中藥材規(guī)范化種植茯苓化學成分研究△

鄭艷，楊秀偉

(北京大學 天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室 藥學院 天然藥物學系，北京 100191)

·基礎(chǔ)研究·

中藥材規(guī)范化種植茯苓化學成分研究△

鄭艷，楊秀偉*

(北京大學 天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室 藥學院 天然藥物學系，北京 100191)

目的：研究中藥材規(guī)范化種植茯苓的化學成分。方法：采用硅膠、高效液相色譜等柱色譜方法進行分離純化，通過化合物的譜學數(shù)據(jù)鑒定其結(jié)構(gòu)。結(jié)果：從茯苓菌核95%乙醇水溶液提取物中分離鑒定了14個化合物，分別為麥角甾-7，22-二烯-3β-醇(1)、3-表去氫土莫酸(2)、3-O-乙?；?16α-羥基栓菌酸(3)、豬苓酸C(4)、去氫茯苓酸(5)、茯苓酸(6)、6α-羥基豬苓酸C(7)、去氫土莫酸(8)、土莫酸(9)、29-羥基豬苓酸C(10)、茯苓羊毛脂酮A(11)、3β，16α-二羥基羊毛脂-7，9(11)，24-三烯-21-酸(12)、25-羥基茯苓酸(13)、茯苓羊毛脂酮B(14)。結(jié)論：中藥材規(guī)范化種植茯苓中具有豐富的特征性羊毛脂烷型三萜，為茯苓的主要生物活性物質(zhì)基礎(chǔ)。

中藥材規(guī)范種植；茯苓；多孔菌科；羊毛脂烷型三萜；生物活性物質(zhì)基礎(chǔ)

傳統(tǒng)藥食兩用中藥茯苓系多孔菌科真菌Poriacocos(Schw.)Wolf.的干燥菌核。茯苓可用于中藥配方和100多種中成藥原料，還用于歷代宮廷御膳及民間食品如茯苓餅、白雪糕、云片、茯苓酒、茯苓點心、長壽掛面等。據(jù)全國中藥資源普查資料顯示，20世紀90年代以前，茯苓野生蘊藏量約500萬kg，家種500～1000萬kg。我國每年藥用、食用和出口需求量約1000～1300萬kg，僅次于甘草、當歸用量，為藥用量較大的中藥之一。在我國加入世界貿(mào)易組織后有140多個國家接受中醫(yī)藥，供需矛盾近年來迅速擴大，用量以10%～20%幅度增加。為滿足公眾對中藥的需求和延長中藥產(chǎn)業(yè)鏈、保證其質(zhì)量，“九五”期間及以后，我國政府大力、積極引導建立國家中藥材規(guī)范化種植(GAP)基地，在湖北省羅田縣九資河示范建立了茯苓規(guī)范化種植基地，并制定了相應(yīng)的規(guī)范化種植標準操作規(guī)程(SOP)[1]。已有許多研究結(jié)果表明茯苓藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是其含有的羊毛脂烷類的三萜[2-5]，且中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥繼承、發(fā)展、創(chuàng)新的關(guān)鍵科學問題[6]。為保證茯苓藥材的質(zhì)量和為進一步優(yōu)化其SOP提供科學依據(jù)，本文對湖北省羅田縣九資河中藥材規(guī)范化種植基地栽培的茯苓的物質(zhì)基礎(chǔ)進行了研究，分離出14個化合物，根據(jù)其理化常數(shù)、質(zhì)譜(MS)和核磁共振波譜(NMR)數(shù)據(jù)分別鑒定為麥角甾-7，22-二烯-3β-醇(ergosta-7，22-dien-3β-ol，1)、3-表去氫土莫酸(3-epidehydrotumulosic acid，2)、3-O-乙?；?16α-羥基栓菌酸(3-O-acetyl-16α-hydroxytrametenolic acid，3)、豬苓酸C(polyporenic acid C，4)、去氫茯苓酸(dehydropachymic acid，5)、茯苓酸(pachymic acid，6)、6α-羥基豬苓酸C[6α-hydroxypolyporenic acid C；3-oxo-6，16α-dihydroxy-lanosta-7，9(11)，24(31)-trien-21-oic acid，7]、去氫土莫酸(dehydrotumulosic acid，8)、土莫酸(tumulosic acid，9)、29-羥基豬苓酸C(29-hydroxypolyporenic acid C，10)、茯苓羊毛脂酮A(poriacosone A，11)、3β，16α-二羥基羊毛脂-7，9(11)，24-三烯-21-酸[3β，16α-dihydroxylanosta-7，9(11)，24-trien-21-oic acid，12]、25-羥基茯苓酸(25-hydroxypachymic acid，13)、茯苓羊毛脂酮B(poriacosone B，14)。前文報道了化合物10[7]、11[8]、13[7]和14[8]的詳細結(jié)構(gòu)鑒定，本文報道其他化合物詳細的結(jié)構(gòu)鑒定。

1 儀器與材料

XT-4A型顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司，北京)，溫度計未校正；Thermo Nicolet Nexus 470型傅里葉紅外光譜儀(Thermo Nicolet Corporation，USA)；PERKIN-ELMER 243B旋光儀(Perkin Elmer Inc.，Wellesley，Massachusetts，USA)；Jasco J-810圓二色散光譜儀(JASCO Corporation，Tokyo，Japan)；MDS SCIEX API QSTAR型質(zhì)譜儀(ESI-TOF-MS；Applied Biosystems/MDS Sciex.，F(xiàn)oster，CA，USA)和Finnigan TRACE 2000型質(zhì)譜儀(EI-MS；Thermo Finnigan Inc.，San Jose，CA，USA)；Varian INOVA-500型超導核磁共振儀(Varian Corporation，Palo Alto，CA，USA)，四甲基硅烷為內(nèi)標。半制備高效液相色譜(HPLC)儀(Dionex Co.，CA，USA)，色譜柱為Phenomenex Prodigy ODS(250 mm×21.2 mm，10 μm；Phenomenex Inc.，Torrance，CA，USA)。GF254薄層色譜(TLC)硅膠板分別為青島海洋化工廠(青島，中國)和Merck公司(Darmstadt，Germany)產(chǎn)品；200～300目柱色譜用硅膠(青島海洋化工廠)。分析純乙醇、甲醇(MeOH)、乙酸乙酯(EtOAc)、三氯甲烷(CHCl3)、丙酮、環(huán)己烷(北京化工廠)。

實驗材料茯苓菌核采自湖北省羅田縣九資河茯苓GAP基地，經(jīng)北京大學藥學院楊秀偉教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf.。憑證標本存放在北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室。

2 提取與分離

干燥的茯苓菌核粗粉10.5 kg用95%乙醇水回流提取5次，時間分別為2、1、1、1、1 h；合并提取液、減壓回收溶劑，得乙醇提取浸膏130.7 g(收率為1.24%，下同)。取此浸膏加1300 mL甲醇混懸后用2倍量的環(huán)己烷萃取7次，合并萃取液、減壓回收萃取劑，得環(huán)己烷萃取物16.2 g(0.15%)。將殘留甲醇液減壓蒸干后得到的浸膏分散于1000 mL水中，依次用2倍量EtOAc和水飽和的正丁醇各萃取5次，得EtOAc萃取物36.8 g(0.35%)、正丁醇萃取物17.2 g(0.16%)和萃取后的水溶性部分60.5 g(0.58%)。

將環(huán)己烷萃取物16.2 g用硅膠(200～300目)進行柱色譜分離，環(huán)己烷-EtOAc(49∶1→30∶1→10∶1→5∶1→3∶1→2∶1→1∶1→0∶1，V/V)梯度洗脫，每100 mL為1個流分，共得到151個流分。所得流分經(jīng)硅膠TLC檢測，相似流分合并后，共得到5個組分(A～E)。組分A(Fr.62～69)再經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜純化，環(huán)己烷-EtOAc梯度洗脫，將析出的結(jié)晶以甲醇重結(jié)晶，得到化合物1(40 mg)；組分B(Fr.85～89)再經(jīng)硅膠柱色譜純化，環(huán)己烷-EtOAc(5∶1)洗脫和甲醇重結(jié)晶，得到一無色針晶，以半制備HPLC分離，流動相為MeOH-H2O-HCOOH(76∶24∶0.05)，得到化合物2(18 mg)。

將EtOAc萃取部分浸膏36.8 g用硅膠(200～300目)柱色譜分離，CHCl3-MeOH(30∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1→0∶1)梯度洗脫，每50 mL為一流分，共得到258個流分。洗脫液經(jīng)硅膠TLC檢測，相似流分合并后，共得到5個組分(A～E)。組分A(Fr.6)經(jīng)甲醇重結(jié)晶后為無色針狀結(jié)晶，經(jīng)半制備HPLC純化(MeOH-H2O-HCOOH=80∶20∶0.05)，分別得到化合物3(13 mg)和4(24 mg)。組分B(Fr.7～10)經(jīng)硅膠柱色譜分離，CHCl3-EtOAc(3∶1)洗脫，得到結(jié)晶狀物質(zhì)；甲醇重結(jié)晶后經(jīng)半制備性HPLC分離純化(MeOH-H2O-HCOOH=80∶20∶0.05)，分別得到化合物5(90 mg)和6(740 mg)。組分C(Fr.22～46)反復(fù)經(jīng)硅膠柱色譜分離純化，甲醇重結(jié)晶，得到化合物7(16 mg)。組分D(Fr.100～150)反復(fù)經(jīng)硅膠柱色譜分離純化，甲醇重結(jié)晶，將得到的無色結(jié)晶以半制備性HPLC分離純化(MeOH-H2O-HCOOH=75∶25∶0.06)，分別得到化合物8(90 mg)和9(44 mg)。組分E(Fr.151～200)反復(fù)經(jīng)硅膠柱色譜分離純化后再經(jīng)半制備性HPLC(MeOH-H2O-HCOOH=73∶27∶0.05；60∶40∶0.05)純化，分別得到化合物10(11 mg)、11(12 mg)、12(10 mg)、13(12 mg)和14(8 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物10[7]、11[8]、13[7]和14[8]的詳細結(jié)構(gòu)鑒定見前報。

表1 化合物2～6、8、9和12的1H-NMR數(shù)據(jù)(500 MHz，C5D5N)

表2 化合物2～9和12的13C-NMR數(shù)據(jù)(125 MHz，C5D5N)

4 討論

茯苓分布于中國、韓國、日本、加拿大、美國和澳大利亞等國，中國除東北、西北西部、內(nèi)蒙古、西藏外均有分布。由于它突出的藥用和食用價值及其可栽培性[16-17]，引起了世界各國的廣泛重視。已有研究結(jié)果表明，茯苓具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗炎、抗衰老等多方面的藥理作用[18]，茯苓提取物及含有的豬苓酸C具有增強巨噬細胞產(chǎn)生集落刺激因子的作用，有望在臨床上治療白細胞下降[12]。茯苓含有化學結(jié)構(gòu)特征性強的羊毛脂型三萜[18-21]，為主要化學成分。43批次市售茯苓樣品分析結(jié)果表明，有20個共有成分[20]，包括化合物2～6，8，9，茯苓新酸(poricoic acid)BM、E，去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)和去氫栓菌酸(dehydrotrametenolic acid)；體外人源腸Caco-2細胞單層模型預(yù)測化合物2、4[22]、6[23]、7[22]可經(jīng)腸吸收轉(zhuǎn)運進入體內(nèi)。給大鼠灌胃茯苓提取物，在血漿中僅能檢測到化合物6，但在尿液中除可檢測到化合物6外，還能檢測到茯苓新酸A、B、G、HM，25-羥基茯苓新酸H(25-hydroxyporicoic acid H)和26-羥基茯苓新酸DM(26-hydroxyporicoic acid DM)[21]；給大鼠灌胃化合物6，表現(xiàn)出良好的血漿藥代動力學性質(zhì)[24]；化合物8在大鼠體外肝微粒體的生物轉(zhuǎn)化研究中可轉(zhuǎn)化為化合物5和9[25]?；谥兴庴w內(nèi)過程行為已成為中藥有效成分和有效效應(yīng)物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)策略之一[26]。上述這些研究結(jié)果充分證明茯苓中某些羊毛脂型三萜成分可吸收進入體內(nèi)，發(fā)揮生物學作用。

20世紀70年代以來，福建、廣東、廣西、云南進行了茯苓的大量引種栽培，近年湖南、四川、浙江、貴州等均有迅速發(fā)展；“九五”末期，湖北省承擔了“茯苓規(guī)范化種植研究”國家課題[27-28]，實現(xiàn)了茯苓的規(guī)?；N植，“茯苓規(guī)范化種植基地優(yōu)化升級及系列產(chǎn)品綜合開發(fā)研究”亦列入“十二五”國家科技支撐計劃，并于2015年8月14日通過科技部項目驗收。茯苓產(chǎn)業(yè)在福建和湖南亦得到很大程度的發(fā)展。但是，都缺乏與生物活性相關(guān)聯(lián)的全面綜合指標性成分質(zhì)量評價的客觀標準。為此，本文研究了湖北省羅田縣中藥材規(guī)范化種植基地栽培茯苓的物質(zhì)基礎(chǔ)，明確了其主要化學成分為羊毛脂型三萜，為其規(guī)范化種植SOP的優(yōu)化升級和質(zhì)量標準制訂提供了科學依據(jù)，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的確定奠定了基礎(chǔ)。

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Chemical Constituents from Sclerotium ofPoriacocosCultivated in GAP Base for Chinese Medicinal Materials

ZHENG Yan，YANG Xiuwei*

(State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs，Department of Natural Medicines，School of Pharmaceutical Sciences，Peking University，Beijing 100191，China)

Objective：To study the chemical constituents of 95%ethanol aqueous extract of the sclerotium ofPoriacocos(Schw.)Wolf..Methods：The compounds were separated and purified by repeated column chromatography on silica gel and high performance liquid chromatography，and their structures were determined by spectroscopic data analyses.Results：Fourteen compounds were obtained and identified as ergosta-7，22-dien-3β-ol(1)，3-epidehydrotumulosic acid(2)，3-O-acetyl-16α-hydroxytrametenolic acid(3)，polyporenic acid C(4)，dehydropachymic acid(5)，pachymic acid(6)，6α-hydroxypolyporenic acid C(7)，dehydrotumulosic acid(8)，tumulosic acid(9)，29-hydroxypolyporenic acid C(10)，poriacosone A(11)，3β，16α-dihydroxylanosta-7，9(11)，24-trien-21-oic acid(12)，25-hydroxypachymic acid(13)，poriacosone B(14)，respectively.Conclusion：The sclerotium ofP.cocoscultivated in Good Agricultural Practices(GAP)Base for Chinese Medicinal Materials contains abundant and characteristic lanostane-type triterpenoids，which are principal bioactive substance foundation of the sclerotium ofP.cocos.

Poriacocoscultivated in GAP Base for Chinese Medicinal Materials；Poriacocos；Polyporaceae；lanostane-type triterpenoids；bioactive substance foundation

“十二五”國家科技支撐專項(2011BAI07B08)

] 楊秀偉，教授，研究方向：中藥有效物質(zhì)基礎(chǔ)；Tel：(010)82801569；E-mail：xwyang@bjmu.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.009

2016-10-30)

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