莪術(shù)活性成分的分離鑒定及活性研究△

唐思麗，王聲，孫明娜，趙小琴，黃文菁，劉韻，林敏婷，張建業(yè)*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 511436；2.廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 511400)

·基礎(chǔ)研究·

莪術(shù)活性成分的分離鑒定及活性研究△

唐思麗1，王聲1，孫明娜1，趙小琴2，黃文菁1，劉韻1，林敏婷1，張建業(yè)1*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 511436；2.廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 511400)

目的：研究莪術(shù)乙酸乙酯提取物中的化學(xué)成分，探討莪術(shù)活性成分對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。方法：乙酸乙酯試劑提取莪術(shù)、減壓濃縮得到莪術(shù)提取物，采用硅膠柱色譜分離方法對(duì)提取物進(jìn)行分離，所得單體成分結(jié)合MS、13C-NMR、1H-NMR，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。MTT法和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)莪術(shù)活性成分對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力的影響。結(jié)果：從莪術(shù)乙酸乙酯提取物中分離得到1個(gè)倍半萜類單體化合物，鑒定為(5R，6R，7aS)-7a-羥基-5-異丙烯基-3，6-二甲基-6-乙烯基-5，6，7，7a-四氫-4H-苯并呋喃-2-酮(化合物1)。MTT法提示化合物1可抑制PC-9細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化合物1作用的PC-9細(xì)胞的遷移能力相比于對(duì)照組降低。結(jié)論：從莪術(shù)乙酸乙酯提取物中分離鑒定得到單體化合物(5R，6R，7aS)-7a-羥基-5-異丙烯基-3，6-二甲基-6-乙烯基-5，6，7，7a-四氫-4H-苯并呋喃-2-酮，且其對(duì)PC-9細(xì)胞增殖和遷移能力有抑制作用。

莪術(shù)；活性成分；分離鑒定；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)CurcumaphaeocaulisVal.、廣西莪術(shù)CurcumaKwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang或溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根莖。辛、苦，溫，歸肝、脾經(jīng)。具有行氣破血，消積止痛的功效。用于癥瘕痞塊，瘀血閉經(jīng)，胸痹心痛食積脹痛[1]。現(xiàn)代藥理研究，莪術(shù)具有多種活性成分，有抗腫瘤[2]、抗血栓和抗凝血[3]等作用。

肺癌是全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康?；熓侵委煼伟┲饕侄沃唬圆荒芨渭膊?，因此尋找新的藥物顯得尤為重要。本研究從莪術(shù)中分離鑒定出(5R，6R，7aS)-7a-羥基-5-異丙烯基-3，6-二甲基-6-乙烯基-5，6，7，7a-四氫-4H-苯并呋喃-2-酮(化合物1)，并探討其對(duì)人肺癌PC-9細(xì)胞的增殖和遷移能力的影響，為進(jìn)一步研發(fā)治療肺癌的新藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

MAT95XP高分辨ESI-TOF儀(Thermo公司)；Varian Inova核磁共振儀(美國(guó)Varian公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)。

本實(shí)驗(yàn)所用莪術(shù)產(chǎn)地為廣西，購(gòu)于清平藥材市場(chǎng)，經(jīng)香港浸會(huì)大學(xué)陳虎彪教授鑒定為廣西莪術(shù)CurcumaKwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang的根莖。DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle Media)、胎牛血清(GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四氮唑溴鹽(MTT，MP Biomedicals公司)；乙酸乙酯、石油醚、甲醇等溶劑為分析純；薄層色譜硅膠 GF254及薄層色譜硅膠 H、柱色譜硅膠200～300目(青島海洋化工有限公司)；磷鉬酸(天津市津科精細(xì)化工研究所)。

2 方法

2.1 提取方法

取莪術(shù)干燥藥材粉碎，按乙酸乙酯與藥材5∶1的比例加入到5000 mL圓底燒瓶中加熱回流3次，每次3 h。將3次所得到的提取液進(jìn)行合并，靜置，冷卻，過濾，濃縮，得到總提取物浸膏。

2.2 分離與純化方法

樣品進(jìn)行洗脫前，通過薄層色譜確定洗脫液為石油醚-乙酸乙酯-甲醇。當(dāng)極性不同的組分之間的Rf值相差較大時(shí)，可將不同組分洗脫。

取100 g乙酸乙酯提取的浸膏用適量乙酸乙酯稀釋，用1 kg硅膠(200～300目)拌樣，采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，每1000 mL的洗脫液作為1個(gè)流分進(jìn)行收集，再進(jìn)行減壓濃縮。

將濃縮液進(jìn)行薄層點(diǎn)板，展開劑為石油醚-乙酸乙酯(10∶1～2∶1，加0.1%的甲酸)，于紫外分析儀下檢測(cè)，并用5%濃硫酸-乙醇溶液及5%磷鉬酸-乙醇溶液顯色，將各組分點(diǎn)板結(jié)果進(jìn)行對(duì)比并將成分相同組分合并，結(jié)晶。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

將得到的化合物進(jìn)行MS、13C-NMR、1H-NMR等波譜手段分析，并與文獻(xiàn)對(duì)照，鑒定分離單體化合物。

2.4 藥理活性研究

用含青霉素(100 U·mL-1)、鏈霉素(100 g·mL-1)和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)PC-9細(xì)胞。

2.4.1 MTT法檢測(cè)化合物對(duì)PC-9細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-9細(xì)胞，以1.5×104個(gè)·mL-1接種于96孔培養(yǎng)板中。孵育24 h后，加10 μL不同濃度的化合物于96孔培養(yǎng)板，每個(gè)劑量設(shè)4個(gè)平行孔，對(duì)照組僅加DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)選用長(zhǎng)春新堿作為陽性對(duì)照藥物。72 h后，每孔加入10 μL的MTT溶液。孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加100 μL無水DMSO溶液，震蕩10 min。用酶標(biāo)儀540/655 nm雙波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次。根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、藥物的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度，觀察不同濃度化合物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%，IC50為細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為50%的藥物質(zhì)量濃度。

2.4.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)化合物對(duì)PC-9細(xì)胞遷移能力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-9細(xì)胞，以1.5×106個(gè)·mL-1接種于6孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育至上述細(xì)胞相互融合時(shí)，用20 μL槍頭垂直于皿底在單層細(xì)胞上劃痕，劃痕后用PBS輕柔清洗細(xì)胞3次，加入無血清的DMEM和化合物，使化合物的終濃度為10、20、40 μM，對(duì)照組僅加入無血清的DMEM在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，0、24、48 h后置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。測(cè)量劃痕距離，用GraphPad Prism 5分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移情況。

3 結(jié)果

3.1 化合物的分離結(jié)果和結(jié)構(gòu)鑒定

用MS、13C-NMR、1H-NMR等波譜手段并結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)對(duì)白色結(jié)晶單體化合物進(jìn)行鑒定，得到其平面結(jié)構(gòu)為(5R，6R，7aS)-7a-羥基-5-異丙烯基-3，6-二甲基-6-乙烯基-5，6，7，7a-四氫-4H-苯并呋喃-2-酮，具體分析如下：

根據(jù)MS，得到分子離子峰[M+H]+m/z 249，結(jié)合13C-NMR、1H-NMR推測(cè)出單體化合物分子式為C15H20O3，通過分子式計(jì)算不飽和度為6。

13C-NMR譜顯示有15條譜線，其中δ 100～180之間有8個(gè)碳信號(hào)，包括δ 172.7的羰基碳信號(hào)，δ 160.7～111.9之間的6個(gè)烯碳的信號(hào)(提示可能含有三個(gè)雙鍵)，δ 103.3連氧碳信號(hào)。通過與分子式計(jì)算得到的不飽和度相比，推測(cè)該化合物可能含有2個(gè)環(huán)。

1H-NMR譜上共顯示有19個(gè)氫質(zhì)子信號(hào)，與分子式相比少了1個(gè)氫質(zhì)子信號(hào)，推測(cè)結(jié)構(gòu)中有1個(gè)羥基。低場(chǎng)區(qū)的δ 5.70(1H，dd，J=10.5，17.0 Hz)，δ 4.99(1H，dd，J=5.5，10.5 Hz)，δ 4.97(1H，dd，J=5.0，17.0 Hz)，δ 4.98(1H，s)，δ 4.73(1H，s)為烯氫信號(hào)；δ 1.82(3H，s)，δ 1.77(3H，s)，δ 1.27(3H，s)為甲基的氫質(zhì)子信號(hào)。

經(jīng)文獻(xiàn)[4-5]檢索，白色結(jié)晶單體化合物的波譜數(shù)據(jù)與(5R，6R，7aS)-7a-羥基-5-異丙烯基-3，6-二甲基-6-乙烯基-5，6，7，7a-四氫-4H-苯并呋喃-2-酮的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物1為(5R，6R，7aS)-7a-羥基-5-異丙烯基-3，6-二甲基-6-乙烯基-5，6，7，7a-四氫-4H-苯并呋喃-2-酮?；衔?的1H-NMR譜 和13C-NMR譜數(shù)據(jù)見表1，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)式

表1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)

3.2 化合物1抑制PC-9細(xì)胞增殖和遷移

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陽性對(duì)照藥物長(zhǎng)春新堿對(duì)PC-9細(xì)胞的 IC50值為0.01± 0.001 μM，化合物1對(duì)PC-9細(xì)胞的 IC50值為21.12 ± 0.56 μM，表明化合物1對(duì)PC-9細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，為進(jìn)一步的研究提供依據(jù)。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)細(xì)胞自身的運(yùn)動(dòng)遷移能力，本實(shí)驗(yàn)用這種方法檢測(cè)化合物1濃度為10、20、40 μM作用于PC-9細(xì)胞0、24、48 h后細(xì)胞的遷移情況。劃痕結(jié)果顯示，對(duì)照組和化合物1濃度為10、20、40 μM的組在0 h時(shí)，劃痕距離大體相同。24 h后，對(duì)照組與化合物1濃度為10、20、40 μM組的劃痕距離縮短，48 h劃痕的距離相比24 h的距離更短，劃痕的距離與化合物1作用于PC-9細(xì)胞的濃度有關(guān)，化合物1濃度為10、20、40 μM的組隨著濃度增高劃痕距離增寬，細(xì)胞遷移率降低。不同濃度的化合物1作用于 PC-9細(xì)胞的遷移情況見圖2。

注：A.對(duì)照組及10、20、40 μM化合物1作用于PC-9細(xì)胞0、24、48 h的劃痕圖；B.對(duì)照組及10、20、40 μM化合物1作用于PC-9細(xì)胞0、24、48 h遷移率與濃度之間關(guān)系的柱狀圖。圖2 不同濃度的化合物1作用于PC-9細(xì)胞的遷移情況

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用硅膠柱色譜分離法、MS、13C-NMR、1H-NMR等手段分離鑒定化合物1。查閱相關(guān)的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)只有極少數(shù)的文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道該化合物。其原因可能是化合物1中8位的羥基在莪術(shù)生長(zhǎng)過程中與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致以化合物1形式存在的含量極少；其次可能因莪術(shù)的產(chǎn)地、莪術(shù)采集的時(shí)間的不同導(dǎo)致所含的化學(xué)成分有所差異；另外也可能是研究方法和研究條件不一致，例如提取的條件，這需要進(jìn)一步的研究證明。

惡性腫瘤因其高發(fā)病率和高死亡率的特征，已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生問題之一，極大地危害著人類的健康[6]。陳萬青等[7-8]報(bào)道2010年、2011年我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病第一位是肺癌，且呈逐年升高趨勢(shì)，故研究開發(fā)能夠治療肺癌的藥物刻不容緩。本實(shí)驗(yàn)以肺癌細(xì)胞系PC-9細(xì)胞為研究對(duì)象，探究化合物1對(duì)PC-9細(xì)胞的增殖和遷移能力的影響，這有利于發(fā)掘化合物1作為抗癌藥物的潛力。 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物1對(duì)PC-9細(xì)胞的 IC50值為21.12 ± 0.56 μM，具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用；同時(shí)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)也表明隨著化合物1濃度的增大，細(xì)胞的遷移率逐漸降低，表明化合物1具備作為抗癌藥物的潛力，這也為腫瘤的治療提供了一種新的治療方法和治療方向。

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Isolation，IdentificationandActivityAssayofActiveIngredientsofRhizomaCurcumae

TANGSili1，WANGSheng1，SUNMingna1,ZHAOXiaoqin2，HUANGWenjing1，LIUYun1，LINMinting1，ZHANGJianye1*

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences，GuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou511436，China;2.GuangWomanandChidrenHospotalandHealthInstitute,Guangzhou511400,China)

Objective：To investigate constituents fromRhizomaCurcumaeextracts，and study their effects on proliferation，migration of PC-9 cells.Methods：TheRhizomaCurcumaeextracts were obtained through ethyl acetate extraction and vacuum concentration.They were then isolated by silica gel column chromatography method.The structure of composition was confirmed by various spectral methods，including MS，13C-NMR，1H-NMR data.MTT assay and scratch assay were used to evaluate the effect of constituents on cell proliferation and cell migration.Results：One monomer component belonging to sesquiterpenes was isolated fromRhizomaCurcumaeand identified as(5R，6R，7aS)-7a-hydroxy-5-isopropenyl-3，6-dimethyl-6-vinyl-5，6，7，7a-tetrahydro-4H-benzofuran-2-one(compound 1).MTT assay showed that the growth of PC-9 cells which were treated with compound 1 was inhibited.Scratch assay demonstrated that cell migration was reduced when the PC-9 cells were treated with compound 1.Conclusion：Compound 1 isolated from ethyl acetate portion was identified as(5R，6R，7aS)-7a-hydroxy-5-isopropenyl-3，6-dimethyl-6-vinyl-5，6，7，7a-tetrahydro-4H-benzofuran-2-one.Compound 1 has an effect on PC-9 cells and inhibits the cell proliferation and cell migration.

RhizomaCurcumae；active ingredients；cell proliferation；cell migration

2016-06-21)

廣東省科學(xué)技術(shù)廳項(xiàng)目(2016A020226024)；廣州市屬高?？蒲许?xiàng)目(1201410039)；廣東省教育廳項(xiàng)目(2015KTSCX112)

*

張建業(yè)，副教授，研究方向：中藥化學(xué)；Tel：(020)37103255，Email：jianyez@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.010