PFKFB3在結(jié)腸癌患者中的表達(dá)及其臨床意義

章密密， 何躍君

徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院普通外科, 徐州 221006

·短篇論著·

PFKFB3在結(jié)腸癌患者中的表達(dá)及其臨床意義

章密密， 何躍君

徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院普通外科, 徐州 221006

目的： 檢測(cè)6-磷酸果糖激酶-2/果糖雙磷酸酶-2同工酶3(PFKFB3)在大樣本結(jié)腸癌患者中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法： 用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫組化法分別檢測(cè)156例結(jié)腸癌患者癌和癌旁組織中PFKFB3的mRNA和蛋白表達(dá)水平，分析其與結(jié)腸癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果： PFKFB3的mRNA和蛋白表達(dá)在114例(73.1%)患者的結(jié)腸癌組織中高表達(dá)。結(jié)腸癌組織中PFKFB3的mRNA水平高表達(dá)與脈管內(nèi)癌栓形成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)(P<0.05)。PFKFB3 mRNA高表達(dá)患者的生存期短于低表達(dá)患者(P<0.05)。結(jié)論： PFKFB3在結(jié)腸癌患者癌組織中高表達(dá)，PFKFB3的mRNA水平高表達(dá)與患者惡性表型及不良預(yù)后相關(guān)。

結(jié)腸癌; PFKFB3; 臨床病理特征; 預(yù)后

結(jié)腸癌發(fā)病率在我國(guó)逐年升高。最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[1]顯示，結(jié)腸癌在我國(guó)各種腫瘤中發(fā)病率居第3位。研究[2]表明，結(jié)腸癌的發(fā)生伴隨著細(xì)胞能量代謝的改變。癌細(xì)胞即使在有氧條件下也優(yōu)先利用糖酵解途徑來(lái)提供能量，這一現(xiàn)象被稱為腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解，也稱為“Warburg效應(yīng)”[3]。6-磷酸果糖激酶-1(PFK-1)是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，其最重要的變構(gòu)激活劑是2,6雙磷酸果糖(F2,6P2)。而6-磷酸果糖激酶-2/果糖雙磷酸酶-2同工酶3(PFKFB3)是促進(jìn)F2,6P2合成最重要的酶，因此具有協(xié)同促進(jìn)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞糖酵解的作用。PFKFB3已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中高表達(dá)[4]。然而，有關(guān)PFKFB3在結(jié)腸癌中表達(dá)的大樣本研究及其臨床意義研究較少。因此，本研究擬檢測(cè)PFKFB3在大樣本結(jié)腸癌患者中的表達(dá)情況，并結(jié)合相關(guān)臨床病理資料分析PFKFB3的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2005年1月至2015年12月在徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院普通外科住院接受手術(shù)并接受術(shù)后規(guī)范治療的156例結(jié)腸癌患者。其中男性89例，女性67例；年齡18～89歲，平均年齡(68.5±17.6)歲?；颊咝g(shù)前均未接受放化療以及腫瘤靶向治療。術(shù)中收集手術(shù)切除的新鮮腸癌組織與配對(duì)的癌旁組織。標(biāo)本采集后立即置于液氮中，隨后于-80℃冰箱中保存待用。所有患者均由同一組醫(yī)師進(jìn)行根治性手術(shù)，均經(jīng)病例證實(shí)為結(jié)腸癌。其中，右半結(jié)腸癌62例，橫結(jié)腸癌10例，左半結(jié)直腸癌84例；病理類型均為腺癌；腫瘤分化Ⅰ級(jí)15例，Ⅱ～Ⅲ級(jí)120例，Ⅲ級(jí)21例。所有病例均有完整隨訪資料，隨訪截至2015年12月。患者總生存時(shí)間為從手術(shù)時(shí)間至隨訪截止時(shí)間。本研究經(jīng)徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 RT-PCR法檢測(cè)癌和癌旁組織中PFKFB3的表達(dá) 用TRIzol法提取結(jié)腸癌和癌旁組織總RNA。取1 μg總RNA樣品按cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA，用TaKaRa公司的SYBR實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。目的基因PFKFB3的引物序列正義鏈：5′-CCT CAC TCG CAG CCA CTT CT-3′；反義鏈：5′-CAG TTC CTA CTC AAT TCC AA-3′。內(nèi)參基因β-actin的RT-PCR引物序列正義鏈：5′-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3′；反義鏈：5′-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3′。引物均由上海生工生物合成有限公司合成。反應(yīng)采用兩步法在StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 1 min，變性95℃ 5 s，退火和延伸60℃ 30 s；共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。癌組織和癌旁組織中PFKFB3 mRNA的表達(dá)差異采用相對(duì)定量法(2-ΔΔCt法)計(jì)算。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)癌和癌旁組織中PFKFB3的蛋白表達(dá) 制作4 μm石蠟切片，常規(guī)處理后，采用EnVision二步法和DAB顯色。PFKFB3一抗按1∶150稀釋。

2 結(jié) 果

2.1 PFKFB3在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況 RT-PCR法檢測(cè)(圖1)結(jié)果顯示：156例結(jié)腸癌患者中，114例(73.1%)癌組織中PFKFB3的mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織(P<0.05)，平均為癌旁組織中PFKFB3 mRNA表達(dá)水平的2.3倍。免疫組化法結(jié)果(圖2)顯示：癌組織中PFKFB3的蛋白水平也高于癌旁組織。

2.2 結(jié)腸癌組織PFKFB3 mRNA表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)癌組織中PFKFB3的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，將156例患者分為高表達(dá)組(78例)和低表達(dá)組(78例)兩組。結(jié)果顯示：PFKFB3高表達(dá)與脈管內(nèi)癌栓形成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)(表1)。

圖1 RT-PCR法檢測(cè)156例結(jié)腸癌和癌旁組織中PFKFB3的mRNA表達(dá)水平

圖2 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)PFKFB3的蛋白表達(dá)水平

2.3 結(jié)腸癌組織PFKFB3 mRNA表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系 PFKFB3低表達(dá)組術(shù)后1、3、5年總生存率分別為89.7%、76.9%、65.4%，PFKFB3高表達(dá)組術(shù)后1、3、5年總生存率分別為80.8%、61.5%、51.3%；兩組生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02，圖3)。

表1 PFKFB3 mRNA水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 N=78, n

圖3 Kaplan-Meier曲線分析PFKFB3 mRNA表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討 論

PFKFB家族共有4個(gè)亞型，其中PFKFB3于1995年首先從腦組織中分離出來(lái)[5]；隨后在其他組織中也相繼分離出了PFKFB3[6-7]；進(jìn)一步的研究[8-9]發(fā)現(xiàn),PFKFB3沒(méi)有磷酸酶活性而只有激酶活性。PFKFB3是促進(jìn)F-2,6-BP形成的最重要的激酶。PFKFB3被認(rèn)為在腫瘤的生成和代謝過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其在大樣本結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況還不清楚。本研究中檢測(cè)了PFKFB3在156例結(jié)腸癌患者中的表達(dá)情況，顯示其在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，這與其他腫瘤中的表達(dá)情況類似[4]，提示PFKFB3在結(jié)腸癌形成過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。但是其促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的功能和機(jī)制還有待基礎(chǔ)研究進(jìn)一步證實(shí)。

此外，本研究表明，PFKFB3在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)與脈管內(nèi)癌栓形成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期明顯相關(guān)，提示PFKFB3可能也參與腫瘤細(xì)胞的血行轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等過(guò)程，這與基礎(chǔ)研究[10]中發(fā)現(xiàn)的PFKFB3可促進(jìn)惡性腫瘤的血管生成的結(jié)論相一致。基礎(chǔ)研究[10]表明，PFKFB3主要通過(guò)促進(jìn)糖酵解過(guò)程而加快腫瘤病理性血管的生成，當(dāng)阻斷 PFKFB3后，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和移動(dòng)受到抑制，從而減少血管的生成，達(dá)到阻斷腫瘤細(xì)胞通過(guò)血管進(jìn)行擴(kuò)散的目的。但是，PFKFB3通過(guò)何種機(jī)制促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移還有待進(jìn)一步研究。

另外，PFKFB3高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者預(yù)后較差，提示PFKFB3有望作為判斷結(jié)腸癌患者預(yù)后的指標(biāo)，但還需要更大樣本的臨床研究支持，并與癌胚抗原(CEA)等結(jié)直腸癌的經(jīng)典預(yù)后指標(biāo)進(jìn)行比較。

綜上所述，本研究初步揭示了PFKFB3在大樣本結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)情況及其臨床意義。隨著對(duì)PFKFB3在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中作用和機(jī)制的深入研究，將來(lái)有望通過(guò)阻斷PFKFB3而達(dá)到防治結(jié)直腸癌或者通過(guò)檢測(cè)PFKFB3判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的目的。

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[本文編輯] 姬靜芳

Expression of PFKFB3 in human colon cancer and its clinical significance

ZHANG Mi-mi, HE Yue-jun

Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221006, Jiangsu, China

Objective： To investigate the expression of PFKFB3 in human colon cancer and its clinical significance.Methods： Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry were used to detect the mRNA and protein expression levels of PFKFB3 in cancer and adjacent tissues of 156 human colon cancer patients. The relationship of PFKFB3 expression with clinicopathological features and prognosis of colon cancer patients was analyzed by statistical analyses.Results： PFKFB3 mRNA and protein levels were significantly increased in tumor tissues compared to adjacent non-malignant tissues. Furthermore, correlation analysis indicated that PFKFB3 mRNA high expression in colon cancer tissues was significantly associated with intravascular cancer embolus, lymph node metastasis, and TNM staging(P<0.05). Survival analysis showed a poor prognosis of patients with high expression of PFKFB3 mRNA level(P<0.05).Conclusions： PFKFB3 is highly expressed in colon cancer. The expression level of PFKFB3 is correlated with the malignant phenotype and poor prognosis of colon cancer.

colon cancer; PFKFB3; clinicopathological features; prognosis

R 365

A

2016-08-31 [接受日期] 2017-07-12

章密密, 主治醫(yī)師.E-mail: 13914875807@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20160848