UPLC-MS/MS測(cè)定不同產(chǎn)地吊石苣苔中苯乙醇苷類成分含量△

張瑜，楊健，詹志來(lái)，胡峻，劉勇*，袁媛

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；2.道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700)

·基礎(chǔ)研究·

UPLC-MS/MS測(cè)定不同產(chǎn)地吊石苣苔中苯乙醇苷類成分含量△

張瑜1，2，楊健2，詹志來(lái)2，胡峻1，劉勇1*，袁媛2

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；2.道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700)

目的：建立超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地吊石苣苔中4個(gè)苯乙醇苷類成分的方法，分析比較不同產(chǎn)地吊石苣苔中苯乙醇苷含量差異。方法：采用 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm ×2.1 mm，1.8 μm)；以 0.1%甲酸-水(A)- 0.1%甲酸-乙腈(B)溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，體積流量為 0.5 mL·min-1；柱溫為40 ℃，采用電噴霧離子源，負(fù)離子檢測(cè)方式，得到相應(yīng)的提取離子流圖。結(jié)果：不同產(chǎn)地吊石苣苔中4個(gè)苯乙醇苷含量有明顯差異，結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，對(duì)尋找高含量苯乙醇苷的資源植物及產(chǎn)地具有重要的理論指導(dǎo)意義。

吊石苣苔；苯乙醇苷；UPLC-MS/MS

吊石苣苔LysionotuspauciflorusMaxim.為苦苣苔科(Gesneriaceae)吊石苣苔屬(Lysionotus)草本植物，別名石豇豆、石澤蘭、巖豇豆、巖石茶、巖頭三七等[1-2]，近代研究表明其具有抗結(jié)核桿菌、抗炎、抗肝毒，祛痰、平喘鎮(zhèn)靜，降血壓、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、清除自由基、抗腫瘤作用和提高機(jī)體免疫功能等多種活性作用[3]，苯乙醇苷(phenylethanoid glycosides)是廣泛存在于玄參目和唇形目等較進(jìn)化的雙子葉植物類群(如爵床科、列當(dāng)科、苦苣苔科、唇形科和馬鞭草科)中的一類活性成分，有些文獻(xiàn)[4]也稱苯丙素苷類化合物(phenylpropanoid glycosides)，該類化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)記憶、保肝、強(qiáng)心等作用[5]。課題組前期工作表明，吊石苣苔中含有阿克苷和極為少見(jiàn)的paraboside Ⅲ等苯乙醇苷類成分[6]，本研究以另外4個(gè)苯乙醇苷類化合物作為對(duì)照品，以湖南、云南、四川、重慶4個(gè)產(chǎn)地13個(gè)吊石苣苔為實(shí)驗(yàn)樣本，采用UPLC-MS/MS測(cè)定樣本中4個(gè)苯乙醇苷的含量，對(duì)探究苯乙醇苷含量較高的吊石苣苔產(chǎn)地分布規(guī)律有一定理論指導(dǎo)意義。

1 材料與儀器

1.1 材料

苯乙醇苷類對(duì)照品共4個(gè)，分別是isonuomioside A、paraboside B、nuomioside A、paraboside A，為實(shí)驗(yàn)室自制，純度均大于95%。對(duì)照品化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

注：1.isonuomioside A；2.paraboside B；3.nuomioside A；4.paraboside A。圖1 苯乙醇苷類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2 植物

2013年8月從湖南、云南、四川、重慶4個(gè)地方采集到13個(gè)吊石苣苔樣品，并由中國(guó)科學(xué)院北京植物研究所李振宇研究員鑒定為吊石苣苔LysionotuspauciflorusMaxim.。樣品標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 吊石苣苔樣品采集信息表

1.3 儀器和試劑

ACQUITY UPLCTM H-Class系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、EmpowerTM3色譜工作站)，API 6500四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)ABSCIEX 公司，配有離子噴霧接口)，SB-800 DTD型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)，New Classic MS-S電子天平[梅特勒-托利多(上海)有限公司]，Eppendorf 5810R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 公司)。

色譜級(jí)甲醇和乙腈(美國(guó)Fisher Scientific公司)；甲酸(LC/MS分析用，美國(guó)Fisher Scientific公司)；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm ×2.1mm，1.8 μm)，流動(dòng)相：0.1%甲酸-水溶液(A)，0.1%甲酸-乙腈(B)；按程序梯度洗脫(0 min，15% B；1 min，20.5% B；4 min，21.5% B)；流速為0.6 mL·min-1，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。對(duì)照品和樣品的提取離子流圖(XIC)見(jiàn)圖 2、3。

注：A.nuomioside A；B.paraboside A；C.paraboside B；D.isonuomioside A。圖2 對(duì)照品提取離子流圖

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：Turbo V，電離模式：ESI-，氣簾氣(CUR)體積流量：30 L·min-1，噴霧電壓(IS)：-4500 V，霧化氣(GS1)體積流量：55 L·min-1，加熱輔助氣(GS2)體積流量：55 L·min-1，采集方式：MRM，離子化溫度(TEMP)：550 ℃。優(yōu)化的條件參數(shù)見(jiàn)表2。

注：A.nuomioside A；B.paraboside A；C.paraboside B；D.isonuomioside A。圖3 吊石苣苔樣品提取離子流圖

化合物tR/minMRM參數(shù)MRM離子對(duì)(m/z)去簇電壓(DP/V)碰撞能量(CE/eV)射出電壓(CXP/V)isonuomiosideA1.81609.1/160.9-198-45-14parabosideB1.75741.1/579.0-267-49-49nuomiosideA1.38609.1/160.9-199-42-19parabosideA1.33741.2/579.1-279-45-49

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取樣品細(xì)粉2.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇水溶液[6]50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率 250 W，頻率 40 kHz)1 h，稱定重量，用70%甲醇水溶液[7]補(bǔ)足減少的質(zhì)量，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。放置于4 ℃冰箱供UPLC分析用。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取isonuomioside A、paraboside B、nuomioside A、paraboside A對(duì)照品適量，用甲醇配成單一成分對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述4種對(duì)照品溶液適量，加甲醇配制成每1 mL含isonuomioside A 519.4 μg、paraboside B 392.7 μg、nuomioside A 520.4 μg、paraboside A 497.3 μg的混合對(duì)照品溶液。放置于4 ℃冰箱供UPLC分析用。

2.3 線性關(guān)系考察

將上述混合對(duì)照品溶液進(jìn)一步稀釋成6個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)分別得到回歸方程：isonuomioside A，Y=2.079 2×106X-189 010(r=0.999 6)，線性范圍0.166 ～ 259.68 μg·mL-1；paraboside B，Y=9.393 38×105X-214 846(r=0.999 4)，線性范圍0.125 ～ 39.27 μg·mL-1；nuomioside A，Y=1.426 92×106X-293 390(r=0.999 8)，線性范圍0.166～ 520.35 μg·mL-1；paraboside A，Y=9.587 86×106X-434 129(r=0.999 5)，線性范圍0.159 ～ 49.77 μg·mL-1。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄4個(gè)苯乙醇苷的峰面積和保留時(shí)間，計(jì)算其RSD在1.14%～1.88%；表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品5份，按照2.2.1項(xiàng)方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各苯乙醇苷成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值在1.77%～2.78%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品供試品溶液，分別在0、1、2、3、4、6、8 h 測(cè)定4個(gè)苯乙醇苷的峰面積,并計(jì)算其RSD值在 0.78%～3.76%，表明溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取吊石苣苔樣品9份，向其中加入高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度(n=3)的對(duì)照品溶液。按照2.2項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度進(jìn)行3次樣本分析，以計(jì)算所得的實(shí)際值與加入量的比值即為其準(zhǔn)確度。4個(gè)苯乙醇苷的平均加樣回收率：isonuomioside A 為103.4%，paraboside B為97.5%，nuomioside A為98.5%，paraboside A為101.8%，其 RSD 均小于 2.9%。

3 樣品測(cè)定

取13批樣品，分別按照2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分析，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算13批樣品中4個(gè)苯乙醇苷類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 吊石苣苔中苯乙醇苷類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=3) μg·mL-1

4 討論

苯乙醇苷類化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)記憶、保肝、強(qiáng)心等作用[5]，近年來(lái)逐步成為研究熱點(diǎn)，本課題組前期研究表明，該類成分廣泛存在于苦苣苔科植物中，本研究選用了4個(gè)苯乙醇苷類成分，其中isonuomioside A和paraboside B分別為咖啡?；B在葡萄糖基6位的二糖苷和三糖苷，nuomioside A和paraboside A分別為咖啡?；B在葡萄糖基4位的二糖苷和三糖苷；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除了湖南省安化、四川省峨眉和重慶酉陽(yáng)3個(gè)產(chǎn)地未檢測(cè)到paraboside B，在其他產(chǎn)地的吊石苣苔中都檢測(cè)到了4個(gè)苯乙醇苷類成分，說(shuō)明這4個(gè)苯乙醇苷在吊石苣苔中普遍存在。

從不同產(chǎn)地分析，四川省漢源地區(qū)的吊石苣苔苯乙醇苷含量是所有地區(qū)中最高的，其中nuomioside A和isonuomioside A的含量分別高達(dá)0.78%和0.33%，與其相比，四川省其他地區(qū)樣品中4個(gè)成分含量均較低，湖南省產(chǎn)的吊石苣苔從整體來(lái)看，4個(gè)苯乙醇苷含量比其他產(chǎn)地高，其中nuomioside A的含量均大于0.1%，isonuomioside A的含量除了湖南省安化的樣品較低，其他地區(qū)均大于0.1%，而重慶和云南采的樣品中，4個(gè)苯乙醇苷含量均較低。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地吊石苣苔的苯乙醇苷含量存在較大差異。

nuomioside A和isonuomioside A在吊石苣苔中的含量表明這兩個(gè)成分是吊石苣苔中重要的化學(xué)成分，目前2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定吊石苣苔的指標(biāo)性成分為石吊蘭素，且含量不低于0.1%[8]，鑒于苯乙醇苷類成分具有很好的活性且其在吊石苣苔中具有很高的含量，課題組后期工作可能會(huì)考慮為吊石苣苔中的苯乙醇苷類成分制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于有的產(chǎn)地采集的樣品太少，不能代表當(dāng)?shù)卣w的吊石苣苔苯乙醇苷含量，今后還要進(jìn)一步收集樣品進(jìn)行研究。

[1] 中國(guó)科學(xué)院植物研究所.中國(guó)高等植物圖鑒：第4冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2002：119.

[2] 趙汝能.甘肅中草藥資源志：上冊(cè)[M].蘭州：甘肅科技出版社，2003：665-667.

[3] 王仕寶，晏繼紅，郭曉華，等.苗藥石吊蘭的研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2014，29(5)：550.

[4] 李振宇，王印政.中國(guó)苦苣苔科植物[M].鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，2004：606-607.

[5] 宋光西，馬玲云，魏鋒，等.苯乙醇苷的分布及藥理活性研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7(4)：169-171.

[6] 白貞芳，王曉琴，肖培根，等.苯乙醇苷類化合物在苦苣苔科藥用植物中分布規(guī)律[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38(24)：4267-4270.

[7] 高偉，幸偉年，敖婉初，等.高效液相色譜法測(cè)定木通屬植物苯乙醇苷B含量[J].江西林業(yè)科技，2015，43(5)：48-51.

[8] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：90.

DeterminationofFourPhenylethanolGlycosidesinAerialPartsofLysionotuspauciflorusfromDifferentHabitatsbyUPLC-MS/MS

ZHANGYu1，2，YANGJian2，ZHANZhilai1，HUJun1，LIUYong1*，YUANYuan2

(1.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102,China；2.StateKeyLaboratoryofDao-diHerbsbreedingbase，NationalResourcesCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective：To establish a UPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of four phenylethanol glycosides in the aerial parts ofLysionotuspauciflorusMaxim.，and analyze and investigate the difference of phenylethanol glycosides ingredients in samples from different habitats.Methods：The determination was performed on the ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)with0.1% formic acid-water(A)and 0.1% formic acid-acetonitrile(B)in gradient elution as mobile phase.The flow rate was 0.5 mL·min-1.The column temperature was 40 ℃.MS instrument was equipped with ESI-ion source.Gaining The extracted ion chromatograms were obtained susquently.Results：There are differences in the composition and content from different habitats.Conclusion：The developed method for the simultaneous determination of the four phenylethanol glycosides is simple，accurate，and reproducible，has great theoretical significance for looking for high levels of phenylethanol glycosides of plant resources and habitats.

Lysionotuspauciflorus；phenylethanol glycosides；UPLC-MS/MS

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81373959)；中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(201407003)；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題資助項(xiàng)目(2016-JYB-XS125)

] 劉勇，教授，研究方向：藥用植物親緣學(xué)；Tel：(010)84738656，E-mail：yliu0126@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.007

2016-07-06)

*[