蘋果屬植物葉中α-葡萄糖苷酶抑制劑的初步研究△

申潔，李珮，畢武，何春年，肖培根

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點實驗室，北京 100193；3.中南大學湘雅醫(yī)院衛(wèi)生部腫瘤蛋白質(zhì)組學重點實驗室，湖南 長沙 410008)

·基礎(chǔ)研究·

蘋果屬植物葉中α-葡萄糖苷酶抑制劑的初步研究△

申潔1,2，李珮1,2，畢武1，2，3，何春年1，2*，肖培根1，2

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點實驗室，北京 100193；3.中南大學湘雅醫(yī)院衛(wèi)生部腫瘤蛋白質(zhì)組學重點實驗室，湖南 長沙 410008)

目的：初步評價蘋果葉提取物及主要化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。方法：采用經(jīng)典α-葡萄糖苷酶活性測定方法，對蘋果屬不同種(品種)、不同產(chǎn)地來源的20種共40份蘋果葉提取物與3種主要化合物進行了α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選，并與陽性對照藥阿卡波糖進行比較。結(jié)果：在樣品濃度為2 mg·mL-1的濃度體系下，所測樣品對α-葡萄糖苷酶均有不同程度的抑制作用，其中23份提取物和2個化合物(根皮素和槲皮素)的IC50值低于阿卡波糖的IC50值，且絕大多數(shù)提取物的IC50值低于其所含的化合物IC50值。結(jié)論：根皮素、槲皮素和根皮苷等成分是蘋果屬植物葉提取物抑制α-葡萄糖苷酶的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，且可能還含有其它協(xié)同作用的成分存在，值得深入研究；不同種(品種)、不同產(chǎn)地來源的蘋果屬植物葉片提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性存在一定的差異，多數(shù)提取物顯示了較強的活性。本實驗為蘋果屬植物葉片資源的可持續(xù)利用和開發(fā)提供一定的科學依據(jù)。

蘋果屬；蘋果屬葉片；α-葡萄糖苷酶；抑制活性；資源利用

蘋果屬(Malus)為薔薇科(Rosaceae)植物，分布于北溫帶廣大地區(qū)。我國是世界蘋果屬植物的起源中心和多樣性中心，具有豐富的野生資源和繁多的栽培品種，其中蘋果MaluspumilaMill.是世界上最著名的水果之一，栽培面積和果實產(chǎn)量均為世界最高[1-4]。以前該屬植物的研究主要集中于食品行業(yè)對其果實的風味、品質(zhì)和產(chǎn)量等方面，對該屬植物葉片資源研究相對較少。

蘋果屬約有35種，在我國約有20余種[2]，部分蘋果屬植物葉有一定的藥用保健價值，例如：西府海棠的果可入藥，主治泄瀉、痢疾[1]；蘋果葉，能涼血解毒[1]，據(jù)《滇南本草》記載：“敷臍上治陰癥。又治產(chǎn)后血迷，經(jīng)水不調(diào)，蒸熱發(fā)燒，服之效”[2]。尖嘴林檎和楸子的果實都可健脾消食[1]；毛山荊子葉可入藥，可用于痙攣性酸痛和急性腹瀉[1]；湖北海棠嫩葉常做茶飲，可消暑，也具有消積化食，溫和健脾的功效[1-2]?，F(xiàn)代研究表明蘋果屬植物葉中含有豐富的多酚類化合物，主要化合物有根皮苷、根皮素、槲皮素等[5-7]。該屬植物葉具有降糖、抗氧化、抗過敏、抗齲齒、降低膽固醇、防治心腦血管疾病等多種藥理活性[8-11]。

α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-glucosidase inhibitors，AGI)是一類通過延緩腸道內(nèi)碳水化合物的水解和吸收從而到達有效控制餐后血糖上升的糖尿病治療藥物，具有控制餐后血糖、保護胰島細胞功能及改善多種糖尿病并發(fā)癥等作用，目前已經(jīng)成為單純飲食控制不佳的2型糖尿病患者的首選藥物及1型糖尿病患者使用胰島素治療的首選輔助藥物。從天然植物中尋找具有更低毒副作用、更高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑一直是國內(nèi)外研究的熱點。已有文獻報道，湖北海棠和平邑甜茶的葉片做茶飲具有一定的降糖作用。蘋果葉的主要化合物根皮素，也有一定的降糖作用，但針對整個蘋果屬植物葉降糖方面的研究較少。鑒于我國蘋果屬植物葉資源豐富且有潛在的降糖價值，但未得到系統(tǒng)比較研究和有效利用的現(xiàn)狀，本課題組廣泛取樣，選取40份蘋果屬植物樣品，涵蓋26份野生種和11份常見栽培品種，以及文獻報道樣品中含有的主要化合物根皮素、根皮苷和槲皮素等成分。開展了蘋果屬植物葉抑制α-葡萄糖苷酶的初步活性評價，旨在為該屬豐富的資源利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

蘋果屬植物葉片于2014年9月底和10月初采自北京市和遼寧省興城市，由中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所程存剛研究員和北京農(nóng)學院姚允聰研究員鑒定，保存在中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所親緣中心，樣品信息見表1。本實驗所用為其干燥葉片的70%乙醇提取物。蘋果屬植物葉片主要化合物根皮苷、根皮素(自制，為本實驗室從多穗柯甜茶中分離得到，并經(jīng)UV、IR、NMR 等光譜鑒定，HPLC檢測純度大于98 %)，槲皮素(購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司)。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，G5003-100UN，美國Sigma公司)；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，N1377-1G，美國Sigma公司)；阿卡波糖(德國Bayer公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器

SPE-111中藥秒級程控提取機(北京金鼎科技發(fā)展有限公司)，BioRad550型微孔板掃描酶標儀(美國BioTek公司)，AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物的制備

將蘋果屬植物葉片陰干，粉碎，取約20 g，精密稱定，加入70%的乙醇500 mL浸泡5 min，利用中藥秒級程控提取裝置提取3 min，所得提取溶液過濾，收集濾液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得流浸膏，進一步用真空干燥箱烘干，獲得干浸膏粉末，保存于-20 ℃冰箱中。

準確稱取樣品干浸膏粉末5 mg，置Eppendorf管中，加入1 mL DMSO溶解，配置成濃度約5 mg·mL-1的樣品溶液母液，待用。

2.2 PNP標準曲線的測定

精密稱取對硝基苯酚(PNP)約0.01 g，于10 mL容量瓶中，加入PBS溶解并定容至刻度，得到PNP儲備液10.10 mmol·L-1。將PNP儲備液稀釋為0.1、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0 mmol·L-1的濃度，吸取不同濃度的PNP溶液150 μL于96孔酶標板內(nèi)，再依次分別加入0.2 mol·L-1的碳酸鈉溶液100 μL終止反應(yīng)，混勻，在405 nm下測定吸光值。以PNP濃度為橫坐標和吸光度值為縱坐標，制標準曲線。得回歸方程：Y=7.308 3X-0.0011，r=0.999 0，表明PNP在0～0.1 mmol·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 酶活性測定方法和酶活性抑制率的計算

為適應(yīng)本實驗篩選的實際要求，按照已有方法[12-15]改進，以PNPG為底物，α-葡萄糖苷酶可以特異性地水解PNPG中的糖苷鍵，生成的水解產(chǎn)物 PNP在405 nm下有吸光值，通過測定吸光值計算水解產(chǎn)物PNP的含量，來計算樣品提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性。確定以96孔板為反應(yīng)載體，最終反應(yīng)體積為250 μL。

因樣品母液，用PBS稀釋時會產(chǎn)生混懸物，故樣品仍選用DMSO稀釋，據(jù)相關(guān)文獻報道[16]DMSO會對使測定的吸光度(A)值升高。本實驗反應(yīng)體系中DMSO的終體積濃度為4%，使A值升高1.40%，影響較小，故仍選擇終體積濃度4%的DMSO樣品液進行α-葡萄糖苷酶活性測試反應(yīng)。

反應(yīng)體系：分別吸取0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)40 μL和待測樣品溶液10 μL，加入2 mmol·L-1的PNPG和0.1 U·mL-1的α-葡萄糖苷酶各50 μL，搖勻，在37 ℃保溫反應(yīng)20 min后，加入0.2 mol·L-1碳酸鈉溶液100 μL終止反應(yīng)，于405 nm下測定吸光度。隨行用磷酸鹽緩沖液代替酶液作空白對照，重復3次，取平均值，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)生的PNP含量變化來計算α-葡萄糖苷酶活性。

由于樣品提取物都含有色素，因此樣品需要測定背景吸收，以10 μL的DMSO代替樣品溶液進行校正，α-葡萄糖苷酶活性的抑制率按下式計算：

抑制率(%)=(Am-Ay)/Am× 100

式中：Am為酶與底物反應(yīng)后的吸收度值(扣除相應(yīng)空白)；Ay為加入抑制劑后酶反應(yīng)的吸收度(扣除相應(yīng)空白)。

2.4 反應(yīng)體系酶濃度的確定

按照“2.3”項下方法，用0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)代替樣品溶液，加入濃度分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 U·mL-1的酶溶液，其他條件不變，反應(yīng)結(jié)束后，在405 nm處測定吸光度值，計算回歸方程為Y=11.58X+0.0403，r=0.998 9。在其它組分濃度不變的條件下，反應(yīng)體系中酶濃度加大則反應(yīng)速度越快，當酶濃度為0.1 U·mL-1時，酶量與反應(yīng)產(chǎn)物PNP之間呈良好的濃度依賴關(guān)系，酶反應(yīng)速度可以達到篩選測定的要求，最終實驗選定濃度為0.1 U·mL-1的α-葡萄糖苷酶溶液進行測定。結(jié)果見圖1。

圖1 α-葡萄糖苷酶濃度對酶活性測定的影響(n=3)

圖2 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用(n=3)

2.5 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

按照“2.3”項下方法，用濃度分別為0、0.2、0.4、0.8、1.6、2、2.4、3、4 mg·mL-1阿卡波糖陽性藥溶液代替樣品溶液，其它條件不變，反應(yīng)結(jié)束后，在405 nm處測定吸光度值。實驗結(jié)果如圖2所示，在固定底物和酶濃度的情況下，改變阿卡波糖的濃度，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有良好的量效關(guān)系，其抑制曲線良好，其IC50值為1.377 mg·mL-1(2.133×10-3mol·L-1)結(jié)果見圖2，說明本實驗體系符合此次篩選的需要。

2.6 測定蘋果屬植物葉片提取物及主要化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

按“2.3”項下方法對40份蘋果屬葉提取物和3種主要化合物進行初步篩選，樣品初篩濃度為2 mg·mL-1。篩選結(jié)果如表1所示，根據(jù)樣品初步篩選的結(jié)果，對26份抑制率高于50%的提取物進行了復篩(因砬山品種樣品份數(shù)較多，砬山1-6、1-7、1-9樣品未測定)。復篩時樣品稀釋成6個合適的濃度梯度，按照“2.4”項下方法進行篩選，通過Graphpad Prism 7軟件計算出各個樣品的IC50值。除紅花麗江山荊子(pgs-07)、垂瓣垂絲海棠(pgs-09)、窄葉海棠(pgs-06)葉片提取物溶液測定時不穩(wěn)定，對α-葡萄糖苷酶的抑制活性不成量效關(guān)系，未測得IC50值外，其它23份樣品均獲得IC50值，結(jié)果見表1。

測定結(jié)果表明，蘋果屬植物葉提取物對α-葡萄糖苷酶均具有一定的抑制作用，其中有26份提取物與根皮素和槲皮素2個化合物在2 mg·mL-1濃度時對α-葡萄糖苷酶的活性較好，抑制率均高于80%。在測得的23份有IC50值的樣品中，除6份樣品(黃盧氏湖北海棠pgs-39、楸子pgs-40、櫻葉海棠pgs-43、紅果三葉海棠pgs-41、隴東海棠pgs-44和砬山1-4 pgs-54)IC50值大于0.1 mg·mL-1外，其余17份樣品IC50值均小于0.1 mg·mL-1，明顯低于陽性對照藥阿卡波糖的IC50值1.377 mg·mL-1和三個化合物的IC50值。表明所測樣品有一半以上具有較強的抑制α-葡萄糖苷酶活性。

表1 蘋果屬植物葉片提取物及其主要化合物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率和IC50值(n=3)

表1(續(xù))

注：-.在2 mg·mL-1時，抑制率低于50%，未測定IC50值；-*.未測得IC50值；本文主要參照1974《中國植物志》第36卷中對蘋果屬的分類系統(tǒng)[17]，同時結(jié)合李育農(nóng)[18]教授的分類處理(文中標注#)。

4 討論

本實驗在經(jīng)典的α-葡萄糖苷酶活性測定方法的基礎(chǔ)上，對實驗具體條件和參數(shù)進行了優(yōu)化，可以快速評價蘋果屬植物葉片提取物和化合物的活性。通過對40份蘋果屬植物葉提取物和3種主要化合物對α-葡萄糖苷酶抑制活性研究，發(fā)現(xiàn)蘋果屬不同種(品種)、不同產(chǎn)地來源的20種共40份蘋果葉提取物與3種主要化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性存在一定的差異，多數(shù)蘋果屬植物葉片顯示了較強的活性，為蘋果屬植物葉片資源進一步的開發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。

從蘋果屬植物分類來看，真正蘋果組的蘋果系9份樣品多具有較高的抑制率和較低的IC50值；山荊子系10份樣品中的不同種海棠樣品也多具有較高的抑制率和較低的IC50值，而不同的山荊子種多具有較低的抑制率?；ㄩ碧O果組測定的樣品數(shù)雖然相對較少，但隴東海棠系和三葉海棠系的5種樣品種有4份顯示較高的抑制率和較低的IC50值。11份栽培品種除個別活性不強外，大多具有較高的抑制率和較低的IC50值。北美引進的兩個種抑制率較低。日本引進的朱眉海棠(pgs-42)活性較強，其IC50值是所有樣品中最低的。但由于本次實驗測定樣本量較少，該屬植物葉對α-葡萄糖苷酶抑制作用的規(guī)律尚需進一步比較研究。

本實驗所測樣品主要來源于遼寧興城和北京昌平兩個地方，采集時間均為秋天，前后相差約10 d，但從測定結(jié)果比較來看，相同種的樣品，來源于北京昌平的樣品活性相對較低，如新疆野蘋果(pgs-04)、湖北海棠(pgs-10)、垂絲海棠(pgs-09)、錫金海棠(pgs-11)和小金海棠(pgs-13)等，推測原因可能為，這段采集時間為葉片中成分快速變化的階段，因采集時間的不同而導致葉片中有效成分變化較大；或因兩個產(chǎn)地引進原生種后，不同的小氣候與土壤等的因素，影響了葉片中有效成分變化，但確切的原因還需要進一步的比較研究。

文獻報道根皮素、槲皮素和根皮苷等是蘋果屬植物葉中主要成分，其中根皮苷在蘋果屬葉片中普遍存在且含量較高，本文實驗結(jié)果表明根皮素和槲皮素對α-葡萄糖苷酶的抑制活性優(yōu)于阿卡波糖，但根皮苷的IC50值卻遠高于它們，這個結(jié)果與文獻報道根皮苷有較好的降糖活性不相符[9]，推測可能是因為根皮苷分子中含有葡萄糖氧基，測定時，葡萄糖氧基斷裂消耗了α-葡萄糖苷酶，使得最后測得根皮苷的IC50值較大，這可以從根皮苷的苷元根皮素的IC50值較低得到解釋。這個現(xiàn)象同時也說明了經(jīng)典的α-葡萄糖苷酶測定評價降糖活性方法的不足。因大多數(shù)蘋果屬植物葉提取物的IC50值低于3個化合物的IC50值，推測蘋果葉提取物中可能還含有其他抑制α-葡萄糖苷酶的具有協(xié)同作用的活性成分，值得進一步研究發(fā)現(xiàn)。

本實驗初步開展了蘋果屬植物葉在降糖方面相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)和活性評價研究，由于采用的測定方法僅為降糖活性評價諸多方法中的一種，受到方法本身的限制，上述結(jié)果尚需更多的研究加以完善。

致謝：本文所用蘋果屬植物樣品在采集中得到中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所王昆研究員、李壯博士和北京農(nóng)學院秦曉曉博士的大力幫助，特此感謝！

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PreliminaryStudyonα-glucosidaseInhibitorfromMalusLeaves

SHENJie1，2，LIpei1，2，BIWu1，2，3，HEChunnian1，2*，XIAOPengen1，2

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalScience，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China； 2.KeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine，MinistryofEducation，Beijing100193，China； 3.KeyLaboratoryofCancerProteomicsofMinistryofHealthofChina，XiangyaHospital，CentralSouthUniversity，Changsha410008，China)

Objective：The aim of this study is to evaluate the α-glucosidase inhibition of extracts and main compounds inMalus’ leaves.Methods：The effect of extracts on α-glucosidase activity was investigated by enzymatic method in vitro.Forty extracts and three main compounds fromMalus’leaves were screened，and then compared with positive control(acarbose IC501.377 mg·mL-1).Results：The extracts and compounds fromMalus’leaves showed α-glucosidase inhibition obviously.The IC50of 23 categories extracts and 2 compounds(phloretin，quercetin)were lower than acarbose.Some extracts in the leaves ofMalushad remarkable inhibitory effect on α-glucosidase activity and almost had lower IC50compared to 3 compounds.Conclusion：Phloretin，quercetin and phlorizin are the basic composition for inhibiting α-glycosidase enzymes，and it also has potential research about synergistic components of extracts.Different extracts from dissimilar locations have distinctive activities of α-glycosidase inhibition；fortunately，most extracts have strong inhibiting activities.This experiment provides the scientific basis for the plant resources ofMalus’ leaves that can keep on to utilize and develop.

Malus；Malus’ leaves；α-glucosidase；inhibitory activity；resource utilization

中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程經(jīng)費資助(2016-I2M-1-012)

] 何春年，副研究員，研究方向：藥用植物親緣學研究；Tel：(010)57833165，E-mail：cnhe@ implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.013

2016-11-07)

*[