凈度 除去山藥種栽中的霉變的、損傷的、雜質(zhì)、泥土、砂石、土塊等重量后的比例。

飽滿度 外在飽滿、無(wú)損傷的、健壯的山藥種栽稱(chēng)為飽滿的種栽，其占全部供試樣品的比例。

飽滿度=飽滿種栽數(shù)/供試樣品數(shù)

1.2.2 山藥種栽的分級(jí) 利用SPSS Statistics 17.0分析軟件，對(duì)藥用山藥種栽的形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，確定優(yōu)先指標(biāo)及順序，然后進(jìn)行K-中心聚類(lèi)分析[4]，將山藥種栽分為三級(jí)。

1.2.3 山藥種栽中吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)含量的測(cè)定 稱(chēng)取頂端山藥種栽1.0 g(精密到0.000 1 g)，用剪刀剪碎，置于液氮中速凍，然后再用2 mL 80%甲醇溶液(內(nèi)含1 mmol·L-12，6-二叔丁基對(duì)甲酚；BHT)研磨成漿，4 ℃冰箱中提取4 h，4000 r·min-1離心15 min，沉淀用80%甲醇溶液重復(fù)提取3次，每次1 h，合并上清液，上清液用氮?dú)獯蹈蓛x吹干，然后用樣品稀釋液(0.01 mmol·L-1pH 7.2 PBS磷酸鹽緩沖液)溶解定容至5 mL容量瓶中[5-6]，最后用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)測(cè)定。

具體操作步驟如下：1)在板孔上與待測(cè)樣品與相對(duì)應(yīng)的位置上作好標(biāo)記；2)手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1 min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板3次即可；3)在板孔上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本品孔并各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μL；4)樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL，空白孔不加；5)除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本品孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min；6)棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，在吸水紙上拍干，如此重復(fù)5次即可；7)每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(A)值。

1.2.4 蔗糖酶活性的測(cè)定

1.2.4.1 酶的提取 取不同等級(jí)的藥用山藥1.0 g，精密稱(chēng)定，用剪刀迅速剪碎，然后用預(yù)冷的蒸餾水在冰浴中研磨成勻漿，定容至100 mL，在冰箱中浸提3 h，4000 r·min-1離心15 min，上清液即為酶的粗提液。

1.2.4.2 酶活性的測(cè)定 用移液管移取2 mL酶的粗提液，置于20 mL帶刻度的試管中，再加入5 mL pH 6.0的磷酸鹽緩沖液及1 mL 10%蔗糖溶液，在37 ℃水浴鍋中保溫0.5 h，取出后立即按3，5-二硝基水楊酸法[7]測(cè)定還原糖的含量。以煮沸酶液10 min鈍化酶的試管作對(duì)照。

1.2.4.3 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及還原糖含量的測(cè)定

1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：取6支20 mL帶刻度的試管，編號(hào)，按下表配置不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：

管號(hào)123456葡萄糖原液量/mL00.40.81.21.62.0加蒸餾水量/mL2.01.61.20.80.40葡萄糖濃度/μg·mL-10100.0200.0300.0400.0500.0

在上述6支試管中分別加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，在沸水浴中加熱5 min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，加蒸餾水定容至20 mL，混勻，以1號(hào)管為空白，測(cè)540 nm波長(zhǎng)下的A值。以A值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2)酶反應(yīng)液中還原糖含量的測(cè)定：吸取2 mL酶反應(yīng)液，加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，在沸水浴中煮沸5 min，冷卻至室溫后，用蒸餾水定容至20 mL，測(cè)定540 nm處的A值。查標(biāo)準(zhǔn)曲線得酶反應(yīng)液中還原糖的濃度。

3)結(jié)果計(jì)算

轉(zhuǎn)化酶的活性用還原糖量表示，計(jì)算公式如下：

其中，U表示轉(zhuǎn)化酶的活性，mg·g-1·fw-1·h-1；

N表示酶反應(yīng)液中還原糖的濃度，μg·mL-1；

N′表示鈍化酶反應(yīng)液中還原糖的濃度，μg·mL-1；

V表示酶反應(yīng)液的總體積；

T表示反應(yīng)時(shí)間；

W表示材料鮮重。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥用山藥種栽的形態(tài)學(xué)指標(biāo)測(cè)定

材料為從河南焦作溫縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)收集的藥用山藥種栽，測(cè)量6個(gè)形態(tài)學(xué)指標(biāo)(長(zhǎng)度、重量、直徑、芽數(shù)、凈度、飽滿度)。

表1 藥用山藥種栽的形態(tài)學(xué)指標(biāo)測(cè)定

2.2 山藥種栽的分級(jí)

用SPSS Statistics 17.0分析軟件，對(duì)藥用山藥種栽形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，然后再進(jìn)行K-中心聚類(lèi)分析，將藥用山藥種栽分為三級(jí)，得到藥用山藥種栽的質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

表2 藥用山藥種栽質(zhì)量分級(jí)指標(biāo)的相關(guān)性分析

注：**表示在0.01水平上極顯著相關(guān)；*表示在0.05水平上顯著相關(guān)。

在對(duì)藥用山藥種栽進(jìn)行分級(jí)之前，我們測(cè)定了6個(gè)形態(tài)學(xué)指標(biāo)(長(zhǎng)度、直徑、重量、芽數(shù)、凈度、飽滿度)，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)將芽數(shù)作為主要分級(jí)指標(biāo)，由上述的SPSS Statistics 17.0相關(guān)性分析可以確定分級(jí)指標(biāo)的優(yōu)先順序，因?yàn)檠繑?shù)與長(zhǎng)度、直徑、重量顯著相關(guān)，而與凈度、飽滿度無(wú)相關(guān)性。因此，確定芽數(shù)、長(zhǎng)度、直徑、重量作為主要分級(jí)依據(jù)，凈度和飽滿度作為參考依據(jù)；質(zhì)量分級(jí)指標(biāo)如表3所示。

由表3可知，確定了山藥種栽的等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，由于芽數(shù)與長(zhǎng)度、直徑、重量顯著相關(guān)，所以如果若芽數(shù)、長(zhǎng)度、直徑、重量這4個(gè)指標(biāo)有一項(xiàng)不達(dá)標(biāo)則降一級(jí)。

表3 藥用山藥種栽質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

2.3 等級(jí)與種栽?xún)?nèi)源激素(IAA、GA3)含量的相關(guān)性研究

2.3.1吲哚乙酸(IAA)含量測(cè)定結(jié)果

2.3.1.1 IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果 由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.029 6X-0.015 2(r=0.999 7)，其中X為IAA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度；Y為IAA標(biāo)準(zhǔn)品溶液在450 nm波長(zhǎng)處的A值。

2.3.1.2 不同等級(jí)的藥用山藥種栽中IAA含量比較結(jié)果 用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，結(jié)果如表4所示。

表4 不同等級(jí)藥用山藥種栽IAA含量

圖1 不同等級(jí)藥用山藥種栽中IAA含量

由表4、圖1可以看出，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定不同等級(jí)的藥用山藥種栽中IAA含量，結(jié)果表明不同等級(jí)之間IAA含量存在差異，一級(jí)最高為0.445 μg·g-1，二級(jí)次之為0.430 μg·g-1，三級(jí)最低為0.211 μg·g-1，由此可以說(shuō)明種栽等級(jí)與IAA含量之間存在相關(guān)性關(guān)系。

2.3.2 赤霉素(GA3)含量測(cè)定結(jié)果

2.3.2.1 GA3標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果 由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得GA3標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0141X+0.0319(r=0.996 4)；，其中X為GA3標(biāo)準(zhǔn)品的濃度；Y為GA3標(biāo)準(zhǔn)品溶液在450 nm波長(zhǎng)處的A值。

2.3.2.2 不同等級(jí)藥用山藥種栽GA3含量比較結(jié)果 用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定，結(jié)果如表5。

表5 不同等級(jí)藥用山藥種栽GA3含量比較

圖2 不同等級(jí)藥用山藥種栽GA3含量

由表5、圖2可以看出，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定不同等級(jí)的藥用山藥種栽中GA3含量，結(jié)果表明不同等級(jí)之間GA3含量存在差異，一級(jí)最多為0.196 mg·g-1，二級(jí)次之為0.182 mg·g-1，三級(jí)最少為0.153 mg·g-1，由此可以說(shuō)明山藥種栽與GA3含量存在相關(guān)性關(guān)系。

2.4 等級(jí)與種栽蔗糖酶酶活性的相關(guān)性研究

2.4.1 蔗糖酶標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果 由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到蔗糖酶標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0021X-0.998 9(r=0.997 8)；其中X為葡萄糖濃度，Y為葡萄糖溶液在540 nm波長(zhǎng)處的A值。

2.4.2 不同等級(jí)藥用山藥種栽蔗糖酶(AI)活性比較結(jié)果 不同等級(jí)的藥用山藥種栽蔗糖酶含量測(cè)定結(jié)果如表6所示。

由表6、圖3可以看出，不同等級(jí)種栽中蔗糖酶活性存在差異，一級(jí)最大為0.320 5 mg·g-1fw-1h-1，二級(jí)次之為0.096 6 mg·g-1fw-1h-1，三級(jí)最小為0.086 4 mg·g-1fw-1h-1。蔗糖酶與植物組織的生長(zhǎng)有密切關(guān)系，是衡量同化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和利用，是植物細(xì)胞代謝及生長(zhǎng)強(qiáng)度的指標(biāo)[4]。表6、圖3得出的結(jié)果表明種栽等級(jí)可能與蔗糖酶活性之間存在相關(guān)性關(guān)系，即等級(jí)高的種栽，蔗糖酶活性大，生長(zhǎng)代謝也可能也就越旺盛。

表6 不同等級(jí)藥用山藥種栽蔗糖酶活性結(jié)果

圖3 不同等級(jí)藥用山藥種栽中蔗糖酶活性結(jié)果

3 討論

品質(zhì)優(yōu)良的中藥材種子種苗是保證中藥材質(zhì)量的首要因素，也是中藥材規(guī)范化種植所面臨的最嚴(yán)重的問(wèn)題之一，我國(guó)中藥材種子種苗尚未形成獨(dú)立產(chǎn)業(yè)，處于一種自產(chǎn)自銷(xiāo)的生產(chǎn)狀態(tài)。150種栽培藥材除人參、甘草、黃芪、三七外均沒(méi)有相關(guān)的種子種苗國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[7]。本文結(jié)合中藥材生產(chǎn)的實(shí)際情況及中藥材種苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的實(shí)踐[8-11]，研究了河南省焦作溫縣地區(qū)的藥用山藥種栽其長(zhǎng)度、直徑、重量、芽數(shù)、凈度、飽滿度與等級(jí)之間的相關(guān)性，探討了與藥用山藥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程相關(guān)的內(nèi)源激素(IAA、GA3)及蔗糖酶活性與等級(jí)的相關(guān)性研究，制定了藥用山藥種栽分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而指導(dǎo)藥用山藥的規(guī)范化種植，提高山藥實(shí)際生產(chǎn)的產(chǎn)量及質(zhì)量。

4 結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，藥用山藥種栽形態(tài)學(xué)指標(biāo)、IAA、GA3、蔗糖酶活性等方面與等級(jí)都存在著非常顯著的相關(guān)性關(guān)系，這就要求我們?cè)诜旨?jí)的操作過(guò)程中不僅要注重種栽形態(tài)學(xué)指標(biāo)，更要從生理學(xué)指標(biāo)對(duì)其分級(jí)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證?；诒緦?shí)驗(yàn)，我們初步制定了藥用山藥種栽的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：一級(jí)：長(zhǎng)度：≥26.8 cm、直徑：≥2.40 cm、重量：≥51.0 g、芽數(shù)：≥3.0、凈度：100%、飽滿度：100%；二級(jí)：長(zhǎng)度：≥22.5 cm、直徑：≥2.10 cm、重量：≥36.0 g、芽數(shù)：≥2.0、凈度：100%、飽滿度：100%；三級(jí)：長(zhǎng)度：≥18.3 cm、直徑：≥1.80 cm、重量：≥20.0g、芽數(shù)：≥1.0、凈度：≥99.0%、飽滿度：≥99.0%。等級(jí)與山藥的生長(zhǎng)發(fā)育狀況成相關(guān)性，此外不同等級(jí)的藥用山藥種栽中IAA、GA3含量和蔗糖酶活性之間也存在相關(guān)性關(guān)系，即一級(jí)最高，二級(jí)次之，三級(jí)最低，結(jié)果表明，對(duì)藥用山藥種栽進(jìn)行等級(jí)劃分十分有必要，不僅能夠規(guī)范農(nóng)戶(hù)對(duì)山藥種栽的優(yōu)選，更進(jìn)一步對(duì)山藥種栽標(biāo)準(zhǔn)的建立具有重要意義。

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CultivationofDifferentGradeYamandCorrelationbetweenEndogenousHormone(IAA，GA3)ContentandInvertaseActivity

ZHANGYanrong，DONGChengming，XUENannan，RENLongfei，LIUDan

(HenanUniversityofChinesemedicine，Zhengzhou450008，China)

Objective：Due to the lack of yam cultivation standards，the problems of quality and stability have resulted in yam production.In this paper，the different grade of yam cultivation endogenous hormone (IAA，GA) and invertase content differences，and the content of endogenous hormones (IAA，GA) and sucrase and seedlings correlation at all levels were studied in order to provide the basis for establish of yam plant standards.Methods：According to morphological indexes such as length，diameter，weight，number of buds，clarity，fullness and other indicators，the yam cultivation was classified by using SPSS Statistics 17.0 software K-means clustering analysis. The correlation between yams grade and the content of endogenous phytohomones (IAA，GA3) invertase activity was explored.Results：We developed a standard classification of medicinal yam seedlings。Class 1：Length：≥26.8 cm，diameter：≥2.40 cm，Weight：≥51.0 g，buds：≥3，Clarity：100% fullness：100%；Class 2：length：≥22.5 cm，diameter：≥2.10 cm，weight：≥36.0 g，buds：≥2.0，clarity：100.0% fullness：100.0%；Class 3：length：≥18.3 cm，diameter：≥1.75 cm，weight：≥20.0 g，buds：≥1 clarity：≥99.0%，plumpness：≥99.0%.There existed a correlation between endogenous hormones (IAA，GA3) content and all levels of seedlings.Conclusion：The medicinal yam of different grades has significant difference between physiological indexes，which provided a basis both in theory and in practice.

Medicinal yam；seedlings；grade；endogenous hormones；sucrase

2016-08-12)

國(guó)家中藥標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目(ZYBZH-Y-HEN-18);中央財(cái)政支持地方科技發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)

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董誠(chéng)明，教授，研究方向：中藥資源學(xué)；Tel：(0371)65962581，E-mail：dcm371@sohu.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.017