不同加工方法對貫葉連翹中黃酮類成分的影響△

史鑫波，唐偉博，白宏博，沈昕，唐寶全，楊春寧，孫曉春，唐志書，劉妍如*

(1.陜西中醫(yī)藥大學 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083；2.陜西省咸陽市實驗中學，陜西 咸陽 712000)

·中藥工業(yè)·

不同加工方法對貫葉連翹中黃酮類成分的影響△

史鑫波1，唐偉博2，白宏博1，沈昕1，唐寶全2，楊春寧2，孫曉春1，唐志書1，劉妍如1*

(1.陜西中醫(yī)藥大學 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083；2.陜西省咸陽市實驗中學，陜西 咸陽 712000)

目的：研究不同加工方法對貫葉連翹中5種主要黃酮類成分的影響及變化規(guī)律，以尋找適宜的干燥方法和條件。方法：貫葉連翹全草洗凈泥土，分別經(jīng)4、-20、-80 ℃儲存48 h后陰干，直接陰干和曬干方法進行加工后，剪切后得到5組樣本。采用超高液相色譜(UPLC-PDA)測定貫葉連翹中5種主要的黃酮類成分含量。將5種不同加工方法處理樣品的數(shù)據(jù)標準化處理，以主成分分析法(PCA)綜合評價貫葉連翹經(jīng)不同加工方法處理后其中的黃酮類成分的含量變化規(guī)律，并對不同加工方法進行多元比較。結果：經(jīng)UPLC分析，貫葉連翹5種黃酮類化合物均可在10 min內出峰，且在各自的線性范圍內線性關系良好(r>0.999 1)，檢出限范圍為0.020～0.107 μg·mL-1，定量限范圍為0.133～0.667 μg·mL-1，平均加樣回收率為95.05%～102.47%，相對標準偏差(RSD)值為0.13%～1.99%。PCA結果顯示，不同處理方法對貫葉連翹成分含量影響綜合評分依次為：曬干>-80 ℃>-20 ℃>陰干>4 ℃。結論：建立的UPLC方法快捷、靈敏、準確，適用于5種主要黃酮類成分的同時測定。PCA結果說明，不同加工方法對貫葉連翹中黃酮類活性成分有一定影響，綜合主要成分的變化規(guī)律，選擇-20 ℃冷凍48 h后晾干作為優(yōu)化的加工方法。

貫葉連翹；藥材初加工；超高效液相色譜法；主成分分析；黃酮類

貫葉連翹HypericumperforatumL.為藤黃科金絲桃屬植物貫葉連翹的全草或帶根全草，又稱貫葉金絲桃、圣約翰草。味辛，性寒，歸肝經(jīng)，始載于《南京民間藥草》?！顿F州草藥》有載：貫葉連翹能“清熱、解毒、通乳、利濕”，具有疏肝解郁、清熱、除濕、消腫通乳等功能[1]。研究顯示，貫葉連翹中的黃酮類化合物是其主要的活性成分和主要物效基礎之一，具有抗抑郁、抗焦慮、抗菌抗炎、調節(jié)更年期代謝紊亂等生物學功能[2-5]。

藥材的初加工技術具有悠久的應用歷史和充分的中醫(yī)藥理論依據(jù)，不同方法加工的藥材在化學成分和含量方面具有明顯的差異，這也是導致同種藥材出現(xiàn)藥效不同的原因之一。隨著對中藥材加工技術、分析技術和數(shù)據(jù)處理技術的深入研究，其加工條件也得到不斷提高[6-8]。

1 儀器與材料

1.1儀器

WatersAcquityUPLC型超高效液相色譜儀，配備四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、PAD檢測器，以及Empower2工作站；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；十萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；GeneVacmiVac低溫離心濃縮儀。

1.2試藥

金絲桃苷、槲皮苷和蘆丁(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111521-201406，111538-200504，10080-201408)；槲皮素、異槲皮素(寶雞市辰光生物科技有限公司，批號分別為6151-25-3，21637-25-2)；貫葉連翹藥材采自陜西太白山縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學、陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心劉世軍副教授鑒定為藤黃科植物貫葉連翹HypericumPerforatumL.的全草；實驗用甲醇、乙腈均為色譜純；其余為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1方法學建立

2.1.1對照品儲備液的制備 分別取金絲桃苷、槲皮素、異槲皮素、槲皮苷、蘆丁對照品適量，精密稱定，置于10mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，再定容至刻度線，再取0.25mL置于5mL容量瓶中，加甲醇溶液制成金絲桃苷、槲皮素、異槲皮素、槲皮苷、蘆丁質量濃度分別為142.50、133.75、151.25、127.50、122.50μg·mL-1的混合對照品溶液，于4℃保存，備用。

2.1.2供試品溶液的制備 精密稱取貫葉連翹不同干燥方法：4℃(4℃冷藏48h后晾干)、-20℃(-20℃冷凍48h后晾干)、-80℃(-80℃冷凍48h后晾干)、直接陰干、直接曬干的藥材粉末(過三號篩)各0.4g，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50mL，稱定重量，加熱回流1h，靜置至室溫，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，過0.22μm微孔有機濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，于4℃保存，備用。

2.1.3色譜條件 采用ACQUITYUPLC?BEHC18(50mm×2.1mm，1.7μm)色譜柱；流動相A為水(含0.2%的甲酸)，B為乙腈，梯度洗脫，洗脫條件為：0～10min，2%～35%B；10～13min，35%B；13～14min，35%～2%B；14～16min，2%B；流速為0.2mL·min-1；進樣量為2μL；柱溫為25℃；檢測波長為254nm。

2.1.4系統(tǒng)適應性試驗 按2.1.3項下設定色譜條件，將混合對照品溶液、供試品溶液分別進樣2μL，進行色譜分析?；旌蠈φ掌啡芤骸⒏鞴┰嚻啡芤簩Ρ壬V圖見圖1。結果顯示，各成分分離度符合測定要求，且空白溶液在相應位置未見干擾。

2.1.5標準曲線 按2.1.3項下設定色譜條件，精密吸取2.1.1項下混合對照品溶液，按6個梯度體積稀釋，同體積進樣，進樣量為2μL，進行色譜分析，以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標，以對照品溶液中化合物質量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標，繪制標準曲線，計算各成分的回歸方程，結果見表1。

2.1.6定量限和檢出限 以空白樣品為檢測對象，添加不同體積的混合對照品溶液，按2.1.3項下設定色譜條件，進樣量為2μL，以各對照品信噪比(S/N)10∶1為定量限(LOQ)，信噪比(S/N)3∶1為檢測限(LOD)，結果見表1。

2.1.7精密度試驗 精密吸取2.1.1項下混合對照品溶液，按2.1.3項下色譜條件連續(xù)進樣6次，進樣量為2μL，測得金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、槲皮苷、異槲皮素各色譜的峰面積，計算相對標準偏差(RSD)值為0.31%～0.91%，表明儀器精密度良好。

注：1.蘆丁(7.216 min)；2.金絲桃苷(7.346 min)；3.異槲皮素(7.448 min)；4.槲皮苷(8.122 min)；5.槲皮素(10.027 min)。圖1 不同加工方法貫葉連翹UPLC圖

成分線性范圍/μg·mL-1標準曲線方程相關系數(shù)r最低檢測限LOD/μg·mL-1最低定量限LOQ/μg·mL-1槲皮素 1.07～22.29Y=13100X-101830.99980.1070.167蘆丁 3.83～122.50Y=7020X-15410.99980.0500.250金絲桃苷4.45～142.50Y=9070X-24860.99950.0570.133異槲皮素5.90～151.25Y=9080X-36140.99920.0670.200槲皮苷 1.05～21.25Y=61200X-47470.99910.0200.667

2.1.8 重復性試驗 取同一供試品溶液，按2.1.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1.3項下設定色譜條件，進樣量為2 μL，測出金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、槲皮苷、異槲皮素各峰的峰面積，計算RSD值。不同處理方法下，5種黃酮類化合物的重復性RSD值為0.19%～1.86%，說明方法重復性良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10、24 h，按2.1.3項下設定色譜條件，進樣量為2 μL，測定金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、槲皮苷、異槲皮素各峰的峰面積，計算RSD值，不同處理方法下，5種黃酮類化合物的重復性RSD值為0.24%～1.76%，表明樣品中各成分在24 h內穩(wěn)定。

2.1.10 加樣回收率試驗 分別精密稱取已知不同加工方法處理的貫葉連翹黃酮類成分含量的藥材0.2 g，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，精密稱取金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷對照品適量，根據(jù)供試品中已知各成分含量的80%、100%、120%，加入上述供試品溶液中。按2.1.3項下設定色譜條件，進樣量為2 μL，計算回收率和RSD值。5種黃酮類化合物的回收率為95.05%～102.47%，見表2。說明該方法回收率高，適用于貫葉連翹中黃酮類成分的測定要求。

表2 5種黃酮類成分的加樣回收率和相對標準偏差(n=3) %

表2(續(xù))

2.1.11 樣品含量測定 按2.1.2項下供試品溶液制備方法，將不同加工的貫葉連翹分別平行制樣6份，0.22 μm有機微孔濾膜濾過，按2.1.3項下設定色譜條件，進樣量2 μL，按外標法計算各成分含量，見圖2。

圖2 不同加工方法貫葉連翹中5種黃酮類化合物的含量(n=6)

2.2 不同處理方法對貫葉連翹中黃酮類化合物的影響分析

對貫葉連翹不同加工方法測定的色譜數(shù)據(jù)(n=6)進行數(shù)據(jù)對齊、積分、標準化處理后，采用simca-p 13.0分析軟件對數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA)。從得到的數(shù)據(jù)矩陣中提取攜帶差異變量最多的主成分，并將各成分作為觀測變量，分析變異最大的成分，最后找到因加工方法的不同而產(chǎn)生的差異成分信息[9-10]。

貫葉連翹不同加工方法得到的數(shù)據(jù)經(jīng)中心化處理后，進行PCA模型擬合。由相關系數(shù)矩陣R得到特征值、方差貢獻率(R2X)和累計貢獻率(Q2cum)結果。系統(tǒng)根據(jù)交叉有效性指標(>0.097 5)提取前3個主成分，正交驗證值為87.3%，說明模型擬合良好(見表3)。通過各成分關系的載荷矩陣，可以找到造成兩組差異的成分信息(見表4)。由載荷計算回歸系數(shù)值，可以看出造成兩組差異的成分峰(保留時間)主要為7.269、7.415、7.29、7.533、7.507、7.404、7.436、4.964、5.462、7.144、10.126 min處。根據(jù)色譜行為鑒定出咖啡酸、綠原酸、異槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、槲皮苷。其中，異槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、槲皮苷的峰與第一主成分高度正相關，咖啡酸和綠原酸的色譜峰信息與第二主成分正相關。根據(jù)PCA載荷圖，從不同加工樣本的UPLC指紋圖譜保留時間及對應的峰面積得到差異成分的相關信息結果。從中指認了3個特征峰，分別為蘆丁(7.144 min)、金絲桃苷(7.269 min)和異槲皮素(7.436 min)。說明第一主成分主要包括了黃酮類的主要差異信息。

表3 主成分特征值及累積貢獻率表

表4 差異成分載荷指標

計算得到5種加工方法得分值分別為：F4℃=-551.512、F-20℃=-151.974、F-80℃=439.425、F陰干=-368.874、F曬干=779.409 7。由結果可知，曬干加工得分最高，-80 ℃冷凍48 h后晾干加工得分次之，但結合各成分含量測定結果，-80 ℃、曬干和陰干加工后貫葉連翹樣品無法檢測到槲皮苷的含量。因此，綜合含量測定和主成分分析結果得到貫葉連翹加工的方法以-20 ℃冷凍48 h后晾干為宜，其次為4 ℃冷藏48 h后晾干。

3 討論

貫葉連翹是臨床治療抑郁癥、阿爾茲海默癥、更年期綜合征的有效藥材，不論其提取物還是活性成分提取物都具有良好的藥理活性?，F(xiàn)代研究報道，貫葉連翹的加工方法主要為室溫避光陰干、60～100 ℃烘干等，這些加工方法對貫葉連翹藥材質量影響較大，其中60 ℃烘干的貫葉連翹中蘆丁和金絲桃苷含量最高，并在一定溫度范圍內呈現(xiàn)先高后低的含量變化。但是，鮮有文獻對其加工的方法進行優(yōu)化和探索，或者采用的檢測指標暫無法充分反映加工方法對主要成分的影響[11-12]。

本文借助超高效液相色譜技術，建立了貫葉連翹藥材經(jīng)不同干燥方法處理后黃酮類化合物的UPLC測定方法，采用主成分分析法分析不同溫度加工處理對貫葉連翹中多個黃酮類成分的影響規(guī)律。結果發(fā)現(xiàn)，貫葉連翹加工的方法以-20 ℃冷凍48 h后晾干的綜合得分最好，其次為4 ℃冷藏48 h后晾干，這與傳統(tǒng)的加工方式不同。在實驗中發(fā)現(xiàn)，溫度是對黃酮類含量影響最大的因素，從結果來看，呈現(xiàn)非線性的變化趨勢，這與以往的研究報道一致。進一步說明，在儲存干燥過程還應該考慮到光照、濕度等因素的影響。

4 結論

綜合研究結果表明，通過對貫葉連翹不同加工方法的優(yōu)化，可以提升貫葉連翹干燥效率，保證活性成分含量，為有效地控制貫葉連翹內在質量標準提供依據(jù)。

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EffectofDifferentProcessingApproachesonFlavonoidsinHypericumperformatum

SHI Xinbo1，TANG Weibo2，BAI Hongbo1，SHEN Xin1，TANG Baoquan2，YANG Chunning2，SUN Xiaochun1，TANG Zhishu1，LIU Yanru1*

(1.ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，ShaanxiprovincekeylaboratoryofnewdrugsandChinesemedicinefoundationresearch，ShaanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang,712083，Shaanxi，China；2.XianyangShiyanMiddleSchool，Xianyang,712000，Shaanxi，China)

Objective：To study the main effect of different processing approach on five flavonoids fromHypericumperformatumfor providing suitable drying methods.Methods：The whole plants ofH.performatumwere cleaned and divided into five processing groups：4 ℃，-20 ℃，-80 ℃，shade and sun drying.An ultra-performance liquid chromatography (UPLC) method was adopted to determine the content of 5 flavonoids.The collect data were standardized and principal component analysis (PCA) was performed on the five processing groups data for differentiation analysis.Results：By using the optimized UPLC method，all the compounds eluted within 10 min.The correlation coefficients (r) were greater than 0.9991 in the linear ranges of the 5 compounds.The limits of detection (LODs) were 0.020-0.107 μg·mL-1，the limits of quantitation (LOQs) were 0.133-0.667 μg·mL-1，the recoveries were between 95.05 % to 102.47 % at three spiked levels with the relative standard deviations (RSD，n=3) ranging 0.13%-1.99%.Based on the PCA results，the integral scores of 5 flavonoids fromH.performatumwith various processing approach in the order from high to low，sun-drying >-80 ℃>-20 ℃>shade drying>4 ℃.Conclusion：The established UPLC method is sensitive，accurate and efficient，which suitable for 5 flavonoids ofH.performatumsimultaneous determination.Meanwhile，the PCA results indicated that different processing method have certain impacts onH.performatumflavonoids contents.Then，the processing method of -20 ℃ storage-shade drying is considered as the better method.

Hypericumperformatum；herbal medicine pre-processing；UPLC；PCA；flavonoids

國家自然科學基金項目(81501229)；陜西省教育廳專項計劃項目(320104-203010012)；陜西省教育廳“春筍計劃”項目(2011K16-03-02)

] 劉妍如，講師，研究方向：藥物分析；Tel：(029)38182207，E-mail：yanzi_2203@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.025

2017-02-24)

*[