動物毒素多肽物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理機(jī)制△

呂秋敏，賴仞*，張?zhí)?，李軍?

(1.中國科學(xué)院 昆明動物研究所，云南 昆明 650223；2.道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京 100700)

·綜述·

動物毒素多肽物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理機(jī)制△

呂秋敏1，賴仞1*，張?zhí)?，李軍德2*

(1.中國科學(xué)院 昆明動物研究所，云南 昆明650223；2.道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京100700)

傳統(tǒng)中醫(yī)使用的有毒藥用動物在臨床中的長期實(shí)踐和成功成為現(xiàn)代藥物開發(fā)的寶貴經(jīng)驗(yàn)和資源。它們被用來治療多種心血管、神經(jīng)和免疫等相關(guān)疾病。有毒藥用動物來源的動物多肽毒素成為開發(fā)針對人類重大疾病的重要藥物候選分子。本文概述了有毒藥用動物來源的蛋白多肽藥物的結(jié)構(gòu)特征和藥理學(xué)作用機(jī)制，同時(shí)著重介紹了我國具有潛在開發(fā)和利用價(jià)值的動物毒素的研究進(jìn)展。

動物藥材；有毒動物；多肽毒素；藥理機(jī)制；藥物開發(fā)

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)特別是生物化學(xué)與分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，大量對動物毒素在分子水平的研究揭示，動物多肽毒素是現(xiàn)代創(chuàng)新藥物的寶貴資源[1-4]。常見和熟知的產(chǎn)毒動物包括刺胞動物門的水母、?？退?，軟體動物門的芋螺，環(huán)節(jié)動物門的水蛭，節(jié)肢動物門的蜘蛛、蝎子、蜈蚣、蜜蜂、胡蜂、虻和蜱類，一些甲殼類動物物種，棘皮動物門的海膽、海星，脊椎動物的魚類、蛇、蜥蜴以及哺乳動物鴨嘴獸、一些食蟲類物種、吸血蝙蝠和靈長類懶猴[1-5]。我國地域遼闊，氣候和生物高度多樣化，為開展產(chǎn)毒動物研究提供了豐富的資源[1]，見表1?！吨腥A人民共和國藥典》2015版收載的100多種藥用動物中較多是產(chǎn)毒動物。這些動物類中藥在臨床長期的實(shí)踐和成功，成為現(xiàn)代中藥開發(fā)的寶貴資源和源泉。

1 蛇毒來源的藥物

蛇毒是具有多種藥理和毒理作用的毒素分子的混合物，主要分為血液毒素和神經(jīng)毒素。其中很多成分已經(jīng)成為藥物或者具有成藥潛力[8-9]，見圖1。

1.1神經(jīng)毒與鎮(zhèn)痛

突觸后神經(jīng)毒素分為2種類型，即短鏈和長鏈神經(jīng)毒素。蛇毒神經(jīng)毒可以和神經(jīng)肌肉接頭處的乙酰膽堿受體結(jié)合，阻斷神經(jīng)信號的傳遞[10]。以眼鏡蛇毒神經(jīng)毒為原料藥研發(fā)了克洛曲片[11]。此外，神經(jīng)毒素組分制成的Cobroxin和Nyloxin等制劑，分別用于治療頑固性疼痛、惡性腫瘤疼痛和關(guān)節(jié)痛，已獲美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)[12]。

1.2去整合素與血栓

表1 中國主要產(chǎn)毒動物及蛋白多肽毒素分子多樣性

注：中國目前已知的產(chǎn)毒動物類群和大致物種數(shù)量統(tǒng)計(jì)按動物類群列出[1]；*最近的報(bào)道表明某些甲殼動物物種也擁有毒液系統(tǒng)和毒素成分[6]；**兩棲動物不是典型的產(chǎn)毒動物，但富含蛋白多肽活性分子[1，7]；ND：無可靠的數(shù)據(jù)。

蛇毒去整合素蛋白(disintegrin)家族一般具有分子量低、半胱氨酸豐富、含RGD結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)[13]。去整合素能與干擾血小板膜受體αIIbβ3與纖維蛋白原有效接觸，因此去整合素能抑制多種激動劑誘導(dǎo)的血小板聚集[14]。該類衍生物在臨床實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的效果[14]。

1.3抗菌肽(Cathelicidin)與感染

從金環(huán)蛇和眼鏡王蛇中分別克隆到cathelicidin類似物[15-16]。與人源的cathelicidin相比，眼鏡王蛇的cathelicidin溶血活性較低，而且其抗菌活性不受金屬離子及粘蛋白的影響[15]。以動物來源的抗菌肽cathelicidin-BF為模板，設(shè)計(jì)合成了抗臨床耐藥白色念球菌的優(yōu)良新型抗菌肽[17]。

1.4神經(jīng)生長因子與神經(jīng)修復(fù)

蛇毒神經(jīng)生長因子對于人們認(rèn)知該類生長因子起到了極為重要的推動作用[18]。眼鏡蛇中克隆和純化的神經(jīng)生長因子可以促進(jìn)PC12細(xì)胞和雞胚背根神經(jīng)節(jié)的生長[19]。與人源的神經(jīng)生長因子相比，它的穩(wěn)定性和活性相對較高。另外，它還可以防止棉酚造成的雄性小鼠不育[20]。

注：無下畫線為抑制型成分；有下畫線為激活型成分。圖1 蛇毒在藥物中的運(yùn)用

1.5CVF與器官移植

眼鏡蛇毒因子(CVF，cobra venom factor)可以和血漿因子B結(jié)合，從被血漿因子切割成CVF Bb和CVF Ba。Bb是一個(gè)C3/C5轉(zhuǎn)化酶，可以激活補(bǔ)體替代途徑，消耗補(bǔ)體C3[21]。

云南產(chǎn)的孟加拉眼鏡蛇蛇毒CVF(Y-CVF)由3個(gè)不同的亞基組成[22]。Y-CVF顯著抑制豬-恒河猴心臟移植的急性超排反應(yīng)，延長豚鼠-大鼠心臟移植的生存率，改善對循環(huán)補(bǔ)體的抑制[23]。眼鏡王蛇(Ophiophagushannah)蛇毒CVF被命名為OVF[24]。

1.6蛋白酶與血栓

目前分離純化得到的具有抗血栓作用的蛇毒蛋白酶大致可分為3類：類凝血酶(凝血酶樣酶)、纖維蛋白(原)溶解酶和纖溶酶原激活劑[9]，見圖2。

蛇毒類凝血酶(snakevenomthrombin-likeenzymes，SVTLEs)是蛇毒中與血漿凝血酶性質(zhì)相似的一類酶的總稱。已知的SVTLEs均由一條肽鏈組成，一般具有6個(gè)二硫鍵[9]。目前用于臨床的主要為安克洛酶(ancrod)和巴曲酶(batroxobin)。蘄蛇酶注射液是我國研制的蛇毒抗栓酶制劑，已廣泛應(yīng)用于腦血栓或靜脈血栓的治療。

蛇毒纖維蛋白(原)溶酶[fibrin(ogen)olyticenzyme，F(xiàn)LE]簡稱纖溶酶。同以往的抗栓藥物相比，纖溶酶具有起效快、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)[9]。多種蛇毒纖溶酶類溶栓藥物都已進(jìn)入臨床使用。另外，從竹葉青蛇毒中分離純化出的新型酶原激活劑TSV-PA為研制新的抗栓藥提供了新思路[25]。

1.7血管緊張素酶抑制劑

研究人員發(fā)現(xiàn)，巴西毒蛇Bothropsjararaca毒液中的一個(gè)九肽teprotide對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)具有特異的抑制作用、降壓作用[26]。以它為模板合成了一系列羧基鏈烷醇和巰基鏈烷醇的脯氨酸酯。它們均顯示了良好的ACE抑制活性，其中化合物SQ14225被開發(fā)成最早的ACE抑制藥，即卡托普利(captopril)[27]。

1.8利鈉肽

利鈉肽包括心房利鈉肽(atrialnatriureticpeptide，ANP)、腦鈉肽(brainnatriureticpeptide，BNP)和C型利鈉肽(Ctypenatriureticpeptide，CNP)[28]。利鈉肽信號系統(tǒng)的異常影響著臨床心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展，可造成不同器官和組織的損傷[29]。從眼鏡王蛇毒腺中克隆到的編碼利鈉肽Oh-NP的cDNA含有2個(gè)類似的CFGXXDRIGC結(jié)構(gòu)域，因而可翻譯后加工為2個(gè)成熟的利鈉肽分子[30]。

2 兩棲動物皮膚分泌物

兩棲動物的皮膚是其生存的重要器官。它擔(dān)負(fù)著許多生理功能，如呼吸、水分調(diào)節(jié)、溫度控制、排泄、繁殖、抵抗微生物、防御天敵等[7]，其中一些成分具有重要的應(yīng)用前景。見圖3。

圖3 兩棲動物皮膚分泌物活性成分的功能

2.1抗菌肽與感染

在兩棲動物的皮膚分泌物中，抗菌肽是所有多肽中數(shù)量和種類最多的。到目前為止，已經(jīng)有超過1900種兩棲動物皮膚抗菌肽被發(fā)現(xiàn)。這些抗菌肽分別屬于100多個(gè)家族[7]。從雙團(tuán)棘胸蛙(Paayunnanensis)的皮膚中分離得到了一個(gè)cathelicidin類的抗菌肽cathelicidin-PY[31]，具有很強(qiáng)的抗菌能力。基于已有的大量抗菌肽序列設(shè)計(jì)合成的15個(gè)氨基酸殘基的小肽LZ1表現(xiàn)出非常強(qiáng)的對痤瘡相關(guān)微生物的殺滅作用[32]。

2.2抗氧化肽

從滇蛙皮膚分泌液中發(fā)現(xiàn)了11個(gè)家族的抗氧化多肽。這些抗氧化多肽是由15～30個(gè)氨基酸組成的小肽?？寡趸嚯男蛄兄械倪€原性半胱氨酸對快速清除自由基起著關(guān)鍵作用[33]。具有抗氧化活性小肽的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)肽類的挖掘是皮膚保護(hù)、皮膚抗氧化領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)。

2.3蛙皮凝集素作為藥物輸送載體

從無指盤臭蛙皮膚中識別了一個(gè)小分子質(zhì)量的凝集素Odorranalectin。其分子質(zhì)量僅有1700Da，僅含有一對二硫鍵[34]。在小鼠模型中靜脈注射后，Odorranalectin主要結(jié)合到肝臟、脾臟和肺等器官，因此具有藥物靶向輸送載體的潛力[35]。

2.4傷口修復(fù)肽

從紅瘰疣螈皮膚中鑒定出了一條12個(gè)氨基酸殘基的強(qiáng)效皮膚修復(fù)肽Tylotoin，可以促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，從而促進(jìn)受損皮膚上皮化和肉芽組織的形成[36]。從無指盤臭蛙皮膚中鑒定了AH90。在小鼠全層皮損模型中，AH90也表現(xiàn)出強(qiáng)烈的促創(chuàng)傷愈合活性[37]。

2.5神經(jīng)毒素類似肽

從華西雨蛙皮膚分泌液中發(fā)現(xiàn)了基因編碼的神經(jīng)毒anntoxin[38]。該毒素含有60個(gè)氨基酸殘基，通過阻斷河豚毒素敏感的鈉離子通道來發(fā)揮神經(jīng)毒活性。采用蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)手段從樹蛙皮膚中發(fā)現(xiàn)了包括神經(jīng)毒素、類似蛇毒磷脂酶的多種毒素多肽與蛋白[39]，其在鎮(zhèn)痛方面的運(yùn)用還需深入研究。

3 節(jié)肢動物分泌物

3.1吸血蜱分泌物

到目前為止，已發(fā)現(xiàn)蜱能夠產(chǎn)生前列腺素、抗凝因子、免疫抑制劑、抗炎癥蛋白和抗菌肽等來克服宿主的防御反應(yīng)。從硬蜱(Amblyommahebraeum)中鑒定了一個(gè)新的凝血酶抑制劑Amblin[40]。從中華硬蜱神經(jīng)節(jié)中分離出兩種神經(jīng)肽a和b。該阿片肽類似物為首次得到的蜱類神經(jīng)肽[41]。

3.2牛虻與血栓

在長期的與宿主相互作用進(jìn)化過程中，吸血節(jié)肢動物唾液腺形成了一系列有助于適應(yīng)吸血生存的活性物質(zhì)，見圖4。

圖4 牛虻唾液腺活性成分的功能

從牛虻唾液腺中獲得了新型抗血小板集聚因子、新型免疫抑制劑多肽、凝血酶抑制劑、抗凝血的絲氨基酸蛋白酶、纖維蛋白原水解酶、三個(gè)家族的抗菌肽、透明質(zhì)酸酶、血管舒張因子、抗氧化的金屬硫蛋白九大類生物活性物質(zhì)[42-43]。這些研究部分揭示了中藥材虻蟲作為重要傳統(tǒng)抗血栓中藥的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了多種具有潛在藥用價(jià)值的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)分子。

4 ?？舅?/h2>

?？窠?jīng)毒素主要作用于細(xì)胞膜上的鈉、鉀等離子通道，通過改變通道活性而起到特定生物活性[44]。部分?？嚯念惿窠?jīng)毒素具有增強(qiáng)心肌收縮力的活性[44]。海葵Stichodactylahelianthus中的神經(jīng)毒素ShK是一種強(qiáng)烈的KV1.3通道阻斷劑，可以對自體免疫性疾病起到免疫調(diào)節(jié)作用[45]，見圖5。

圖5 具運(yùn)用前景的海葵毒素

5 芋螺毒素

全世界大約有5萬多種芋螺毒素。其相對分子質(zhì)量小，結(jié)構(gòu)新穎，對離子通道、膜受體具有高度選擇性和親和力，因而其具有廣闊的應(yīng)用前景和潛在的開發(fā)價(jià)值[46-47]。其中，很多作用靶點(diǎn)直接與痛疼有關(guān)，見圖6。多個(gè)大型制藥公司都在進(jìn)行芋螺毒素類新藥的開發(fā)工作[48]。

圖6 芋螺毒素的作用途徑

5.1α-芋螺毒素

α-芋螺毒素結(jié)合到nAChRs的α-subunits上，阻止了乙酰膽堿及其他激動劑的結(jié)合，抑制突觸(神經(jīng)元或神經(jīng)肌肉)連接處的信號傳導(dǎo)，影響動作電位的變化。Metabolic Pharmaceuticals公司合成了16個(gè)氨基酸殘基的α-芋螺毒素Vc1.1(ACV1)，已進(jìn)入Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)[49]。

5.2ω-芋螺毒素

ω-芋螺毒素由24～30個(gè)氨基酸組成，是一類作用于鈣離子通道(CaV)的芋螺毒素。ω-芋螺毒素GVIA、MVIIA和CVID選擇性地作用于N-type CaV通道，顯示了良好的神經(jīng)保護(hù)和鎮(zhèn)痛特性[50]。MVIIA是第一種進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的ω-芋螺毒素。CVID(AM336)也已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。

5.3μ-芋螺毒素

μ-芋螺毒素家族均為鈉離子通道拮抗劑，而δ-芋螺毒素也可抑制鈉通道。Cognetix公司將16個(gè)氨基酸組成的Contulakin-G(CGX-1160)開發(fā)為一種用于治療手術(shù)后短期疼痛的鎮(zhèn)痛藥，正在進(jìn)行Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)[51]。

5.4其他竽螺毒素

Conantokins是一類競爭性抑制谷氨酸激活的多肽，可作用于不同的人腦NMDA受體類型。Conantokin-G衍生物(CGX-1007)能控制頑固性癲癇的發(fā)作，目前已進(jìn)入Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)[52]。

ρ-Conotoxin和χ-Conotoxin中的ρTIA和χ-MrIA已被證明分別調(diào)節(jié)α1-adrenoreceptor和去甲腎上腺素神經(jīng)元的轉(zhuǎn)運(yùn)[53]。Xen2174是Xenome公司開發(fā)的一種已進(jìn)入Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)的通過鞘內(nèi)注射來減輕神經(jīng)性疼痛的藥物[54]。

6 氯離子通道蝎毒素

蝎毒素一般含3或4對二硫鍵，可以選擇性地與動物可興奮細(xì)胞膜上的鈉、鉀、鈣、氯離子通道結(jié)合，影響離子通道的狀態(tài)，成為研究離子通道生理作用和功能定位的重要工具之一[55]。氯離子通道蝎毒素Chlorotoxin(Cltx)可阻斷小電導(dǎo)氯離子通道，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲與轉(zhuǎn)移，見圖7。Cltx不僅能阻斷小電導(dǎo)氯電流，而且可特異靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。His-Cltx可以明顯的降低人基質(zhì)蛋白酶2(MMP-2)的膠原酶活性，從而阻止神經(jīng)膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲[56]。Cltx被FDA批準(zhǔn)進(jìn)入I/II期臨床實(shí)驗(yàn)。

圖7 氯離子通道蝎毒素的腫瘤抑制作用

7 蜥蜴毒素

Exenatide(exendin-4)是大毒蜥在進(jìn)食時(shí)所分泌唾液中的類GLP-1物質(zhì)的人工合成物[57]。美國Amylin和禮來制藥公司共同開發(fā)的新藥獲FDA批準(zhǔn)。Exenatide具有刺激胰島β細(xì)胞的增殖與分化、降低胃排空的速率、促進(jìn)飽食感等多種生理活性[58]，其成為治療2型糖尿病比較理想的藥物。Exenatide結(jié)合到與G蛋白偶聯(lián)的特異性受體上以后，引起胰島素釋放[59]。見圖8

圖8 蜥蜴來源的exendin-4及其作用

8 蜘蛛毒素

蜘蛛毒液中的毒素可作用于靶細(xì)胞膜上的各種離子通道，如鉀、鈣、鈉、酸敏感通道等[2]。

部分蜘蛛多肽毒素對于通道亞型也有一定的選擇性[60]。國際上已有多種蜘蛛多肽毒素作為先導(dǎo)分子被用于開發(fā)治療多種疾病的藥物，如心血管疾病、慢性疼痛、炎癥及性功能障礙等[61]。見圖9。

圖9 部分具有運(yùn)用潛力的蜘蛛毒素

虎紋鎮(zhèn)痛肽-I(HWAP-I)是一種N-型電壓門控鈣離子通道(VGCC)專一性抑制劑，在幾種疼痛動物模型中均有明顯的鎮(zhèn)痛活性[62]。HWAP-I在大鼠急性內(nèi)臟疼痛模型中具有明顯鎮(zhèn)痛效應(yīng)[63]。

虎紋捕鳥蛛胰蛋白酶抑制劑HWTX-XI是第一個(gè)從蜘蛛毒液中分離的具有Kunitz型結(jié)構(gòu)模體的胰蛋白酶抑制劑，在治療與胰蛋白酶相關(guān)的疾病中有較好的應(yīng)用前景[64]。在小鼠急性胰腺炎模型中，HWTX-XI也表現(xiàn)出了優(yōu)于抑肽酶和烏司他丁的治療效果[65]。

Lycosin-I為從新疆穴居狼蛛毒液中分離的雙親性陽離子細(xì)胞毒活性肽，具有抗菌活性和抗癌活性[66]。Lycosin-I可與腫瘤細(xì)胞膜結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過線粒體死亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和上調(diào)p27抑制細(xì)胞增殖[67]。

9 蜈蚣毒素

蜈蚣的獵物包括脊椎動物和無脊椎動物，如蝙蝠、老鼠、兩棲類、爬行類和昆蟲[68]。利用活性跟蹤的分離方法從少棘蜈蚣中純化了10個(gè)神經(jīng)毒素[69]。運(yùn)用質(zhì)譜分析又發(fā)現(xiàn)了196個(gè)非重復(fù)的多肽[70]。金頭蜈蚣來源的μ-SLPTX-Ssm6a對離子通道1.7亞型(NaV1.7)具有高度選擇性。通過小鼠鎮(zhèn)痛動物模型研究表明，μ-SLPTX-Ssm6a具有比嗎啡更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用[71]。

少棘蜈蚣多肽神經(jīng)毒素RhTx能誘導(dǎo)野生型小鼠產(chǎn)生劇烈的急性疼痛[72]。RhTx可以利用電場力和疏水力與通道的孔區(qū)轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行直接的相互作用，并且通過影響TRPV1的熱激活門來控過程激活通道[72]。見圖10。

注：帶狀示意TRPV1的主鏈結(jié)構(gòu)。圖10 蜈蚣多肽RhTx與TRPV1離子通道孔外區(qū)結(jié)合激活通道

TRPV1已經(jīng)被作為鎮(zhèn)痛藥QX-314或細(xì)胞毒素Ca2+抑制神經(jīng)元的靶點(diǎn)來進(jìn)行研究[73]。RhTx和基于RhTx的衍生物可能會開啟一條嶄新的控制痛覺感受器的途徑。

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SubstanceBasesandPharmacologicalMechanismsofAnimalPeptideToxins

LYU Qiumin1，LAI Ren1*，ZHANG Tian，LI Junde2*

(1.Kunming Institute of Zoology，Chinese Academy of science，Kunming 650223，China；2.State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs，National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China)

The long history and successful practice of utilization of venomous animals in traditional Chinese medicines provide valuable experience and resources for modern drug development.The venomous animal medicines are used to treat many cardiovascular，nerve and immunologic diseases.Peptide toxins from venomous animals have become important targets for the development of drugs for major human diseases.The structural features and pharmacological mechanisms of protein/peptide drugs from animal toxins are reviewed.At the same time，the progress on animal toxins with potential druggability in China is stressed.

Medicinal materials of animal-derivative；venomous animals；peptide toxins；mechanism；drug development

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372208，81073000)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2016FA006)

] 賴仞，研究員，研究方向：天然活性多肽結(jié)構(gòu)與功能及新藥研發(fā)，E-mail：rlai@mail.kiz.ac.cn；李軍德，研究員，研究方向：藥用動物資源與動物藥材研究，E-mail：jundeli99@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.026

2016-09-02)

*[