日本醫(yī)蛭抗凝活性研究△

魯增輝，賀宗毅，石萍，李卿，游華建，陳仕江

(重慶市中藥研究院/中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心 重慶分中心/中藥資源學重慶市重點實驗室，重慶 400065)

·基礎研究·

日本醫(yī)蛭抗凝活性研究△

魯增輝，賀宗毅，石萍，李卿，游華建，陳仕江*

(重慶市中藥研究院/中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心 重慶分中心/中藥資源學重慶市重點實驗室，重慶400065)

目的：研究分析人工養(yǎng)殖條件下日本醫(yī)蛭活體、干品的抗凝活性，為日本醫(yī)蛭合理入藥提供參考。方法：根據(jù)中國藥典規(guī)定，采用凝血酶滴定法對不同處理的日本醫(yī)蛭樣品進行測試。結果：發(fā)現(xiàn)日本醫(yī)蛭抗凝活性依次為超低溫凍干品、鮮品、曬干品。結論：保證日本醫(yī)蛭最佳抗凝活性的方法為超低溫凍干。

日本醫(yī)蛭；人工養(yǎng)殖；抗凝活性

日本醫(yī)蛭Hirudonipponica是《中華人民共和國藥典》收錄的水蛭藥材基原中唯一吸食動物血液的品種[1]。日本醫(yī)蛭體內含有迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最強凝血酶天然特異抑制劑—水蛭素，同時還含有其它抗凝血因子[2-4]，因此具有抑制血小板聚集，抗血栓、改善血液流變性、降血脂和抗動脈粥樣硬化等藥理作用，在治療心腦血管疾病方面具有顯著功效?，F(xiàn)有關于日本醫(yī)蛭的研究主要集中于基原論證[4]、藥材鑒定及分子系統(tǒng)發(fā)育[5-9]、人工養(yǎng)殖繁育[10]、化學成分及抗凝活性[11-12]、日本醫(yī)蛭醫(yī)學實踐[13-14]等方面，但上述研究均不夠深入，不利于日本醫(yī)蛭可持續(xù)利用及深度開發(fā)。

目前，關于日本醫(yī)蛭特別是養(yǎng)殖狀態(tài)下日本醫(yī)蛭抗凝活性，研究資料幾乎為空白。為此，本研究對全人工養(yǎng)殖的日本醫(yī)蛭抗凝活性進行了檢測，以期為日本醫(yī)蛭人工養(yǎng)殖、水蛭藥材深度開發(fā)以及水蛭藥材抗凝成分等研究提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1材料

試驗用日本醫(yī)蛭來源于本課題組日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖基地全人工繁殖獲得。試驗個體均為0.3g以上健康、活躍的日本醫(yī)蛭。

1.2方法

1.2.1樣品處理 日本醫(yī)蛭超低溫凍干品以及日本醫(yī)蛭曬干品，研碎，直接過三號篩；日本醫(yī)蛭鮮品直接采用低溫勻漿機進行勻漿，然后進入下一步檢測。

1.2.2樣品抗凝活性測定 日本醫(yī)蛭抗凝活性測定，依據(jù)《中華人民共和國藥典》2015版規(guī)定[1]，具體如下：取1g上述樣品，加入0.9%氯化鈉溶液5mL，充分攪拌，浸提30min，不斷震蕩，離心，精密量取上清液100μL，加入新鮮配制的含0.5%牛纖維蛋白原的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液200μL，37℃±0.5℃中水浴5min，滴加每lmL中含40單位的凝血酶溶液(每1min滴加1次，每次5μL，邊滴加邊輕輕搖勻)至凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積，按下面公式計算：

U―每1g含凝血酶活性單位，U·g-1；

C1―凝血酶溶液的濃度，μg·mL-1；

C2―供試品溶液的濃度，g·mL-1；

V1―消耗凝血酶溶液的體積，μL；

V2―供試品溶液的加入量，μL。

中和一個單位的凝血酶的量，為一個抗凝血酶活性單位。

2 結果

2.1日本醫(yī)蛭抗凝活性測定

分別對養(yǎng)殖狀態(tài)下的日本醫(yī)蛭超低溫凍干品、曬干品以及鮮品進行抗凝活性的測定，結果如表1所示。在三種不同處理方式中，抗凝活性的大小依次為超低溫凍干品>鮮品>曬干品，其中超低溫凍干品的抗凝活性能高達2974±159.52U，鮮品以及曬干品的抗凝活性分別為380.00±17.44U、110.67±10.01U。

表1 日本醫(yī)蛭不同處理方式抗凝活性

2.2日本醫(yī)蛭抗凝活性與處理方式的相關性

對不同處理狀態(tài)下的日本醫(yī)蛭抗凝活性進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)抗凝活性與不同處理方法呈現(xiàn)正相關性(結果如圖1所示)，鮮品及曬干品抗凝活性急劇下降。因此不同處理方式，能直接影響日本醫(yī)蛭的抗凝活性甚至決定了其入藥的療效。

圖1 日本醫(yī)蛭不同處理與抗凝活性的相關性

3 討論與結論

不同處理的人工養(yǎng)殖日本醫(yī)蛭抗凝血試驗結果表明，經過3種方法處理的日本醫(yī)蛭均有不同程度的抗凝活性，其中以超低溫冷凍干燥的日本醫(yī)蛭抗凝活性最強，證明超低溫冷凍干燥最大限度的保留了日本醫(yī)蛭體內的抗凝成分。然而日本醫(yī)蛭鮮品在低溫勻漿時候，理論上應該也能保證體內的活性物質，但數(shù)據(jù)顯示其在抗凝活性上與超低溫冷凍干燥相比，有較大差距，產生該問題的主要原因可能是由于鮮品日本醫(yī)蛭含有的水分、攝取的食物量等影響了試驗結果。曬干品日本醫(yī)蛭在抗凝活性上相比超低溫冷凍干燥的，更低出很多，原因可能是在曬干過程中某些抗凝活性成分如水蛭素有所喪失。

李友賓等[15]研究了日本醫(yī)蛭水提取物、以及加熱處理過的日本醫(yī)蛭抗凝活性，發(fā)現(xiàn)日本醫(yī)蛭鮮品水提取物抗凝活性是干品的2倍，未加熱的日本醫(yī)蛭抗凝活性要高于加熱的日本醫(yī)蛭，與本研究結果一致。除此之外，有學者采用鹽浸提法[16]、水提法[15]提取日本醫(yī)蛭粗提物，研究日本醫(yī)蛭粗提物的抗凝活性，結果顯示粗提物在抗凝活性上均低于本研究，可能是試驗方法上存在一定差異，也有可能是現(xiàn)有提取方法，不能將日本醫(yī)蛭體內抗凝成分完全分離出來，造成日本醫(yī)蛭粗提物抗凝活性低于全體入藥。另有研究[17]發(fā)現(xiàn)日本醫(yī)蛭干品抗凝活性能達到360U，是本研究的3倍多，可能是由于本研究中的干品日本醫(yī)蛭經過高溫曬干，損失了部分活性成分。

本研究表明：日本醫(yī)蛭超低溫凍干品具有較強的體外抗凝血酶活性，高于新鮮勻漿以及目前市場主流的水蛭藥材加工方法——吊干，證明日本醫(yī)蛭的不同處理方法，對抗凝活性有極大的影響，然其機制尚不十分清楚。因此深度解析日本醫(yī)蛭以及其它水蛭藥材的核心抗凝成分，揭示抗凝活性成分在不同處理方式下的動態(tài)變化規(guī)律能夠為水蛭藥材的合理利用與入藥提供科學依據(jù)，也為詮釋目前水蛭藥材炮制的科學內涵，判定諸如日本醫(yī)蛭類含有水蛭素的品種，是否需要曬干或者炮制提供借鑒和參考。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] 李文，廖福龍，殷曉杰，等.七種水蛭抗血小板聚集與抗凝血研究[J].中藥藥理與臨床，1997，13(5)：32-34.

[3] 姚楠，余順慧，相宇，等.日本醫(yī)蛭不同萃取部位體外抗凝活性的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20(5)：1092-1093.

[4] 張衛(wèi)，張瑞賢，李健，等.中藥水蛭品種考證及資源可持續(xù)利用發(fā)展探討[J].中國中藥雜志，2013，38(6)：914-918.

[5] 劉曉帆，楊瑤珺，吳麗潔，等.中藥水蛭生藥學與化學成分的研究進展與展望[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2012，5(8)：637-640.

[6]LiuF，GuoQS，ShiHZ，etal.GeneticdiversityandphylogeneticrelationshipsamongandwithinpopulationsofWhitmaniapigraandHirudonipponicabased on ISSR and SRAP markers[J].Biochemical Systematic and Ecology，2013，51(4)：215-223.

[7] 徐云玲.無吻蛭目五種水蛭線粒體基因組注釋分析[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學，2013.

[8] Xu Y L，Nie J，Hou J J，et al.Complete mitochondrial genome ofHirudonipponia(Annelida，Hirudinea)[J].Mitochondrial DNA，2016，27(1)：257-258.

[9] 劉曉帆，劉春生，楊瑤珺，等.基于COI基因的水蛭及其混偽品的DNA條形碼研究[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2013，36(1)：63-66.

[10]石萍，魯增輝，賀元川，等.水蛭(日本醫(yī)蛭)繁殖性能的研究[J].中藥材，2015，38(6)：1144-1147.

[11]Li Y B，Huang W H，Xiang Y.Three new pteridines，hirudinoidines A-C，fromHirudonipponicaWhitman[J].HelveticaChimicaActa，2008，91(2)：303-307.

[12]蘇斌，王志斌，郭玉東，等.纖維蛋白原-凝血酶時間法用于水蛭質量控制方法的研究[J].藥物分析雜志，2014，34(10)：1802-1806.

[13]劉坤.醫(yī)用蛭在治療耳廓撕脫傷中的應用[J].中國中西醫(yī)結合耳鼻咽喉科雜志，2004(4)：180-180.

[14]張德宗，彭建強，楊潼，等.醫(yī)蛭在斷指再植術后淤血中的應用[J].中西醫(yī)結合雜志，1990(2)：84-84.

[15]李友賓，張健，段金廒，等.土鱉蟲與日本醫(yī)蛭提取物抗凝血酶活性的比較研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17(3)：350-351.

[16]李軍，于 翔，張健，等.4種水蛭粗提物抗凝活性及凍存時間對菲牛蛭抗凝活性影響[J].水產科學，2014，33(9)：591-593.

[17]張彬，汪波，龔元，等.幾種水蛭抗凝血物質提取及活性分析[J].中山大學學報，2012，51(4)：92-96.

Anticoagulant Activity Analysis ofHirudonipponica

LU Zenghui，HE Zongyi，SHI Ping，LI Qing，YOU Huajian，CHEN Shjiang*

(Chongqing Academy of Chinese Materia Medica/Chongqing Sub-center of National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Science；/Chongqing Key Laboratory of Chinese Medicine Resources，Chongqing 400065，China)

Objective：To determine and analyses anticoagulant activity of dry and living body of artificial culturingHirudonipponica，and provide references for reasonable use ofH.nipponicain traditional medicine.Methods：The anticoagulant activity was measured by the method of titration with thrombin.Results：The results indicated that anticoagulant activity ofH.nipponicadecreased successively under freeze-dried with ultralow temperature，fresh and dried treatment.Conclusion：The best treatment was freeze-dried with ultralow temperature to ensure the optimal anticoagulant activity ofH.nipponica.

Hirudonipponica；artificial culturing；anticoagulant activity

重慶市衛(wèi)生和計生委中醫(yī)藥科技項目(zy201402130)；重慶市衛(wèi)生和計生委中醫(yī)藥科技項目(zy201602097)；重慶市南岸區(qū)科委科技攻關項目(2015-18-23)；重慶市科委應用開發(fā)計劃項目(cstc2013yykfA00002)

] 陳仕江，研究員，研究方向：中藥資源及開發(fā)利用；Tel：(023)89029082，E-mail：shijiangchen@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.007

2016-09-02)

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