款冬花歐盟質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究△

相婷，吳麗真，鄭璐*，周海燕

(1.揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225321；2.中國(guó)中藥公司，北京 100195)

·基礎(chǔ)研究·

款冬花歐盟質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究△

相婷1，吳麗真1，鄭璐1*，周海燕2

(1.揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225321；2.中國(guó)中藥公司，北京 100195)

目的：根據(jù)《歐洲草藥植物專論研究指導(dǎo)原則》建立款冬花藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，主要包括薄層鑒別方法和含量測(cè)定方法。方法：薄層鑒別選用款冬酮作為指標(biāo)成分，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開后噴以硫酸乙醇試液加熱顯色，置于紫外燈365 nm下檢視；含量測(cè)定采用YMC-Pack ODS-A色譜柱，甲醇-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，柱溫：35 ℃，流速：0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。結(jié)果：薄層鑒別方法專屬性強(qiáng)，主成分條帶清晰，辨識(shí)度高；含量測(cè)定方法學(xué)結(jié)果表明款冬酮在3.074～153.7 μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，平均回收率為99.9%(RSD=2.0%)，重復(fù)性、中間精密度、穩(wěn)定性及耐用性考察RSD均小于2.0%。結(jié)論：本研究中建立的薄層色譜鑒別方法和含量測(cè)定方法可準(zhǔn)確測(cè)定款冬花中款冬酮的含量，為《歐洲藥典》款冬花專論提供研究數(shù)據(jù)。

款冬花；歐洲藥典；款冬酮；薄層鑒別；含量測(cè)定

款冬花為菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾，具有潤(rùn)肺下氣、止咳化痰之功效，用于治療新久咳嗽、喘咳痰多和老嗽咳血等癥[1]。款冬花中主要含有萜、黃酮和生物堿等類成分[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，款冬花醇提物具有明顯的鎮(zhèn)咳祛痰作用[3]；款冬酮能顯著增加外周作用，具有較強(qiáng)的升壓作用[4]；另有實(shí)驗(yàn)證明款冬酮具有較強(qiáng)的抗過敏和抗炎作用[5-6]。本研究以款冬酮為指標(biāo)性成分，按照《歐洲草藥植物專論研究指導(dǎo)原則》建立款冬花藥材的薄層鑒別方法和HPLC含量測(cè)定方法，為《歐洲藥典》款冬花專論的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案提供詳細(xì)的研究資料。

1 儀器與試藥

瑞士CAMAG薄層成像系統(tǒng)；美國(guó)安捷倫1200高效液相色譜儀(G1322A脫氣機(jī)，G1312A二元高壓泵，G1367B自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1315D紫外檢測(cè)器和ChemStation色譜工作站)；KQ-250B型超聲清洗儀；瑞士梅特勒XP205DR型分析天平。

款冬酮對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111884-201102)；15批款冬花樣品購(gòu)自河北安國(guó)市中藥材市場(chǎng)，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)李會(huì)軍教授鑒定為款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾，樣品信息見表1。

HPLC分析用甲醇為色譜純；TLC分析用乙醇、乙酸乙酯、環(huán)己烷和硫酸等試劑均為分析純；純化水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；TLC分析用硅膠G板(德國(guó)默克公司，10 cm×20 cm)。

表1 15批款冬花樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

取款冬花藥材粉末(過50目篩)約1 g，精密稱定，加20 mL乙醇，超聲1 h后過濾，濾液蒸干，殘?jiān)芙庥? mL乙酸乙酯中，即得供試品溶液。另取款冬酮對(duì)照品約1 mg，精密稱定后溶解于1 mL乙醇溶液中，即得對(duì)照品溶液。吸取以上供試品溶液和對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層色譜板上，條帶點(diǎn)樣，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(4∶1，V/V)為展開劑，展距不小于8 cm，展開后取出晾干，噴以硫酸乙醇試液顯色，置于紫外燈365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光條帶，見圖1。

注：1～8.S01～S08號(hào)樣品；9.款冬酮；10.S15；11～16.S09～S14號(hào)樣品。圖1 15批次款冬花薄層鑒別色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：YMC-Pack ODS-A(150 mm×4.0 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：水，流動(dòng)相B：甲醇；按程序梯度洗脫(0～15 min，25%A；15～16 min，25%A→0%A；16～25 min，0%A)；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 制備溶液

2.2.2.1 空白溶液 乙醇溶液。

2.2.2.2 對(duì)照品溶液 取款冬酮對(duì)照品約13.0 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，精密吸取上述溶液1 mL，乙醇稀釋定容至25 mL，即得。2.2.2.3 供試品溶液 取款冬花藥材粉末(過50目篩)約1.000 g，精密稱定，置于具塞容量瓶中，精密加入20 mL乙醇后稱重，室溫下超聲提取1 h，冷卻后補(bǔ)足損失的重量，搖勻，過濾，收集續(xù)濾液，即得。2.2.2.4 空白供試品溶液 不加入款冬花藥材，按照2.2.2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行操作，即得。2.2.2.5 對(duì)照品供試品混合溶液 分別量取適量的供試品溶液和空白供試品溶液，1∶1等體積混合，即得。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按照2.2.2分別制備空白溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜，見圖2。結(jié)果顯示對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣5針，峰面積RSD=0.05%，對(duì)照品和供試品溶液中款冬酮色譜峰的對(duì)稱因子在0.95～1.05，理論塔板數(shù)均不小于6000，款冬酮色譜峰與前后雜質(zhì)峰分離度均大于1.50，提示該色譜系統(tǒng)適用性良好。

注：A.空白溶液；B.款冬酮對(duì)照品溶液；C.供試品溶液。圖2 款冬花及對(duì)照品溶液HPLC圖

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 按照2.2.2項(xiàng)下溶液制備方法分別制備空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白供試品溶液和對(duì)照品供試品混合溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果顯示空白溶液和空白供試品溶液對(duì)主色譜峰無干擾，對(duì)照品供試品混合溶液中主色譜峰峰形無裂分，提示該方法專屬性良好。

2.2.5 線性關(guān)系考察

2.2.5.1對(duì)照品線性關(guān)系考察 取款冬酮對(duì)照品約15.0 mg，精密稱定，溶解于50 mL乙醇溶液，作為母液。分別精密量取適量上述母液，稀釋配制成質(zhì)量濃度為3.074、6.148、15.37、46.11、76.85、153.7 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。以質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得回歸方程Y=29.37X+ 0.590(r=0.999 9)。結(jié)果表明，款冬酮在3.074～153.7 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.2.5.2 供試品線性關(guān)系考察 分別取款冬花藥材粉末(過50目篩)約0.20、0.40、0.60、1.00、1.50、2.00 g，精密稱定，按照2.2.2.3方法制備得到一系列不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的供試品溶液。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件對(duì)以上供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X，%)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得回歸方程Y=15.06X+ 7.415(r=0.999 9)。結(jié)果表明，供試品在0.202 6～2.005 1 g線性關(guān)系良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取款冬花藥材粉末(過50目篩)約0.50、1.00、1.50 g(相當(dāng)于50%、100%、150% 3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平)各6份樣品，精密稱定。按照2.2.2.3方法制備18份供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果款冬酮含量在低、中、高3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平下RSD值分別為0.88%、0.84%、0.99%，提示該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 中間精密度試驗(yàn) 另外一名操作者取款冬花藥材粉末(過50目篩)約1.00 g，平行6份樣品，精密稱定。按照2.2.2.3方法制備6份供試品溶液。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件用另外一臺(tái)高效液相色譜儀Agilent 1260進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果兩名操作者在不同儀器上測(cè)得款冬酮含量的RSD值為1.28%，提示該方法中間精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取2.2.2.2和2.2.2.3項(xiàng)下對(duì)照品和供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、18、24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果對(duì)照品和供試品峰面積的RSD值分別為0.12%和0.24%，提示對(duì)照品和供試品在乙醇溶液中24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的款冬花藥材粉末(過50目篩)約0.50 g，平行9份樣品，分為3組，分別加入3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平(50%、100%、150%)的款冬酮對(duì)照品。按照2.2.2.3方法制備得到9份供試品溶液。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 款冬花中款冬酮加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.2.10 耐用性試驗(yàn) 本研究中耐用性試驗(yàn)是通過單變量分析法(OVAT)微調(diào)測(cè)試條件中的單個(gè)變量觀察結(jié)果的不受影響程度，改變色譜條件變量(流速、流動(dòng)相比例、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)和色譜柱)，結(jié)果表明該方法耐用性良好，具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 色譜條件耐用性結(jié)果

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取14批次款冬花樣品適量，按照2.2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，雙樣雙針，記錄色譜并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 款冬花樣品中款冬酮含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1 薄層條件篩選與優(yōu)化

2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中款冬花薄層鑒別方法為采用硅膠GF254板，以石油醚(60～90 ℃)-丙酮(6∶1)為展開劑，展開自然晾干后直接置于紫外燈254 nm下檢視。然而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)款冬酮在254 nm波長(zhǎng)下未見有明顯的暗斑，對(duì)照品和樣品在該條件下均不具有較好的辨識(shí)度。后經(jīng)摸索發(fā)現(xiàn)采用硅膠G板展開后用硫酸乙醇顯色劑進(jìn)行加熱顯色后再置于紫外燈365 nm下檢視，款冬酮呈現(xiàn)清晰的藍(lán)色熒光條帶。因歐洲草藥委員會(huì)專家提出各國(guó)生產(chǎn)石油醚沸程存在較大差異，建議用其他溶劑作為展開劑，經(jīng)調(diào)整最終確定環(huán)己烷-乙酸乙酯(4∶1)作為展開劑。

3.2 含量測(cè)定條件篩選與優(yōu)化

本研究對(duì)款冬酮的含量測(cè)定提取方法進(jìn)行了摸索與優(yōu)化，比較了不同提取方法(超聲、回流和冷浸)、提取溶劑量(10、20、30 mL)和提取時(shí)間(30、60、90 min)對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響，最終確定最佳提取條件為20 mL乙醇溶液超聲提取1 h。色譜條件方面比較了不同流動(dòng)相比例、柱溫、流速和檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)色譜峰的影響，最終確定最佳色譜條件：流動(dòng)相為甲醇-水(75∶25)，柱溫為35 ℃，流速為0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

綜上所述，本研究建立的薄層鑒別和含量測(cè)定方法可靈敏檢測(cè)并準(zhǔn)確測(cè)定款冬花中款冬酮的含量，為《歐洲藥典》款冬花專論提供詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：332-333.

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ResearchonQualityStandardofFarfaraeFlosforEPMonograph

XIANGTing1，WULizhen1，ZHENGLu1*，ZHOUHaiyan2

[1.YangtzeRiverPharmaceutical(Group)Co.，Ltd.，TheNationalKeyInstituteofTCMQualityControl，StateAdministrationofTraditionalChineseMedicineoftheP.R.China(NKI-TCM)，JiangsuTaizhou225321，China；2.ChinaNationalTraditionalChineseMedicineCorp.，Beijing100195，China]

Objective：To establish the quality standard of Farfarae Flos mainly including TLC method and HPLC determination method，according to the technical guide for the elaboration of EP monographs.Methods：Tussilagone was selected as the marker constituent in the TLC identification method.After developing with cyclohexane-ethyl acetate(4∶1)，the plate was sprayed with alcoholic solution of sulfuric acid Reagent and heated，and then examined under 365 nm UV light.In the HPLC determination method，a YMC-Pack ODS-A chromatographic column was used for the separation，with the mobile phase of methanol-water in a gradient elution procedure.The column temperature was set at 35 ℃，the flow rate was set as 0.8 mL·min-1and the wavelength was set at 220 nm.Results：The TLC identification method was established with good specificity，and the fluorescent zone of tussilagone was clearly detected with high distinguishing degree.Results：of HPLC method validation showedthat the determination method kept good linearity(r=0.999 9)in the concentration range of 3.074-153.7 μg·mL-1for tussilagone.The average recovery was 99.9%(RSD=2.0%)，RSDs of repeatability，intermediate precision，stability and robustness test were no more than 2.0%.Conclusion：In this paper，a sensitive TLC identification method and an accurate HPLC determination method were established for the quality control of Farfarae Flos，which provided useful research data for EP monograph.

Farfarae Flos；European Pharmacopeia；tussilagone；TLC identification；determination.

國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(201307002)

] 鄭璐，高級(jí)工程師，研究方向：中藥歐盟質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；E-mail：zhenglu@yangzijiang.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.006

2016-07-01)

*[