葛根多糖提取工藝的優(yōu)化△

裴莉昕，紀寶玉，陳隨清，薛淑娟，郝瓊瓊

(河南中醫(yī)藥大學 藥學院，河南 鄭州 450046)

·中藥工業(yè)·

葛根多糖提取工藝的優(yōu)化△

裴莉昕，紀寶玉，陳隨清*，薛淑娟，郝瓊瓊

(河南中醫(yī)藥大學 藥學院，河南 鄭州 450046)

目的：以葛根多糖為研究對象，提取率和含量為指標，進行綜合分析，得出葛根多糖的最佳提取工藝。方法：通過正交試驗分析影響葛根多糖提取的因素，采用加權(quán)分析法分析各因素的影響度。結(jié)果：應用最佳提取工藝，葛根多糖提取率可達15.38%，含量達12.88%。結(jié)論：該方法簡單、可靠，應用廣泛，可為葛根多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

葛根多糖；工藝優(yōu)化；水提醇沉法；正交設(shè)計；加權(quán)分析法

葛根為豆科植物野葛PuerariaLobate(Willd.)ohwi的干燥根[1]。我國葛根資源極為豐富，除了西藏、新疆、青海外，全國各省均有分布[2]。從20世紀開始，隨著細胞生物學研究和分子生物學研究的不斷深入，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多糖具有多種生物活性[3]，大量藥理及臨床研究證實，多糖具有降血糖、提高機體的免疫功能[4]、抗病毒、抗輻射[5]、抗衰老[6]、抗突變[7]、保鮮[8]、抗腫瘤、抗氧化活性等作用，而且對機體的副作用小。但目前人們主要集中對葛根資源及異黃酮類成分的研究，對葛根多糖研究甚少。筆者首次采用正交試驗和加權(quán)分析法相結(jié)合，以多糖的提取率及含量為指標，對葛根多糖提取中水提和醇沉過程的各影響因素進行綜合分析，得出葛根多糖的最佳提取工藝，為葛根多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電熱恒溫水浴鍋(上海精宏試驗設(shè)備有限公司)；烘箱(上海南榮試驗設(shè)備有限公司，型號：DGX-9053B)；電子天平(常數(shù)市天量儀器有限責任公司)；分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；UV-2600紫外分光光度計(日本島津)；電熱套(金壇市醫(yī)療儀器廠KDM-1000B型調(diào)溫電熱套)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)。

1.2 試劑

石油醚(天津市富宇精細化工有限公司，沸程：60～90 ℃，分析純)；無水乙醇(天津市登科化學試劑有限公司，分析純)；丙酮(煙臺市雙雙化工有限公司，分析純)；苯酚(天津市致遠化學試劑有限公司，分析純)；濃硫酸(洛陽昊華化學試劑有限公司，分析純)；蒸餾水(實驗室自制)；無水葡萄糖(天津市凱通化學試劑有限公司，分析純，批號：1911101)。

1.3 材料

葛根飲片購于亳州市張仲景中藥飲片責任公司(批號：140501，產(chǎn)地：河南)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學生藥學科陳隨清教授鑒定為豆科植物野葛PuerariaLobate(Willd.)ohwi的干燥根，

2 方法與結(jié)果

2.1 葛根多糖的提取

稱取50.00 g葛根粉末，置圓底燒瓶中，加石油醚250 mL，回流提取1 h，過濾，揮干濾渣溶媒，置燒瓶中。重復操作一次，加蒸餾水，回流提取，趁熱過濾，濾液濃縮至50 mL，加入無水乙醇，在一定溫度下，靜置，過濾，沉淀物以無水乙醇、丙酮依次洗滌8次，每次5 mL，得到總多糖組分，60 ℃烘干，稱重，計算粗多糖的提取率。

2.1.1 葛根多糖的含量測定 采用苯酚-硫酸法，含量以無水葡萄糖為對照品。

2.1.2 標準溶液的配制 精密稱取無水葡萄糖0.002 50 g，置50 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，冷藏備用。

2.1.3 5%的苯酚溶液的配制 精密稱取苯酚5.000 3 g，置100 mL容量瓶中，加蒸餾水，搖勻備用。

2.1.4 檢測波長的選擇 精密吸取無水葡萄糖標準溶液2.0 mL，置10 mL具塞試管中，另取2.0 mL蒸餾水作為空白對照。兩試管中分別加入1.0 mL苯酚溶液，混勻，再加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后放置25 min，置沸水浴中加熱15 min，取出置冷水浴中冷卻后，在200～800 nm波長范圍進行全波長掃描。掃描結(jié)果顯示，無水葡萄糖在490 nm處有最大吸收，故可確定最大吸收波長為490 nm。

2.1.5 換算因素測定 精密稱取葛根總多糖0.100 0 g，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。精密量取儲備液10.0 mL，置100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，此為供試品溶液。精密量取供試品溶液2.0 mL，按標準曲線制備項下試劑的加入方法操作，測定吸光度，從標準曲線中求出供試品的濃度，并計算出2 mL供試液中所含的粗多糖的質(zhì)量，按如下公式計算換算因數(shù)：

J=W/CD

(1)

W為實際總多糖量(mg)，C為測得多糖液中總多糖(mg)，D為稀釋因素，經(jīng)計算得出換算因素為J=2.19(n=3)。

2.1.6 供試品的制備及含量測定 取粉末50.00 g，按照2.1項下方法制備，精密稱取制得的葛根粗多糖0.100 0 g，置100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。精密量取儲備液10.0 mL，置100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取2.0 mL供試品溶液，置10 mL試管中，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，垂直快速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置25 min，置沸水浴加熱15 min，取出放入冷水浴中冷卻后，在最大吸收波長(490 nm)處測定吸光度，按下式計算樣品中粗多糖的含量：

(2)

c為供試液葡萄糖濃度(mg·mL-1)，F(xiàn)為供試品溶液的稀釋因素，f為換算因素，M為供試品質(zhì)量(mg)。

2.2 葛根多糖提取影響因素的正交試驗

2.2.1 葛根多糖水提過程影響因素的正交試驗 根據(jù)多糖水提過程中的影響因素，選取提取次數(shù)分別為1、2、3次，提取時間分別為1、2、3 h，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20 g·mL-1；藥材粉碎程度直徑分別為1.0、0.5、0.25 cm，醇沉過程的條件均設(shè)定乙醇濃度為80%，醇沉時間為24 h，醇沉溫度為25 ℃，用以上四因素三水平進行正交試驗L9(34)，結(jié)果見表1。

由表1可知，水提過程中影響綜合指標最大的因素為提取次數(shù)，最小的影響因素為料液比，四因素影響程度為提取次數(shù)>提取時間>粒度大小>料液比，所以最佳水提工藝為A2B3C1D3，即：水提時間為2 h，水提的次數(shù)為3次，水提料液比為1∶10 g·mL-1，藥材的粉碎程度為0.25 cm。

2.2.2 葛根多糖醇沉過程影響因素的正交試驗 選定最佳水提條件，根據(jù)葛根多糖醇沉過程影響因素，選取乙醇濃度為70%、80%、90%，沉淀時間為12、24、36 h，醇沉溫度55、25、4～10 ℃；用以上三因素三水平進行正交試驗L9(33)，結(jié)果見表2。

表1 水提過程正交試驗設(shè)計

表2 醇沉過程正交試驗設(shè)計

由表2可知，在最佳的水提條件下，葛根多糖的醇沉過程中最大影響因素為乙醇濃度，最小影響因素為醇沉時間，各因素影響程度為乙醇濃度>醇沉溫度>醇沉時間。確定最佳的醇沉方案：乙醇濃度為90%，醇沉溫度為4～10 ℃，醇沉時間為36 h。

2.2.3 方法學考察 標準曲線的建立：精密吸取標準溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0 mL分別置于50 mL容量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，分別吸取上述各濃度的標準溶液2.0 mL，置10 mL具塞試管中，另取2.0 mL蒸餾水作為空白對照。各管中分別加入1.0 mL苯酚溶液，混勻，再垂直快速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后放置25 min，置沸水浴中加熱15 min，取出置冷水浴中冷卻后，在最大吸收波長490 nm處測定吸光度。以葡萄糖對照品濃度為橫坐標(X)，以其吸光度為縱坐標(Y)，得到標準曲線。得回歸方程：Y=15.611X+0.130 2，r=0.999 6(n=7)。結(jié)果表明，無水葡萄糖在0.005～0.07 mg·mL-1線性關(guān)系良好。

穩(wěn)定性考察：取同一供試品溶液2.0 mL，置具塞試管中，按2.1.6項下供試品的制備方法制備，每隔20 min測定一次吸光度，連續(xù)測定2 h。RSD為2.34%，表明2 h內(nèi)多糖含量的測定結(jié)果穩(wěn)定。

精密度考察：取同一供試品溶液，分別吸取2.0 mL置5個具塞試管中，按照2.1.6項下的方法測定吸光度。RSD為2.59%，實驗儀器精密度良好。

重復性考察 取同一葛根粉末6份，在相同條件下制備供試品，按照2.1.6項下供試品的制備及含量測定操作。RSD為1.02%，實驗具有良好的重復性。

加樣回收試驗：精密稱取葛根樣品6份，加入葛根多糖，按照2.1.6項下測定，計算加樣回收率，結(jié)果顯示，加樣回收率為98.20%，RSD為1.43%，結(jié)果見表3。

表3 葛根多糖加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.3 最佳工藝的確定

結(jié)合水提和醇沉的影響因素，最終確定最佳提取工藝：水提時間為2 h，水提次數(shù)為3次，料液比為1∶10 g·mL-1，葛根粒度為0.25 cm，醇沉時乙醇濃度為90%，醇沉時間為36 h，醇沉溫度為4～10 ℃。

3 討論

3.1 測定方法

多糖的含量測定方法有很多，例如：色譜法、化學滴定法、光譜法等。色譜法具有定性能力比較差、分析能力受到檢測器的限制、購買與使用費用偏高、需消耗有機溶劑等缺點；化學滴定法則步驟繁瑣，重復性、準確度差，且實驗操作的細微偏差對結(jié)果影響很大。因此，本實驗采用光譜法-紫外-可見分光光度法。此法是近些年來應用于多糖的含量測定最為廣泛的方法[9]。根據(jù)顯色劑的不同，分為苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和地衣酚-鹽(硫)酸法。本文采用苯酚-硫酸法，此法的優(yōu)勢在于能夠進行大量樣品的測定，并在實驗時基本不受蛋白質(zhì)存在的影響，而且產(chǎn)生的有色化合物在120 min內(nèi)顏色穩(wěn)定[10]。實驗用苯酚溶液(未加硫酸)為現(xiàn)配溶液，每次用苯酚濃度一致，否則將會影響實驗結(jié)果[11]。其含量測定依據(jù)的原理：多糖在濃硫酸的作用下，首先水解成單糖，此單糖迅速脫水生成糖醛的衍生物，然后再和苯酚迅速反應，縮合成有色的化合物，再用紫外分光光度計于最大吸收波長處測定其吸光度，通過標準曲線以及換算因子計算得出多糖含量[12-13]。

3.2 分析方法

在正交試驗的基礎(chǔ)上，利用加權(quán)分析法分別賦予多糖提取率和多糖含量0.4和0.6的權(quán)重，計算多糖的綜合指標，從而分析比較各個影響因素的影響程度，得出利用水提醇沉法提取葛根多糖的最佳工藝，以便于葛根多糖制品的規(guī)?；a(chǎn)。

3.3 結(jié)果分析

本實驗系統(tǒng)分析了影響葛根多糖提取過程的因素，利用加權(quán)分析法將各個影響因素的影響程度進行分析，得到葛根多糖的最佳提取工藝。在最佳提取工藝下，葛根多糖提取率最大可達15.38%，含量達12.88%。實驗結(jié)果可以為葛根多糖在其他領(lǐng)域的應用，如藥品、保健品等方面提供參考，對于推動相關(guān)行業(yè)的發(fā)展，具有一定的理論價值和實際應用前景。

3.4 提取因素分析

水提過程中，水提次數(shù)對實驗結(jié)果的影響非常明顯，水提時間次之，料液比和粒度的影響相比較而言則不太明顯。出現(xiàn)這個結(jié)果的原因，可能是料液比設(shè)定的最小比例已經(jīng)足以完全提取出多糖，所以再加大料液比的比例對于結(jié)果的影響就不太明顯。醇沉過程中，乙醇濃度對結(jié)果的影響非常明顯，醇沉溫度次之，影響最小的是醇沉時間，在實驗中發(fā)現(xiàn)，葛根多糖醇沉時現(xiàn)象極為明顯，表明對于醇沉時間的單因素分析也是非常有必要的。因此本實驗后期可增加單因素分析。

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StudyonOptimizationofPeurariaeRadixPolysaccharidesExtraction

PEILixin，JIBaoyu，CHENSuiqing*，XUEShujuan，HAOQiongqiong

(SchoolofPharmacy，HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou450046，China)

Objective：To optimize extraction process of polysaccharide from Radix Puerariae.Methods：The orthogonal experiment was applied to analyze the affecting factors of extraction of polysaccharide in Puerariae Radix，the weighted analysis method was used to analyze the influence degree of each factor.Results：The extraction rate of the polysaccharides was 15.38%，and the content was 12.88%.Conclusion：This method is simple，reliable，wide application，and provides the basis for the industrial production of polysaccharide from Radix Puerariae.

Puerarin polysaccharide；process optimization；water extraction and alcohol precipitation method；orthogonal design；weighted analysis method

中醫(yī)藥公共衛(wèi)生專項資助項目(財[2011]76號)；中醫(yī)藥行業(yè)科研專項資助項目(201207002)；河南省教育廳科學技術(shù)研究重點項目(13A360557)

] 陳隨清，教授，研究方向：中藥品種整理及質(zhì)量標準研究；Tel：(0371)65676686，E-mail：suiqingchen@sohu.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.017

2016-09-20)

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