地黃根部響應(yīng)澇脅迫關(guān)鍵基因的鑒定△

王翠英，李鑫宇，王瀟然，李明杰，張重義*，陳新建*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.福建農(nóng)林大學(xué) 中藥材GAP研究所，福建 福州 350002)

·中藥農(nóng)業(yè)·

地黃根部響應(yīng)澇脅迫關(guān)鍵基因的鑒定△

王翠英1，李鑫宇1，王瀟然1，李明杰2，張重義2*，陳新建1*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.福建農(nóng)林大學(xué) 中藥材GAP研究所，福建 福州 350002)

目的：本研究利用RNA-seq技術(shù)，對(duì)澇脅迫下的地黃根部差異表達(dá)基因進(jìn)行了鑒定，為揭示地黃特異響應(yīng)澇脅迫的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法：以溫“85-5”懷地黃品種為供試材料，采用人工模擬澇脅迫的方法處理地黃植株，利用升級(jí)版數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)分別對(duì)對(duì)照及處理樣品進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組文庫比對(duì)獲得表達(dá)基因，利用RPKM方法計(jì)算基因的表達(dá)量，以FDR<0.005和|log2 ratio|≥1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG注釋和富集分析。結(jié)果：澇害脅迫處理后共篩選到7249差異表達(dá)基因，上調(diào)表達(dá)2505個(gè)(約35%)，下調(diào)表達(dá)4744個(gè)(約65%)。結(jié)論：KEGGPathway顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)代謝、次生代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、淀粉和蔗糖代謝途基因包含的比例較多。功能分析發(fā)現(xiàn)，澇害條件下參與乙醇發(fā)酵、乙烯合成等途徑的基因被顯著上調(diào)，鈣信號(hào)途徑的基因異常，同時(shí)發(fā)現(xiàn)許多轉(zhuǎn)錄因子呈現(xiàn)差異表達(dá)，如WRKY、GRAS和NAC這些與脅迫相關(guān)的基因發(fā)生上調(diào)表達(dá)，而調(diào)控正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄因子如BHLH、MYC、BYB、MADS-box等則是以下調(diào)表達(dá)為主，由此證實(shí)澇害脅迫嚴(yán)重影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。

地黃；升級(jí)版數(shù)字基因表達(dá)譜；人工模擬澇害脅迫；差異表達(dá)基因；轉(zhuǎn)錄因子

澇害是世界上許多國(guó)家面臨的重大自然災(zāi)害之一[1]。澇害能擴(kuò)大植物根際分子氧的運(yùn)動(dòng)速率而降低氧氣供應(yīng)導(dǎo)致植物缺氧或者低氧[2]。低氧能夠引起能源和碳水化合物的危機(jī)，植物本身必須通過調(diào)節(jié)能量的消耗儲(chǔ)備能量。低氧能引起一些基因表達(dá)的變化，這些基因與碳水化合物的分解、糖酵解、乙醇發(fā)酵途徑、脂質(zhì)代謝、乙烯合成、植物激素調(diào)解過程、鈣信號(hào)、ROS產(chǎn)生[3]、轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)[4]。

地黃RehmanniaglutinosaL.玄參科地黃屬多年生草本植物，是我國(guó)著名的“四大懷藥”之一[5]。地黃塊根膨大需要大量的氧氣供應(yīng)，要求土壤含水量約為10%～30%。地黃植株受到澇害脅迫以后會(huì)出現(xiàn)爛根現(xiàn)象，且很容易導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重影響產(chǎn)量[6]。然而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)地黃澇害的研究尚未見報(bào)道。

本研究利用RNA-seq技術(shù)獲得地黃澇脅迫下的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法篩選澇脅迫的差異表達(dá)基因，并對(duì)這些基因進(jìn)行功能、代謝和調(diào)控途徑的分析。利用qPCR對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了驗(yàn)證。研究地黃在澇害脅迫下基因的差異表達(dá)，為進(jìn)一步鑒定和澇脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因，揭示地黃對(duì)澇害敏感的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為地黃抗?jié)澈蚬こ谈牧继峁├碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究采用廣泛種植且澇害反應(yīng)最為明顯的“溫85-5”懷地黃品種為供試材料。在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室和河南農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所培養(yǎng)室中進(jìn)行脅迫模擬試驗(yàn)(盆栽試驗(yàn))。澇脅迫：出苗20 d選長(zhǎng)勢(shì)均一的材料進(jìn)行處理，堵塞盆底部排水口，先進(jìn)行10 d持續(xù)繞水最大持水量W的80%，稍停3 d后繼續(xù)10 d持續(xù)繞水最大持水量W的90%，稍停3 d后堵塞盆底部排水口，每天澆灌最大持水量(W)使土表水保持2 mm高度直到所有植株出現(xiàn)有氣生根生成；脅迫處理完成后，選取處理和對(duì)照的較為一致地黃整株根系，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后，放入-80 ℃保存。

圖1 A.對(duì)照； B.澇害處理

1.2 RNA提取和cDNA的合成

按TaKaRa TRIzol Reagent(Invitrogen)RNA試劑

盒說明書的要求分別提取對(duì)照和處理材料根部的總RNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000來檢測(cè)其純度和提取的完整性，獲得高質(zhì)量RNA后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)TaKaRa RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進(jìn)行操作把獲得的高質(zhì)量的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，放入-80 ℃保存，用于下一步qRT-PCR。

1.3 基因表達(dá)文庫構(gòu)建

提供濃度≥300 ng·μL-1、總量≥6 μg、OD260/280為1.8-2.2的對(duì)照和處理材料的地黃根部總RNA樣品，由深圳華大基因科技有限公司對(duì)RNA樣品進(jìn)行后續(xù)處理。使用Illumina HiSeqTM 2000對(duì)質(zhì)控合格文庫完成測(cè)序。測(cè)序儀所得的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)Base Calling轉(zhuǎn)化為原始序列數(shù)據(jù)(raw reads)，然后經(jīng)過除雜質(zhì)數(shù)據(jù)(去除原始序列中含adaptor序列、N的比例大于10%的序列、質(zhì)量值Q≤5的堿基數(shù)占整個(gè)read的50%以上的低質(zhì)量序列)獲得高質(zhì)量干凈序列(Clean Reads)，以FASTQ文件格式存儲(chǔ)。使用短序列比對(duì)軟件SOAPaligner/SOAP2[7]將Clean Reads分別比對(duì)到參考基因序列上(允許2個(gè)堿基錯(cuò)配)。參考序列為課題組前期獲得的兩個(gè)6G和20G的地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra，注冊(cè)號(hào)SRX269425和SRX269426)合并拼接后構(gòu)建的地黃轉(zhuǎn)錄組文庫。利用唯一比對(duì)上的基因的reads數(shù)目和比對(duì)上的參考序列的總reads數(shù)計(jì)算基因的表達(dá)量，計(jì)算使用RPKM(Reads Per Kb per Million mapped reads)方法對(duì)測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度進(jìn)行歸一化，如果一個(gè)基因存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，則用該基因的最長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本計(jì)算其測(cè)序覆蓋度和表達(dá)量[8]。

1.4 差異基因篩選和功能注釋

參照Audic等[9]基于測(cè)序的差異表達(dá)基因的檢測(cè)方法，篩選兩樣本間的差異表達(dá)基因。然后對(duì)差異檢驗(yàn)的p-value作多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，通過控制FDR(False Discovery Rate)來決定p-value的域值。即FDR≤0.001且∣log2Ratio∣≥1(倍數(shù)差異不低于2倍)的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因[10]。后續(xù)分析均基于差異表達(dá)基因。Gene Ontology功能顯著性富集分析采用Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫(http：//www.geneontology.org/)，使用 Blast2GO 軟件(默認(rèn)參數(shù))將差異表達(dá)基因向數(shù)據(jù)庫的各個(gè)term映射，從而獲得該基因的GO功能分類注釋，計(jì)算每個(gè)term的基因數(shù)目。以通過Bonferroni校正之后的差異檢驗(yàn)值p-value≤0.05為閾值，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO term。通過GO功能顯著性富集分析確定差異表達(dá)基因所行使的主要生物學(xué)功能。Pathway顯著性富集分析采用 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kyoto encyclopedia of genes and genomes)，將差異表達(dá)基因向數(shù)據(jù)庫映射，并且對(duì)pathway進(jìn)行顯著性富集分析，統(tǒng)計(jì)各個(gè)pathway中基因數(shù)目及富集程度，分析方法與GO富集分析方法相同[11]。通過Pathway顯著性富集確定差異表達(dá)基因最主要參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和生化代謝途徑。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性。選取上、下調(diào)表達(dá)基因各5個(gè)差異表達(dá)基因，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組基因序列，利用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為150～300 bp。以18srRNA為定量分析的內(nèi)參基因。取對(duì)照和澇脅迫處理材料的cDNA樣品經(jīng)內(nèi)參基因PCR檢測(cè)合格后用于qRT-PCR的cDNA模板，應(yīng)用全式金熒光定量PCR試劑盒2×TransStart Green qPCR SuperMix，Passive Reference Dye的反應(yīng)體系，采用Bio-Rad公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min。取3個(gè)平行孔校正后使用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[12]。

表1 qRT-PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估和基因覆蓋度分析

經(jīng)Illumina HiSeqTM 2000測(cè)序，對(duì)照組和澇脅迫處理組分別獲得了281、603、980和301、565、012個(gè)總堿基對(duì)(Total Base Pairs)，經(jīng)過去除雜質(zhì)處理后，對(duì)照組和處理組得到的clean reads數(shù)分別為5、747、020條(占97.81%)和6、154、388條(占96.74%)，去雜后獲得的clean reads比例接近， 說明文庫構(gòu)建和測(cè)序質(zhì)量較高。在缺乏基因組的遺傳背景和注釋信息量的限制下，本實(shí)驗(yàn)比對(duì)到轉(zhuǎn)錄組的總序列數(shù)(Total Mapped Reads)分別有4、683、336和4、964、331條(占81.49%和80.66%)。其中完全比對(duì)上的基因分別有3、273、007和3、437、381條(占56.95%和55.85%)，特異匹配的分別有2、943、032和2、993、723條(占51.21%和48.64%)(表2)，能夠較好地反應(yīng)基因表達(dá)的真實(shí)

情況[13]，Clean Reads中覆蓋度達(dá)90%以上的分別占7%和6%(圖2)，說明上述樣品制備和測(cè)序質(zhì)量良好。測(cè)序飽和度分析表明，兩組樣品所檢測(cè)到的基因數(shù)都已趨于飽和。此外，測(cè)序隨機(jī)性分析顯示，reads在基因各部位分布得較為均一，說明序列分析過程中mRNA沒有降解和偏向性的影響，可以用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

表2 DGE測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

注：A.對(duì)照組；B.處理。圖2 基因覆蓋度分布

2.2 差異表達(dá)基因的篩選

根據(jù)數(shù)字基因表達(dá)譜差異基因檢測(cè)方法，以RPKM計(jì)算基因表達(dá)量，在FDR<0.005和|log2ratio(處理/對(duì)照)|≥1范圍內(nèi)篩選差異表達(dá)基因(圖3)。經(jīng)過嚴(yán)格篩選最后確定澇害脅迫處理后有7249個(gè)顯著差異表達(dá)基因。其中，上調(diào)的有2505個(gè)，其中表達(dá)量差異大于1000倍(|log2ratio|≥10)以上的基因有149個(gè)，上調(diào)倍數(shù)最高為86 939；下調(diào)的有4744個(gè)，其中表達(dá)量差異大于1000倍(|log2ratio|≥10)以上的基因有142個(gè)，下調(diào)倍數(shù)最高為22 906。大量基因的差異表達(dá)很明顯的說明，地黃在澇害脅迫下很可能進(jìn)行著活躍的基因表達(dá)活動(dòng)，但基因表達(dá)差異高度不均一，表達(dá)水平變化主要集中在16倍以內(nèi)，表達(dá)量差異較大的基因數(shù)目較少，且大多數(shù)基因表現(xiàn)出下調(diào)表達(dá)。

圖3 差異表達(dá)基因的分布和數(shù)目

2.3 差異表達(dá)基因的Gene Ontology功能顯著性富集分析

利用GO分析方法對(duì)差異基因進(jìn)行分析，通過與轉(zhuǎn)錄組比對(duì)得到已注釋差異表達(dá)基因共有5169個(gè)，在從數(shù)據(jù)庫中查詢到校正P≤1.0的3890個(gè)GO本體信息條目中，基因的分子功能(molecular function)、所處的細(xì)胞位置(cellular component)、參與的生物過程(biological process)所占比例分別為27.94%、8.76%、63.3%。以校正P≤0.05 為顯著性富集標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)差異表達(dá)基因GO注釋分類條目進(jìn)行顯著性富集分析。結(jié)果表明，其參與的生物學(xué)過程主要包括細(xì)胞加工(cellular process)、代謝過程(metabolic process)、刺激響應(yīng)(response to stimulus)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)、生物過程的監(jiān)管(regulation of biological process)、發(fā)育過程(developmental process)以及生長(zhǎng)過程(growth)等(圖4)。說明澇脅迫影響到地黃體內(nèi)的許多生理生化過程。

2.4 差異表達(dá)基因的Pathway分析

在生物體內(nèi)，基因通過相互作用網(wǎng)絡(luò)來行使生物學(xué)功能，利用KEGG數(shù)據(jù)庫中對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，通過顯著性富集來確定這些基因主要參與的生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，有利于進(jìn)一步了

圖4 差異表達(dá)基因GO功能分類

解這些基因的生物學(xué)功能。結(jié)果表明，澇脅迫下地黃差異表達(dá)基因有4276個(gè)可以被KEGG數(shù)據(jù)庫注釋，這些基因分布在126條pathway中。以P≤0.05為條件富集得到30條差異表達(dá)基因中顯著性富集的通路(pathway)。這些顯著性富集大致可以分成六類：(1)次生代謝；(2)激素代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；(3)氨基酸代謝；(4)光合作用；(5)脂類代謝；(6)轉(zhuǎn)運(yùn)體代謝。在能夠注釋到這些路徑圖中的基因中，氧化磷酸化、光合作用和細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)基因所占比例相對(duì)較低；與次生代謝相關(guān)基因占到54.5%。

2.5 數(shù)字基因表達(dá)譜的驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)升級(jí)版數(shù)字基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的可靠性，對(duì)挑選基因進(jìn)行qRT-PCR分析。檢驗(yàn)以18 s為內(nèi)參基因。結(jié)果顯示澇脅迫下這些基因表達(dá)的變化上下調(diào)趨勢(shì)一致(圖5)。說明表達(dá)譜數(shù)據(jù)可靠。

圖5 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

3 討論

澇害是重要的自然災(zāi)害之一，澇害引起的植物體內(nèi)基因的差異表達(dá)研究是植物研究熱點(diǎn)之一，近年來在擬南芥[14]、水稻[15]、番茄[16]、獼猴桃[17]等均勻澇脅迫中的基因差異表達(dá)的研究報(bào)道。作為收獲塊根的地黃，由于涉及到根系膨大，對(duì)水分更為敏感，研究澇脅迫下根部基因表達(dá)差異，顯得更為緊迫和重要。同時(shí)本研究結(jié)果也為收獲塊根類作為提供有益的借鑒。在基因組信息匱乏的情況下，作者利用轉(zhuǎn)錄組和數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)，得到了一套澇脅迫下地黃根部差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)，分析這些差異表達(dá)的基因及其功能，使我們對(duì)地黃澇害有了更深入和全面的了解。

3.1 乙醇發(fā)酵是澇害的前期事件

澇害對(duì)植物的影響主要是缺氧或低氧，植物在低氧條件下激活乙醇發(fā)酵，丙酮酸在丙酮酸脫羧酶作用下生成乙醛，然后由乙醇脫氫酶還原成乙醇。在本研究中發(fā)現(xiàn)與乙醇發(fā)酵相關(guān)的丙酮酸脫羧酶有5個(gè)上調(diào)變化，乙醇脫氫酶則以下調(diào)為主。表明在地黃澇害中乙醇發(fā)酵途徑被激活，同時(shí)分解乙醇相關(guān)酶的編碼基因呈下調(diào)表達(dá)。然而，大豆的根中丙酮酸脫酸酶和乙醇脫氫酶呈上調(diào)變化[18]，在獼猴桃中乙醇脫氫酶和丙酮酸脫酸酶基因呈顯著上調(diào)變化[17]。推測(cè)可能由于地黃為塊根植物，生長(zhǎng)發(fā)育過程顯著區(qū)別于其他直根系作物，根系對(duì)響應(yīng)澇脅迫機(jī)制也存在一定差異。

3.2 Ca信號(hào)系統(tǒng)紊亂的放大了澇害的影響

Ca2+作為植物細(xì)胞中的第二信使，越來越多的研究表明鈣離子對(duì)各種逆境的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起重要作用。植物在非生物逆境脅迫下，鈣離子的濃度會(huì)發(fā)生特異的變化，誘導(dǎo)鈣信號(hào)，鈣信號(hào)通過下游的鈣結(jié)合蛋白進(jìn)行感受和轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)一系列的反應(yīng)抵御逆境脅迫。在擬南芥、水稻、玉米、小麥中發(fā)現(xiàn)低氧能引起Ca2+快速提高，激活鈣信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。研究表明Ca2+信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)與運(yùn)輸與鈣依賴蛋白激酶和鈣調(diào)素有關(guān)，由鈣依賴蛋白完成信號(hào)傳遞，再由H+/Ca2+和Ca2+-ATP等反轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來終結(jié)逆境信號(hào)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)鈣依賴蛋白激酶2個(gè)下調(diào)表明鈣信號(hào)向下游傳遞受到影響，H+/Ca2+3個(gè)下調(diào)和Ca2+-ATP 7個(gè)下調(diào)和6個(gè)上調(diào)表明鈣信號(hào)終結(jié)逆境信號(hào)出現(xiàn)紊亂，表明Ca2+信號(hào)對(duì)地黃澇害信號(hào)的傳遞與運(yùn)輸起到重要的作用。

3.3 乙烯的產(chǎn)生使植株地上部表現(xiàn)出傷害癥狀

澇害影響植物內(nèi)源激素的合成與運(yùn)輸。澇害條件下，植物體內(nèi)乙烯含量增多[21]，誘導(dǎo)根中ACC(1-氨基環(huán)丙烷1-羧酸)合成基因促進(jìn)根中ACC的合成。ACC隨蒸騰葉流由根系向地上部分運(yùn)輸，地上部分的ACC在通氣條件下轉(zhuǎn)化成乙烯。本研究中發(fā)現(xiàn)根部ACC合成酶(乙烯合成的關(guān)鍵酶)呈極顯著的上調(diào)變化，表明澇害條件下根部合成了ACC。在根部沒有檢出ACC氧化酶的表達(dá)差異，說明ACC氧化成乙烯的過程不在根部發(fā)生，而是在地上部。乙烯在負(fù)調(diào)控地黃的生長(zhǎng)發(fā)育，使植株地上部表現(xiàn)出萎焉癥狀。

3.4 轉(zhuǎn)錄因子的錯(cuò)亂表達(dá)加劇了澇害的程度

轉(zhuǎn)錄因子是基因表達(dá)中一類重要的調(diào)控因子，通過與目標(biāo)基因啟動(dòng)子中特定的DNA序列即順式作用元件結(jié)合，激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，研究表明植物轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控植物脅迫反應(yīng)中特異基因的表達(dá)[22]。在本研究中有12個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族被發(fā)現(xiàn)參與地黃的澇害(如表3)，其中WRKY家族有36個(gè)上調(diào)，18個(gè)下調(diào)；BHLH家族有10個(gè)上調(diào)，28個(gè)下調(diào)；MYC2家族有7個(gè)上調(diào)，22個(gè)下調(diào)；MYB家族有7個(gè)上調(diào)和13個(gè)下調(diào)等，表明這些轉(zhuǎn)錄因子在地黃澇害過程中對(duì)調(diào)控基因表達(dá)起著重要作用。GRAS轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，已有報(bào)道表明其參與植物的生物脅迫和非生物脅迫相關(guān)的應(yīng)答過程[23]。目前已經(jīng)在擬南芥[24]、水稻[25]、葡萄[26]、番茄[27]等多種植物中發(fā)現(xiàn)GRAS家族基因參與作物的脅迫應(yīng)答。本研究中在地黃中發(fā)現(xiàn)有4個(gè)GRAS轉(zhuǎn)錄因子，其中3個(gè)上調(diào)和1個(gè)下調(diào)，表明GRAS轉(zhuǎn)錄因子可能參與地黃澇害的應(yīng)答過程。NAC轉(zhuǎn)錄因子也是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，已有研究表明NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆反應(yīng)中起重要調(diào)控作用[28]。本研究中發(fā)現(xiàn)有4個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子，3個(gè)上調(diào)和1個(gè)下調(diào)，表明NAC轉(zhuǎn)錄因子可能參與地黃澇害的調(diào)控。

表3 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的分布

3.5 關(guān)鍵基因的下調(diào)表達(dá)使得淹水植株生長(zhǎng)受阻

在淹水條件下地黃根部許多控制生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵基因被下調(diào)表達(dá)，使得淹水植株生長(zhǎng)受阻。如細(xì)胞周期素(cyclin)，是控制細(xì)胞分裂的關(guān)鍵蛋白。在檢測(cè)到的41個(gè)cycling的基因中有39下表達(dá)。細(xì)胞骨架蛋白myosin，與細(xì)胞的分裂、細(xì)胞的形狀有著密切的關(guān)系。在根部檢測(cè)到25個(gè)myosin基因，有24個(gè)為下調(diào)表達(dá)。淹水條件下根部分裂受阻，癥狀萎焉，與這些關(guān)鍵基因的下調(diào)表達(dá)有關(guān)。地黃根部淹水條件下的這些發(fā)現(xiàn)，在其他植物中尚未見報(bào)道。

4 結(jié)論

本研究通過數(shù)字表達(dá)譜升級(jí)版技術(shù)，在缺乏基因組，遺傳背景不是十分清楚的情況下，對(duì)照組和澇害處理組得到的Clean Reads數(shù)分別為5、747、020條和6、154、388條，通過差異表達(dá)基因篩選以及功能注釋，從中共篩選到7249個(gè)顯著差異表達(dá)基因，有2505(約35%)個(gè)基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，有4744(約65%)個(gè)下調(diào)表達(dá)的基因。為進(jìn)一步研究地黃澇脅迫網(wǎng)絡(luò)和分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

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IdentificationofKeyGenesinResponsetoWaterloggingStressinRootofRehmanniaglutinosa

WANGCuiying1，LIXinyu1，WANGXiaoran1，LIMingjie2，ZHANGZhongyi2，CHENXinjian1*

(1.SchoolofLifeSciences，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China； 2.InstituteofChineseHerbalMedicineGoodAgriculturePractice，F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou350002，China)

Objective：We detected differentially expressed genes ofRehmanniaglutinosatuberous root under submergence stress using RNA-seq technique，which would lay foundation on exploring molecular mechanisms of specific response to waterlogging stress forR.glutinosa.Methods：Wen“85-5” was used as material in this study，of which transcriptome was investigated under submergence stress using upgraded digital gene expression profiling(DGE)technique.The expression level was normalized based on Reads Per Kilobase per Million mapped reads(RPKM)method.The differentially expressed genes were selected using |log2 Ratio|≥1 and FDR adjustedp-value of <0.001 as cutoff，which were performed GO and KEGG pathway analysis.Results：A total of 7249 genes，with 2505 up-regulated(35%)and 4744 down-regulated(65%)，were shown different expression after submergence stress.Conclusion：The KEGG enrichment analysis of these differentially expressed genes revealed that numerous genes mapped to “basic metabolism”，“secondary metabolism”，“hormone signaling pathways”，and “starch and sugar metabolism pathways”.The functional analysis suggested that some genes involved in ethanol fermentation pathways and ethylene biosynthesis showed significant up-regulation，and the genes associated with calcium signaling pathways presented express perturbation.In addition，plenty of genes of transcription factors showed differential expression，e.g.，WRKY，GRAS and NAC related to stress presented up-regulation.However，transcription factors modulated development，e.g.，BHLH，MYC，BYB and MADS-box，mainly disclosed down-regulation.It was indicated that submergence stress was severely harmful to plants.

Rehmanniaglutinosa；upgraded-DGE；artificial submergence stress；differentially expressed genes；transcription factors

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30600209)

] 張重義，教授，研究方向：中藥資源生態(tài)學(xué)、藥用植物優(yōu)質(zhì)栽培，Tel:(0591)83742793,E-mail:hauzzy@163.com；陳新建，教授，研究方向：地黃連作障礙分子機(jī)制研究，Tel:(0371)63558722，E-mail:xinjianl@yahoo.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.015

2016-05-10)

*[