加味二術(shù)顆粒劑對肝郁脾虛證小鼠止瀉機(jī)制的影響研究

姚璐

（重慶市動物疫病預(yù)防控制中心，重慶 渝北 401120）

加味二術(shù)顆粒劑對肝郁脾虛證小鼠止瀉機(jī)制的影響研究

姚璐

（重慶市動物疫病預(yù)防控制中心，重慶 渝北 401120）

為了觀察“加味二術(shù)顆粒劑”對肝郁脾虛證小鼠腹瀉腸道中NHEs表達(dá)的影響，本試驗(yàn)將180只小鼠隨機(jī)分成高、中、低劑量組，分別灌胃7.5、5、2.5g/mL的加味二術(shù)顆粒劑水溶液（3mL），連續(xù)灌胃3d后，各處理組均給予番瀉葉水煎液。結(jié)果表明，加味二術(shù)顆粒劑對肝郁脾虛證小鼠具有明顯的止瀉作用，且作用機(jī)制可能是調(diào)節(jié)NHEs的表達(dá)。

加味二術(shù)顆粒劑；肝郁脾虛證；小鼠；作用機(jī)制

乳糖是由葡萄糖和半乳糖兩種單糖組成，是動物組織結(jié)構(gòu)和能量的重要來源[1-2]。但若缺乏黏膜乳糖酶，乳糖不能被分解，進(jìn)入結(jié)腸后被腸道細(xì)菌分解，則會產(chǎn)生大量乳酸、甲酸等短鏈脂肪酸和氫氣，造成滲透壓升高，腸腔內(nèi)水分增多，引起腹脹、腸鳴、腸絞痛直至腹瀉等現(xiàn)象[3]。血清中的淀粉酶屬于糖苷鏈水解酶，血清中淀粉酶的變化常跟胰腺方面的疾病有關(guān)。由于胰腺外分泌不足或缺乏，易引起小腸消化和吸收不良而致腹瀉。胰蛋白酶作為蛋白酶的一種，不僅作為消化酶而起作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前體，起活化作用[4]。胰蛋白酶在小腸里對蛋白質(zhì)消化有無可替代的作用。鈉氫交換體家族（Na+/H+exchanger，NHEs）是一類跨膜蛋白分子，其生理功能是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)H+與細(xì)胞外Na+的互換。NHEs已被證實(shí)有9個(gè)成員，其中有6個(gè)確定在腸黏膜上皮中表達(dá)。

本研究依據(jù)中獸醫(yī)辨證施治的原則，在癥候造模的基礎(chǔ)上，通過試驗(yàn)探索“加味二術(shù)顆粒劑”對小鼠腸道黏膜乳糖酶、血清淀粉酶、胰蛋白酶的含量以及肝郁脾虛證小鼠腹瀉腸道中NHEs表達(dá)的影響，從而明確“加味二術(shù)顆粒劑”對肝郁脾虛證小鼠的治療效果及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品 白術(shù)、蒼術(shù)、柴胡、丹參、陳皮、番瀉葉均購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司；NaCl試劑、多聚甲醛、酒精、甲醛均購自成都科龍?jiān)噭┕尽?/p>

1.1.2 試驗(yàn)動物 180只昆明小鼠，雌雄各半，體重20～25g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司。自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。

1.1.3 主要儀器和試劑 3001型酶標(biāo)儀，F(xiàn)L-1可調(diào)試封閉電爐，MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。小鼠結(jié)腸組織和細(xì)胞總RNA抽提試劑盒，ComSYBR qPCR Mix（with ROX），Universal Reverse Transcription Kit。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥液制備 番瀉葉煎液的制備：將番瀉葉烘干，浸泡0.5h，加水煮沸約1 h，過濾，濾液減壓濃縮至含生藥1.2 g/mL的藥液。加味二術(shù)顆粒劑：提取時(shí)間1h，提取次數(shù)2次，加醇量15倍，醇濃度50%，輔料為乳糖，制成顆粒劑，將加味二術(shù)顆粒劑配制成含生藥 2.5、5、7.5g/mL 的藥液。

1.2.2 飼養(yǎng)管理及分組 隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組30只小鼠。6組均給予普通飼料喂養(yǎng)，高劑量組、中劑量組、低劑量組分別灌胃7.5、5、2.5g/mL的加味二術(shù)顆粒劑水溶液（3mL），陽性對照組灌胃硫酸粘桿菌素0.05mg/mL（3mL），陰性對照組和正常組灌胃3mL的生理鹽水。連續(xù)灌胃3d后，給予番瀉葉水煎液（含生藥 0.3g/mL）1mL。

1.2.3 樣品采集及處理 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組剖殺10只小鼠，眼部取血，將血液放入37℃溫箱1h后轉(zhuǎn)入4℃冰箱中過夜。然后離心，以3000r/min 4℃離心10min，取上層血清于2mLEP管里分裝，-20℃保存。快速將腸道取出，用冰冷生理鹽水反復(fù)沖洗，置-20℃保存。

1.3 指標(biāo)測定及方法

1.3.1 生化指標(biāo)測定 黏膜乳糖酶、血清淀粉酶、胰蛋白酶的測定嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3.2 NHEs mRNA表達(dá)的測定

1.3.2.1 總 RNA 提取：（1）取 200～300μL的血液（血清）樣品，加入1mL裂解液LZ，用移液器吹打數(shù)次，混勻，室溫靜置10min。

（2）將裂解物轉(zhuǎn)移至另一新的無RNA酶的離心管中，加入1/10體積的吸附液BD和3.5μL助沉劑PA，并加入1.5倍體積的無水乙醇，用移液器吹打數(shù)次，混勻，室溫靜置30min。

（3）立即吸取700μL樣品以及有可能形成的沉淀，加入帶有2mL收集管的離心純化柱，輕蓋蓋子，室溫靜置2min，12000r/min室溫離心15s，棄盡廢液。

（4）將剩余的樣品轉(zhuǎn)移至離心柱，重復(fù)第（3）步。

（5）往離心柱中加入500μL漂洗液WB，輕蓋蓋子，12000r/min室溫離心15s，棄盡廢液。

（6）重復(fù)第（5）步，往離心柱中加入 500μL漂洗液WB，輕蓋蓋子，12000r/min室溫離心15s，棄盡廢液。洗滌后再次以12000r/min離心空柱2min，干燥硅膠膜。

（7）將離心柱轉(zhuǎn)移至一新的無RNA酶的1.5mL離心管中，往硅膠膜中央滴加洗脫液EB，輕蓋管蓋，室溫靜置5min，13500r/min離心1min洗脫RNA。

（8）把洗脫液滴加回硅膠膜重復(fù)第（7）步洗脫。1.3.2.2 熒光定量引物設(shè)計(jì)：如表1所示。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.3.2.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：見表2。

逆轉(zhuǎn)錄程序：16℃、30 min，42℃、30 min，85℃、10min。1.3.2.4 定量PCR反應(yīng)體系（表3）：95℃、3min變性，95℃、12s，60℃、40s、40 個(gè)循環(huán)。

表2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

表3 實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系

2 結(jié)果與分析

2.1 “加味二術(shù)顆粒劑”對肝郁脾虛腹瀉小鼠體內(nèi)胰蛋白酶的影響 “加味二術(shù)顆粒劑”對胰蛋白酶含量的影響見表4。從表 4可知，2h、6h、8h各時(shí)段，“加味二術(shù)顆粒劑”低劑量組的胰蛋白酶含量均低于陰性對照組（P＜0.05），中劑量組均低于低劑量組和陰性對照組（P＜0.05），高劑量組均低于低劑量組、中劑量組和陰性對照組（P＜0.05）；各時(shí)段高劑量組與硫酸粘桿菌素組（陽性對照組）的差異均不顯著（P＞0.05）。

表4 不同時(shí)段“加味二術(shù)顆粒劑”對胰蛋白酶的影響

2.2 “加味二術(shù)顆粒劑”對肝郁脾虛腹瀉小鼠體內(nèi)血清淀粉酶的影響 “加味二術(shù)顆粒劑”對血清淀粉酶含量的影響見表5。從表5可知，2h、6h、8h各時(shí)段，“加味二術(shù)顆粒劑”低劑量組的血清淀粉酶含量均低于陰性對照組（P＜0.05），中劑量組均低于低劑量組和陰性對照組（P＜0.05），高劑量組均低于低劑量組、中劑量組和陰性對照組（P＜0.05）；2h時(shí)，高劑量組高于硫酸粘桿菌素組（陽性對照組）（P＜0.05）；6h、8h時(shí)，高劑量組均低于硫酸粘桿菌素組（P＜0.05）；2h時(shí)，高劑量組高于空白組（P＜0.05）；6h時(shí)，高劑量組與空白組差異不顯著（P＞0.05）；8h時(shí)，高劑量組低于空白組（P＜0.05）。

表5 不同時(shí)段“加味二術(shù)顆粒劑”對血清淀粉酶的影響

2.3 “加味二術(shù)顆粒劑”對肝郁脾虛腹瀉小鼠腸黏膜乳糖酶的影響 “加味二術(shù)顆粒劑”對腸黏膜乳糖酶含量的影響見表6。從表6可知，2h、6h、8h各時(shí)段，“加味二術(shù)顆粒劑”低劑量組的腸黏膜乳糖酶含量均高于陰性對照組，低于中劑量組和高劑量組（P＜0.05）；中劑量組各時(shí)段均高于陰性對照組、低劑量組和硫酸粘桿菌素組（陽性對照組）（P＜0.05）；高劑量組各時(shí)段均高于陰性對照組、硫酸粘桿菌素組、空白組和低劑量組（P＜0.05）；2h時(shí)，高劑量組與中劑量組差異不顯著（P＞0.05）；6h和 8h時(shí)，高劑量組均高于中劑量組。

表6 不同時(shí)段“加味二術(shù)顆粒劑”對腸黏膜乳糖酶的影響

2.4 “加味二術(shù)顆粒劑”對肝郁脾虛腹瀉小鼠體內(nèi)NHEs mRNA表達(dá)的影響

表7 不同時(shí)段“加味二術(shù)顆粒劑”對NHE2的影響

2.4.1“加味二術(shù)顆粒劑”對NHE2 mRNA表達(dá)的影響（見表7） 由表7可知，2h時(shí)，“加味二術(shù)顆粒劑”各劑量組均高于空白組、陰性對照組和硫酸粘桿菌素組（陽性對照組）（P＜0.05），“加味二術(shù)顆粒劑”高劑量組高于中劑量組和低劑量組（P＜0.05），中劑量組高于低劑量組；6h時(shí)，“加味二術(shù)顆粒劑”各劑量組均高于空白組和陰性對照組（P＜0.05），高劑量組和中劑量組均高于硫酸粘桿菌素組（P＜0.05），低劑量組低于硫酸粘桿菌素組（P＜0.05）；8h 時(shí)，“加味二術(shù)顆粒劑”各劑量組均高于空白組、陰性對照組和硫酸粘桿菌素組（P＜0.05），高劑量組高于中劑量組和低劑量組（P＜0.05），中劑量組高于低劑量組。

2.4.2“加味二術(shù)顆粒劑”對NHE3 mRNA表達(dá)的影響（見表8） 由表8可知，2 h時(shí)，“加味二術(shù)顆粒劑”高劑量組和中劑量組高于低劑量組、空白組、陰性對照組和硫酸粘桿菌素組（陽性對照組）（P＜0.05），高劑量組高于中劑量組（P＜0.05），低劑量組與空白組、陰性對照組、陽性對照組間差異不顯著（P＞0.05）；6h時(shí)，高劑量組和中劑量組高于低劑量組、空白組、陰性對照組和硫酸粘桿菌素組（P＜0.05），且高劑量組與中劑量組之間差異不顯著（P＞0.05），低劑量組與空白組、陰性對照組、硫酸粘桿菌素組之間差異不顯著（P＞0.05）；8h時(shí)，各組間差異均不顯著（P＞0.05）。

表8 不同時(shí)段“加味二術(shù)顆粒劑”對NHE3的影響

2.4.3 “加味二術(shù)顆粒劑”對NHE8 mRNA表達(dá)的影響（見表9） 由表9可知，2h時(shí)，“加味二術(shù)顆粒劑”高劑量組高于中劑量組、低劑量組、空白組、陰性對照組和硫酸粘桿菌素組（陽性對照組）（P＜0.05），其他組兩兩間差異不顯著（P＞0.05）；6h時(shí)，高劑量組高于空白組、陰性對照組和硫酸粘桿菌素組（P＜0.05），其他組兩兩間差異不顯著（P＞0.05）；8h時(shí)，中劑量組高于低劑量組、高劑量組、陰性對照組、硫酸粘桿菌素組和空白組（P＜0.05），高劑量組又高于低劑量組、空白組、陰性對照組和硫酸粘桿菌素組（P＜0.05）。

表9 不同時(shí)段“加味二術(shù)顆粒劑”對NHE8的影響

3 結(jié)論與分析

肝失疏泄、脾失健運(yùn)而表現(xiàn)以胸脅脹痛、腹脹、便溏等為主癥的證候，稱為肝脾不和證。肝郁脾虛證常見病癥為肝郁脾虛型泄瀉和肝郁脾虛型厭食癥。肝郁脾虛型泄瀉臨床表現(xiàn)為胸脅脹悶，噯氣食少，腹痛腹瀉，腹中雷鳴，其主要治法為抑肝扶脾。肝郁脾虛型厭食癥臨床表現(xiàn)為食欲不振，拒食，便溏，其治法以疏肝解郁，健脾化痰為主。

3.1 “加味二術(shù)顆粒劑”對小鼠腹瀉的作用 乳糖不耐受癥易引發(fā)腹瀉。其發(fā)病機(jī)理為乳糖酶的缺乏導(dǎo)致乳糖積聚，腸內(nèi)滲透壓升高導(dǎo)致腹瀉，其最有效準(zhǔn)確的診斷方式為腸黏膜乳糖酶的測定。本試驗(yàn)對腸黏膜乳糖酶進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示腸黏膜乳糖酶隨著加味二術(shù)顆粒劑濃度的升高而增多。急性胰腺炎常伴隨急性腹瀉，此時(shí)血、尿淀粉酶明顯升高，血清淀粉酶的升高常發(fā)生在腹瀉后的6～8h。本試驗(yàn)對血清淀粉酶進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示中藥各劑量組的血清淀粉酶含量明顯低于陰性對照組（P＜0.05），且隨著藥物濃度升高而降低（P＜0.05）。胰蛋白酶作為消化酶在機(jī)體中能選擇性地水解蛋白質(zhì)中的肽鏈，能消化溶解變性蛋白質(zhì)，對未變性的蛋白質(zhì)無作用，因此能使膿、痰液、血凝塊等分解、變稀，易于引流排出，加速創(chuàng)面凈化，促進(jìn)肉芽組織新生，此外還有抗炎癥作用。本試驗(yàn)中陰性對照組的胰蛋白酶顯著升高，陽性對照組與中藥各劑量組均低于陰性對照組。綜合以上結(jié)果，表明“加味二術(shù)顆粒劑”可以有效治療肝郁脾虛證小鼠的腹瀉，且效果顯著（P＜0.05）。

中草藥能夠治療肝郁脾虛證小鼠腹瀉，可能是由于中草藥中含有的多糖、有機(jī)酸、生物堿和揮發(fā)油成分能夠直接殺菌、抑菌，從而增加機(jī)體免疫力。本試驗(yàn)“加味二術(shù)顆粒劑”選用白術(shù)、蒼術(shù)、柴胡、丹參、陳皮5味中藥組方。其中，白術(shù)的主要成分是揮發(fā)油，功能主治脾虛少食、腹脹泄瀉、水腫、自汗等[5]。蒼術(shù)的主要化學(xué)成分為倍半萜類、聚乙烯炔類、糖苷類等，含有蒼術(shù)素、茅術(shù)醇和桉葉醇等，主要藥理活性為抗炎、抗菌、抗病毒作用等，其中β-桉葉醇在胃腸道運(yùn)動功能正?；虻拖聲r(shí)，能促進(jìn)胃腸運(yùn)動[6]。陳皮中主要含有橙皮苷、川陳皮素、肌醇等，其中橙皮苷具有抗氧化、抗炎以及抑制微生物活性等作用[7]。柴胡具有和解表里、疏肝升陽的功效，其主要成分有柴胡皂苷和柴胡多糖，具有抗炎作用，可增強(qiáng)免疫力。丹參提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌等均有不同程度的抑制作用。

3.2 “加味二術(shù)顆粒劑”對NHEs表達(dá)的影響 中藥各劑量組對NHE2的表達(dá)高于陰性對照組（P＜0.05），對 NHE3的表達(dá)與陰性對照組差異不顯著，中藥中、高劑量組對NHE8的表達(dá)高于陰性對照組（P＜0.05），可見加味二術(shù)顆粒劑對NHE2、NHE3、NHE8的表達(dá)均有不同程度的影響。鈉氫交換泵NHEs是存在于真核細(xì)胞中的一種重要離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體，該蛋白載體的主要功能有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值，控制細(xì)胞體積大小，負(fù)責(zé)鈉氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)等。目前關(guān)于NHEs基因與腸管分泌性腹瀉的研究尚少。NHE2表達(dá)于胃、結(jié)腸和腎臟，NHE8表達(dá)于結(jié)腸、胃和小腸，NHE3表達(dá)于腎臟，且都與Na+吸收有關(guān)。NHE2和NHE3主要表達(dá)于結(jié)腸上皮細(xì)胞刷狀緣，參與多種生理或病理過程。生理情況下，NHE2和NHE3主要通過介導(dǎo)腸腔內(nèi)Na+與腸上皮細(xì)胞內(nèi)H+的交換，促進(jìn)腸道對鈉離子吸收，進(jìn)而形成滲透梯度，增加腸道對水的被動吸收，其中NHE3的作用更明顯，NHE2只是對NHE3起輔助作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，NHE3缺失的小鼠相比正常小鼠，鈉、水在腸道中的吸收減少并伴隨腹瀉發(fā)生。同樣在炎癥性腸病及霍亂毒素誘導(dǎo)的腹瀉中，NHE3的表達(dá)和活性均受到明顯抑制。NHEs活性降低會引起機(jī)體Na+吸收障礙，導(dǎo)致腹瀉，提高NHEs活性將是預(yù)防和治療腹瀉的一個(gè)新方向。

[1]Fox M R，Yang J，Deng Y，et al.The prevalence,clinical relevance and impact on diet of lactose intolerance in a population with lactase deficiency：a randomised double-blind，dose response study in healthy subjectand patients with diarrhoea predominant irritable bowel syndrome[J].Gut，2012，61（suppl 2）：319-321.

[2]Zhu Y，Zheng X，Cong Y，et al.Bloating and distention in irritable bowel syndrome:the role of gas production and visceral sensation after lactose ingestion in a population with lactase deficiency[J].Am J Gnstroenterol，2013，108（9）：1516-1525.

[3]卜建斌，云戰(zhàn)友，邢黎明.β-半乳糖苷酶的應(yīng)用及固定化[J].農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2006（2）：4-6.

[4]馬健.刺參再生相關(guān)基因的序列分析與表達(dá)[D].大連：遼寧師范大學(xué)，2010：31-33.

[5]彭騰，李鴻翔，邱建平，等.白術(shù)內(nèi)酯類成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].中國藥房，2012（39）：3732-3734.

[6]王金華，薛寶云，梁愛華，等.蒼術(shù)有效成分β-桉葉醇對小鼠小腸推進(jìn)功能的影響[J].中國藥學(xué)雜志，2002，37（4）：266-268.

[7]張冬松，高慧媛，吳立軍，等.橙皮苷的藥理活性研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥，2006，8（7）：25-27.

[8]張永國，王新，張霖，等.小檗堿治療腹瀉的分子機(jī)制研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2009，39（1）：6-8.

Study on the Mechanism of the Antidiarrheal Effect of Two Macrocephala Flavored Granule on the Stagnation and Spleen Deficiency Syndrome Mice

Yao Lu
（Chongqing Animal Disease Prevention and Control Center，Chongqing Yubei 401120，China）

To observe the effect of Two Macrocephala Flavored Granule on the expression of NHEs in two patients of liver stagnation and spleen deficiency syndrome mice diarrhea.180 mice were randomly divided into different groups：high dose group，middle dose group，low dose group，were given 7.5g/mL，5g/mL，2.5 g/mL concentrations of Two Macrocephala Flavored Granule solution for three days，and each group of mice were given senna decoction.The results showed that the Two Macrocephala Flavored Granule on mice liver stagnation and spleen deficiency had obvious antidiarrheal effect，and its mechanism might be the expression regulation of NHEs.

Two Macrocephala Flavored Granule；Liver stagnation and spleen deficiency syndrome；mice；Mechanism of action

S853.74

B

1001-8964（2017）09-0025-05

2017-06-15

姚璐(1982-)，女，四川雅安人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物疫病防控研究。