蟬蛻止咳祛痰平喘有效部位篩選△

江泓，楊煬，陳胡蘭，傅超美，鄧赟，張梅

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137)

·基礎(chǔ)研究·

蟬蛻止咳祛痰平喘有效部位篩選△

江泓，楊煬，陳胡蘭*，傅超美，鄧赟，張梅

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都611137)

目的：通過研究蟬蛻不同提取部位對小鼠、豚鼠的止咳祛痰平喘作用，對蟬蛻有效部位進(jìn)行篩選。方法：蟬蛻使用70%乙醇回流提取，所得浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得各部分浸膏，受試動物隨機分為對照組、陽性藥組及不同提取部位組，采用小鼠氨水引咳法篩選止咳有效部位，小鼠酚紅氣管段法篩選祛痰有效部位，豚鼠整體藥物引喘法篩選出平喘有效部位。結(jié)果：與對照組比較，蟬蛻70%乙醇提取物水部位有明顯止咳作用(P<0.05)，正丁醇部位有祛痰作用(P<0.01)，乙酸乙酯、水部位具有明顯平喘作用(P<0.01)。結(jié)論：蟬蛻的止咳有效部位是水部位，祛痰部位為正丁醇部位，平喘部位是乙酸乙酯及水部位。

蟬蛻；止咳；祛痰；平喘；有效部位

蟬蛻是我國民間常用動物藥之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，稱蚱蟬或柞蟬，主小兒驚癇、夜啼、瘨病、寒熱，生楊柳之上。根據(jù)2015年版《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)記載，蟬蛻為蟬科昆蟲黑蚱CryptotympanapustulataFabricius的若蟲羽化時脫落的皮殼，其味甘、性寒，有疏散風(fēng)熱、利咽、透疹、明目退翳、解痙的作用,用于風(fēng)熱感冒、咽痛音啞、麻疹不透、風(fēng)疹瘙癢、目赤翳障、驚風(fēng)抽搐、破傷風(fēng)[1]?！吨腥A臨床中藥學(xué)》謂其能“止咳平喘，主治咳嗽氣喘證”[2]。蟬蛻主產(chǎn)于山東等地，在全國大部分地區(qū)均有生產(chǎn)[3]。蟬蛻在臨床應(yīng)用歷史中被證明具有良好止咳祛痰平喘功效，但此前對其藥效學(xué)研究多使用水提或醇提的總提取物，未見關(guān)于蟬蛻止咳祛痰平喘有效部位的研究。實驗分別以小鼠氨水引咳法、酚紅氣管段法及豚鼠整體藥物引喘法考察蟬蛻不同提取部位的止咳、祛痰、平喘作用，為進(jìn)一步研究工作提供了依據(jù)。

1 材料

1.1動物

KM種小鼠，體重18～22g，雌雄兼用；幼年豚鼠，體重200～250g，雌雄兼用，小鼠及豚鼠均購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司，許可證號為SCXK(川)2014-028。

1.2藥物及試劑

蟬蛻購自成都荷花池中藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室嚴(yán)鑄云教授鑒定符合《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)；咳必清片(國藥集團(tuán)容生制藥有限公司，批號：15011412)；氨茶堿注射液(吉林省華牧動物保健品有限公司，批號：150528)；其余試劑均為分析純。

1.3儀器

RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，F(xiàn)W-100超速萬能粉碎機(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，YLS-8A多功能誘咳引喘儀(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司)，721紫外可見分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

2 方法

2.1藥物制備

2.1.1蟬蛻不同提取部位的制備 稱取潔凈、干燥蟬蛻粉末(過40目篩)200g，于70%乙醇中充分浸泡12h，按3h/次的提取時間加熱回流提取3次，提取所用溶劑為藥材5倍量，提取液過濾后減壓回收溶劑，所得浸膏加水混懸，然后依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，得到石油醚部位(0.04g)、乙酸乙酯部位(1.17g)、正丁醇部位(0.97g)及水部位(1.75g)。

2.1.2蟬蛻水提物制備 稱取潔凈、干燥蟬蛻粉末(過40目篩)20g，加入200mL水，充分浸泡12h后加熱煮沸1h，過濾，再繼續(xù)分別用100mL水煎煮2次，合并濾液得到蟬蛻水煎液，干燥后得干浸膏0.89g。

2.2蟬蛻止咳祛痰平喘有效部位研究

2.2.1蟬蛻不同提取部位對氨水引咳小鼠的影響 取昆明種小鼠，放入YLS-8A多功能誘咳引喘儀內(nèi)，恒速、恒量均勻噴入霧化氨水(25%～28%氫氧化銨)5s，噴霧完成后立即取出小鼠，觀察小鼠從接受噴霧開始到出現(xiàn)第一次咳嗽的潛伏期及2min內(nèi)咳嗽次數(shù)。在90s內(nèi)不出現(xiàn)咳嗽的小鼠作為不合格者應(yīng)舍棄。篩選合格的小鼠，于篩選完成24h后按性別、體重隨機分為7組：蟬蛻醇提物石油醚部位組、蟬蛻醇提物乙酸乙酯部位組、蟬蛻醇提物正丁醇部位組、蟬蛻醇提物水部位組、蟬蛻水煎液組、咳必清陽性對照組以及空白對照組(0.9%氯化鈉溶液)，每組10只，各組均按0.8g生藥·kg-1的劑量灌胃(ig)給藥5d，于末次給藥1h后，分別將小鼠放入誘咳儀中按前法接受氨水噴霧引咳5s，記錄小鼠從接受噴霧引咳開始到出現(xiàn)咳嗽的潛伏期以及2min內(nèi)的咳嗽次數(shù)，觀察比較各給藥組與對照組之間止咳作用的差異[4]。

2.2.2蟬蛻不同提取部位對小鼠祛痰作用 精密稱取酚紅1mg，用1mol氫氧化鈉和0.9%氯化鈉溶液按1∶15比例配制而成的溶液(A液)溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用A液洗滌燒杯，洗滌液轉(zhuǎn)移至容量瓶中，重復(fù)3次，定容，標(biāo)注為B液，備用。分別精密量取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2mL的B液于5mL的容量瓶中，用A液定容，作為酚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液。將酚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液以A液為空白，于紫外分光光度計558nm處測定其OD值，每個樣品重復(fù)測定3次，取平均值。以O(shè)D值的平均值(Y)對酚紅濃度(X，mg·L-1)進(jìn)行線性回歸，得酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.3205X+0.0296，r=0.999。

參照文獻(xiàn)方法[5-6]加以改進(jìn)，70只昆明種小鼠隨機分為7組：蟬蛻醇提物石油醚部位組、蟬蛻醇提物乙酸乙酯部位組、蟬蛻醇提物正丁醇部位組、蟬蛻醇提物水部位組、蟬蛻水煎液組、氯化銨陽性對照組以及空白對照組(0.9%氯化鈉溶液)，每組10只。各組均按0.8g生藥·kg-1的劑量ig給藥5d，末次給藥1h后，小鼠均接受腹腔注射2.5%的酚紅0.9%氯化鈉溶液0.5mL，于注射酚紅后0.5h處死動物，分離氣管，用手術(shù)線分別在甲狀腺軟骨下緣處和氣管分盆處結(jié)扎，自結(jié)扎處剪取氣管，置于氫氧化鈉溶液和0.9%氯化鈉溶液按照1∶15的比例配制成的溶液3mL中浸泡過夜。次日，取上清透明紅色液體于紫外分光光度計在波長558nm處測定OD值，每個樣品重復(fù)測定3次，取其平均值，根據(jù)酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線及小鼠氣管質(zhì)量，計算出小鼠平均每克氣管組織酚紅分泌量，比較各個給藥組與對照組之間祛痰作用的差異。

2.2.3蟬蛻不同提取部位對哮喘豚鼠影響 取體質(zhì)量200～250g幼年豚鼠，雌雄各半，放入YLS-8A多功能誘咳引喘儀內(nèi)，以恒速、恒量噴入致喘劑(新制2%氯化乙酰膽堿和0.1%磷酸組胺等體積混合液)30s，觀察動物自接受噴霧到出現(xiàn)哮喘狀態(tài)(以出現(xiàn)喘息性抽搐為判斷標(biāo)準(zhǔn))的潛伏期。哮喘潛伏期在2min內(nèi)的豚鼠為敏感動物，選擇其作為試驗動物。于篩選完成24h后將合格豚鼠隨機分為蟬蛻醇提物石油醚部位組、蟬蛻醇提物乙酸乙酯部位組、蟬蛻醇提物正丁醇部位組、蟬蛻醇提物水部位組、蟬蛻水煎液組、氨茶堿陽性對照組以及空白對照組(0.9%氯化鈉溶液)7組，每組5只。在完成篩選24h后各組均按1g生藥·kg-1的劑量ig給藥5d。于末次給藥1h后按前法重新進(jìn)行噴霧引喘30s，觀察給藥后豚鼠產(chǎn)生哮喘潛伏期(潛伏期大于6min者均按360s計算)，比較各給藥組平喘作用[7]。

3 結(jié)果

3.1蟬蛻不同提取部位對氨水引咳小鼠的影響

蟬蛻水煎液組能明顯延長小鼠咳嗽潛伏期，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，水部位、水煎液及咳必清組小鼠2min內(nèi)咳嗽次數(shù)明顯減少，與對照組比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，表明蟬蛻水煎液及乙醇提取物對氨水引咳小鼠有治療作用，見表1。

表1 蟬蛻不同提取部位對小鼠止咳作用的影響

注：與對照組比較，*P<0.05。

3.2祛痰實驗

蟬蛻正丁醇部位和乙酸乙酯部位給藥組小鼠氣管酚紅排泌量明顯提高，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(正丁醇P<0.01，乙酸乙酯P<0.05)，提示蟬蛻乙醇提取物正丁醇、乙酸乙酯部位有一定的祛痰作用，見表2。

3.3平喘實驗

蟬蛻水煎液及乙醇提取物水、乙酸乙酯部位、氨茶堿給藥組能明顯延長豚鼠哮喘潛伏期，與對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明蟬蛻乙醇提取物中水、乙酸乙酯部位以及蟬蛻水煎液對哮喘豚鼠具有一定緩解作用，其中以水煎液作用最強，見表3。

表2 蟬蛻不同提取部位對小鼠氣管酚紅排泌量的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；下同。

表3 蟬蛻不同提取部位對豚鼠哮喘潛伏期的影響

4 討論

通過對蟬蛻不同提取部位的活性進(jìn)行篩選實驗，為蟬蛻臨床發(fā)揮止咳祛痰平喘功效提供了一定的科學(xué)依據(jù)，彌補了此前主要使用蟬蛻水煎液、乙醇總提取物為研究對象對蟬蛻止咳平喘進(jìn)行藥效學(xué)研究的不足，在一定程度上明確了蟬蛻止咳平喘物質(zhì)基礎(chǔ)，為對蟬蛻進(jìn)行深入研究、開發(fā)提供了理論依據(jù)。實驗結(jié)果表明，蟬蛻水煎液及乙醇提取后的水部位有良好止咳作用，乙醇提取后的正丁醇部位有一定祛痰作用，水煎劑以及水、乙酸乙酯部位對乙酰膽堿和磷酸組胺引起的哮喘有良好的緩解作用，上述部位為蟬蛻止咳、祛痰、平喘的主要有效部位，蟬蛻止咳祛痰平喘有效部位并不局限于某一特定部位，表明蟬蛻的有效成分不是某單一化合物，其藥理作用是由多個部位、多種化合物協(xié)同發(fā)揮起效。此前對蟬蛻水煎液的止咳祛痰平喘作用曾有研究，發(fā)現(xiàn)其有明顯止咳祛痰平喘的藥理作用[8]，與本實驗結(jié)果相符，且在本實驗中，蟬蛻水煎液藥效較其乙醇提取后的各部位更強；在各乙醇提取部位中，屬水部位作用較強，而它也是蟬蛻最重要的止咳平喘作用的有效部位，說明蟬蛻止咳平喘有效成分主要為水溶性、大極性成分。根據(jù)此前關(guān)于蟬蛻化學(xué)成分的研究報道，動物藥蟬蛻中含有多種復(fù)雜大分子化合物，其中包括大量蛋白質(zhì)類成分，此外還有多種氨基酸、微量元素等成分。作為混合提取物其成分復(fù)雜，目前未見對其提取物的止咳平喘活性成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，但在一些針對其他藥物的止咳平喘活性成分的研究中發(fā)現(xiàn)，某些蛋白質(zhì)和氨基酸對治療哮喘和氣道高反應(yīng)有藥理活性，具有一定平喘作用[9-10]，這為蟬蛻有效成分的研究提供了靈感，故后續(xù)實驗將以蟬蛻大分子、蛋白質(zhì)的分離為主，以期對蟬蛻止咳平喘活性成分進(jìn)行分離、純化，并實現(xiàn)對蟬蛻治療咳嗽和哮喘作用機制的探討研究。

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Study on Active Fraction of Cicadae Periostracum on Relieving Cough and Asthma

JIANG Hong，YANG Yang，CHEN Hulan*，F(xiàn)U Chaomei，DENG Yun，ZHANG Mei

(School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137,China)

Objective：To compare the cough relieving，sputum reducingand asthma relieving actionsof different of Cicadae Periostracumextracts.Methods：The antitussive，expectorant and anti-asthmatic effects were observed by using cough mice caused by ammonia，tracheal phenol red test and asthma guinea-pigs caused by acetylcholine chloride and histamine phosphate.Results：Water decoction and water fraction showed acough-relieving action.n-butanol fraction exhibited an expectorant effect，and water decoction，ethyl acetate extract and water fraction showed ananti-asthma action.Conclusion：The water fraction is the active part on cough relieving，n-butanol part is the effective part on reducing sputum，and the water fraction and ethyl acetate extractare active parts for relieving asthma.

Cicadae Periostracum；antitussive effect；expectorant effect；anti-asthmatic effect；effective part

四川省科技支撐計劃項目(2013SZZ016)；四川省科技廳“中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究與創(chuàng)新中藥發(fā)現(xiàn)四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊”項目(2016TD0006)

] 陳胡蘭，博士，教授，研究方向：中藥化學(xué)；Tel：(028)61800231，E-mail：hlan999@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.011

2016-02-19)

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