茶葉水提物的抗氧化活性研究

羅思媛，郭紅英,2，李清明,2，楊章清

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

茶葉水提物的抗氧化活性研究

羅思媛1，郭紅英1,2，李清明1,2，楊章清1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

以綠茶銀毫、半發(fā)酵茶鐵觀音、全發(fā)酵茶普洱為研究對象，將其以1∶150的茶水比用沸水分別沖泡10、15、20、25和30 min，通過測定還原力、DPPH·和·OH的清除能力、螯合金屬離子的能力測定，研究3種茶葉水提物（茶湯）進行抗氧化能力。結(jié)果表明：在沖泡時間為20 min時，茶湯的抗氧化性能較好。同等條件下，綠茶銀毫的茶湯比其他兩種的抗氧化能力強。4種化學(xué)模型所測得的數(shù)據(jù)表明，3種茶葉水提物的抗氧化效果為：不發(fā)酵茶（銀毫）＞半發(fā)酵茶（鐵觀音）＞發(fā)酵茶（普洱）。

茶葉；水提物；抗氧化活性；發(fā)酵茶

茶是受人們喜愛的世界范圍內(nèi)的大眾飲料，是世界三大飲料（茶、咖啡和可可）之首，也是我國最普及的一種天然飲料，我國用茶作飲料已有數(shù)千年的歷史[1]。茶中含有許多益于人體健康的有機成分和無機礦質(zhì)元素，在醫(yī)療與保健上有一定功效，大量醫(yī)療保健和養(yǎng)生作用在源遠流長的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)寶庫中有所體現(xiàn)，茶及茶葉提取物質(zhì)對人體健康所產(chǎn)生的功效也已經(jīng)被新科技從各方面證明[2]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）研究茶與人類健康關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，茶中含有部分有效成分對多種人體常見病有廣譜預(yù)防作用，包括茶葉中含有的氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、茶多酚等多種營養(yǎng)及活性成分[3]。茶葉中的抗氧化物質(zhì)如茶多酚在延緩衰老、抑制腫瘤方面有一定作用，因其可有效清除脂類自由基和氧自由基，以預(yù)防脂質(zhì)過氧化[4]。

茶葉為山茶科植物山茶的葉芽，其種類繁多，按制作工藝可分為不發(fā)酵的茶、輕度發(fā)酵的茶、半發(fā)酵的茶、全發(fā)酵的茶。一般綠茶屬于不發(fā)酵的茶，像龍井茶、碧螺春、銀毫等；白茶屬于輕度發(fā)酵茶，像白毫銀針、白牡丹等；青茶屬于半發(fā)酵茶，像鐵觀音、烏龍茶等；紅茶屬于全發(fā)酵茶，像普洱紅茶、小紅茶等。試驗選擇全發(fā)酵茶普洱、半發(fā)酵茶鐵觀音、綠茶銀毫作為材料，通過不同的沖泡時間，探討其水提物的抗氧化活性，并對其飲用方式進行有意的探索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原 料全發(fā)酵茶普洱、半發(fā)酵茶鐵觀音、綠茶銀毫均采購于大型超市。

1.1.2 主要試劑DPPH·（二苯基苦味?；诫伦杂苫?,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，AR），美國Sigma公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、七水硫酸亞鐵、水楊酸、1,10-菲羅啉、EDTA、雙氧水等均為國產(chǎn)分析純，購于中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）；Cary 100 紫外可見光分光光度計（美國VARIAN公司）；TD5A型臺式多管架離心機（長沙英泰儀器有限公司）；SPECTRA MAX 190酶標(biāo)儀（Thermo electron corporation）。

1.2 試驗方法

1.2.1 制備茶葉水提物用電子分析天平準(zhǔn)確稱取1 g普洱、鐵觀音、銀毫，分別加入到150 mL沸水中泡茶10、15、20、25、30 min。然后取上清液，待其冷卻后放于離心機中，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心分離10 min。用錐形瓶收集上層清液備用（當(dāng)天試驗須用當(dāng)天泡的茶）。

1.2.2 茶葉水提物還原能力的測定還原能力是提供電子能力的一種重要的反應(yīng)指標(biāo)，而還原能力強的物質(zhì)因其化學(xué)本質(zhì)為還原劑，將會是良好的電子供體，中斷自由基的連鎖反應(yīng)是通過給予氧化自由基、活性氧電子等形式，讓自由基形態(tài)逐漸穩(wěn)定，從而達到抗氧化的目的。研究發(fā)現(xiàn)還原力與物質(zhì)的抗氧化活性呈正相關(guān)。一般情況下Fe3+被具有較強還原能力的物質(zhì)還原成Fe2+，還原程度可依據(jù)顯色反應(yīng)判斷，還原能力越強的物質(zhì)其反應(yīng)后的吸光度越大[5-6]。

具體操作：在潔凈的試管中加入pH值為6.6、濃度為0.2 mol/L的磷酸鈉緩沖液2.5 mL、測試樣品2 mL及1%的鐵氰化鉀1 mL，將該混合液在50℃下水浴20 min后急速冷卻，加入10%的三氯乙酸1 mL，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上層清液加0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL和蒸餾水2.5 mL，混合均勻，待10 min靜置完畢，測定700 nm處其吸光值，全部測定值均取3次平均值。

1.2.3 茶葉水提物對二苯基苦味?；诫伦杂苫―PPH·）清除能力的測定因為許多自由基化學(xué)性質(zhì)極為活潑、壽命極短，故作為氧化反應(yīng)的中間體時對操作有較為嚴格的要求。DPPH·體系是篩選抗氧化劑和自由基清除劑時使用最多的判定手段之一。DPPH·是一種較為穩(wěn)定的人工合成的大分子自由基，分子結(jié)構(gòu)中有未成對電子，在517 nm處有最大吸收值，其乙醇溶液呈藍紫色。當(dāng)其他自由基電子與未成對電子配對后會使DPPH·吸收值下降，且在一定范圍內(nèi)，其所接受的電子數(shù)與褪色程度呈定量關(guān)系。在與抗自由基活性物質(zhì)的作用過程中，抗自由基活性物質(zhì)的活性越強時其吸收值下降越多[7]。

具體操作：配置濃度為2×10-5mol/L的DPPH·乙醇溶液，并在4℃冰箱避光保存?zhèn)溆?。臨用時將DPPH·、50%乙醇溶液及樣品液按照表1進行反應(yīng)，靜置30 min，以50%乙醇溶液為空白溶劑，于DPPH·溶液的最大吸收波長517 nm處測Ao、Ai、Aj所表示的樣品的吸光度值。所有試樣的測定值均取3次平行試驗的平均值。

表1 DPPH·試驗加樣方案（mL）

樣品對DPPH·自由基的清除能力按公式（1）計算：

其中，Ao：溶劑與DPPH·混合液的吸光度；Ai：樣品與DPPH·反應(yīng)后的吸光度；Aj：溶劑與樣品混合液的吸光度。

1.2.4 茶葉水提物對羥基自由基（·OH）清除率的測定·OH作為一種極強的氧化劑，是機體內(nèi)活性最強、毒性最大、半衰期最短的氧自由基，憑借其超快的反應(yīng)速度，生物體內(nèi)所有的分子基本都能與其發(fā)生反應(yīng)，如使酶和蛋白質(zhì)變性等。研究樣品對·OH的清除作用對研究樣品抗氧化性有指導(dǎo)意義，因此創(chuàng)建了許多測定方式，如水楊酸比色法、DMSO熒光法、鄰菲羅啉化學(xué)發(fā)光法、鄰二氮菲Fe2+氧化分光光度法等[8]。當(dāng)中以Fenton反應(yīng)為借鑒建立出反應(yīng)體系模型的水楊酸比色法，即Fe2+與H2O2反應(yīng)生成·OH?！H存活時間短、反應(yīng)活性強，若想有效捕捉·OH可利用水楊酸，體系反應(yīng)后會產(chǎn)生于510 nm處有強吸收的有色產(chǎn)物，如果將帶有清除·OH功能的被測物添加進去，便會和水楊酸一同競爭·OH，以降低紫色產(chǎn)物的生成量。在510 nm處采用固定時間反應(yīng)法以蒸餾水為空白測量吸光度。

具體操作：在試管中按表2依次加入6 mmoL FeSO4·7H2O2、6 mmoL水楊酸、樣品，混合搖勻后加入3 mmoL H2O2，然后加入蒸餾水定容至8 mL，搖勻，室溫下靜置30 min。測Ao、Ai、Aj所表示的吸光度值。每個試樣做3個平行試驗，取其平均值。

表2 ·OH試驗加樣方案（mL）

樣品對羥基自由基（·OH）的清除能力按公式（2）計算：

其中，Ao：溶劑與水楊酸混合液的吸光度；Ai：樣品與水楊酸、溶劑反應(yīng)后的吸光度；Aj：樣品本身的吸光度。

1.2.5 測定茶葉水提物螯合金屬離子能力過渡金屬離子與活性氧自由基的產(chǎn)生以及毒性作用等緊密相連，是由于其參與了生物體內(nèi)大量的氧化過程，以Fe2+在氧化應(yīng)激過程中的主要表現(xiàn)為例：一是催化Haber Weiss反應(yīng)促使危害性更大的·OH被O2-生成；二是催化RO·和ROO·由脂質(zhì)過氧化物均裂產(chǎn)生，此二者均可通過誘發(fā)新的脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而產(chǎn)生毒性醛等；三是催化兒茶酚胺類化合物、巰基化合物的自氧化，促使H2O2和O2-·的生成等[9]。微量的金屬離子可誘導(dǎo)油脂的氧化速率提高1036倍，此外，Cu2+可催化低密度脂蛋白LDL氧化。螯合金屬離子的間接機制是抗氧化劑清除·OH的主要機理，即使能利用抽氫反應(yīng)開展，但是·OH一旦在生物體系中產(chǎn)生就會迅速與周圍的生物分子發(fā)生反應(yīng)，因此研究抗氧化劑清除自由基的機制時應(yīng)該著重考察其螯合金屬離子的能力[10]，此次采用Fe2+螯合試驗。

具體操作：取1 mL茶湯，加入2 mL 0.284 8 mmol/L硫酸亞鐵溶液，搖至均勻，6 min后加入2 mL 0.854 4 mmol/L鄰菲羅啉溶液，振蕩混勻，反應(yīng)20 min后于510 nm處測定吸光度。不加硫酸亞鐵茶湯為空白。另以0.05～0.3 mg/mL Na2EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液代替茶湯作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.675 9x+0.070 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。樣品的Fe2+螯合能力以mg/mL Na2EDTA計[11]。每份試樣重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉水提物的還原能力

綠茶銀毫、半發(fā)酵茶鐵觀音、全發(fā)酵茶普洱3種茶葉水提物的還原力如圖1所示，可見其均具有較強的還原能力。在10～15 min時，增勢平緩，說明其中的抗氧化成分正緩慢從茶葉中溶出；在15～20 min，增幅變大，說明茶葉中的抗氧化物質(zhì)溶出速度和溶出量大幅度增加；25 min后還原力有所下降，原因可能是隨著時間的延長，一些抗氧化物質(zhì)結(jié)構(gòu)上發(fā)生了改變，導(dǎo)致活性下降。3種茶葉中綠茶銀毫的水提物（同等固液比條件下做了兩倍稀釋）還原能力最強，鐵觀音次之，普洱最弱。茶的抗氧化功效主要歸功于茶葉中的茶多酚，主要因為其結(jié)構(gòu)中所具有的多個酚羥基，易提供氫離子而被氧化成醌類。茶多酚可以作用于與自由基產(chǎn)生有關(guān)的酶，直接清除螯合金屬離子、自由基，抑制自由基的產(chǎn)生等。茶的加工工藝會影響其茶多酚含量，如在加工過程中，綠茶和半發(fā)酵茶需要經(jīng)過高溫殺青，該過程將使鮮葉中的多酚氧化酶鈍化甚至失活，以阻止多酚類物質(zhì)進一步氧化而使茶多酚得以保留，而發(fā)酵茶在漫長的溫、濕環(huán)境下其多酚類物質(zhì)經(jīng)過酶促氧化和非酶促氧化，形成了更為復(fù)雜的化合物[12]。

圖1茶葉水提物的還原力

2.2 茶葉水提物對DPPH·清除能力

DPPH·清除能力的測定，屬于評價自由基清除劑和抗氧化劑的功能活性時使用頻率最高的評價方法之一。3種茶葉水提物對DPPH·的清除能力如圖2所示，可見3種茶葉水提物中，泡茶時間為20 min時出現(xiàn)最高清除率，說明此時三者水提物中清除自由基活性物質(zhì)含量最高，對DPPH·清除能力均為最強。其中銀毫對DPPH·的清除率最高，最大清除率可達70%，比鐵觀音最大清除率高16%，比普洱的高一倍多。

圖2茶葉水提物對DPPH·自由基的清除率

2.3 茶葉水提物對·OH的清除能力

·OH是機體內(nèi)半衰期最短、活性最強、破壞性最大的自由基，因此研究樣品對·OH的清除能力對抗氧化性研究具有重要意義。3種茶葉水提物對·OH的清除效果如圖3所示，可見3種茶葉水提物均對·OH均有不同程度的清除作用，且在0～20 min范圍內(nèi)，茶葉水提物對·OH的清除能力隨著沖泡時間的增長而增強；20 min后，清除作用則有所減弱。3種茶葉中銀毫的水提物對·OH的清除能力最大為58%，約比鐵觀音的高9%，比普洱高19%。

2.4 茶葉水提物螯合金屬離子的能力

試驗選用Fe2+體系，考察了3種茶葉水提物對金屬離子的螯合能力（樣品對Fe2+螯合能力以mg/mL Na2EDTA計），結(jié)果如圖4所示，可見3種茶葉水提物對Fe2+的螯合能力強弱程度為：銀毫＞鐵觀音＞普洱。3種茶葉水提物對Fe2+的螯合能力與泡茶的時間長短也有一定的關(guān)系，隨著泡茶時間的增加，對Fe2+的螯合能力增強，在20 min時達到最大值，稍后變化趨于平緩。銀毫茶葉水提物的最大螯合能力與0.302 mg/mL Na2EDTA相當(dāng)，鐵觀音的與0.271 mg/mL Na2EDTA相當(dāng)，普洱的相當(dāng)于0.178 mg/mL Na2EDTA。

圖3茶葉水提物對·OH的清除能力

圖4茶葉水提物螯合金屬離子的能力

3 結(jié)論與討論

將銀毫、鐵觀音和普洱三種茶葉以1∶150的茶水比進行泡茶，通過控制泡茶時間的長短來研究3種茶葉水提物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)在10～20 min時，茶葉水提物的抗氧化活性都在增強，除了銀毫與普洱在泡茶25 min時測得的還原能力值最大外，其他都在20 min時達到最大值，說明這時茶葉中的抗氧化活性成分基本被水所浸提，沖泡20 min后再飲用比較好。通過4種化學(xué)模型所測得的數(shù)據(jù)表明，3種茶提物的抗氧化效果為不發(fā)酵茶（銀毫）＞半發(fā)酵茶（鐵觀音）＞發(fā)酵茶（普洱），這與茶葉的加工工藝有關(guān)：相對而言，作為全發(fā)酵茶的普洱，其茶多酚保留量最少；而作為半發(fā)酵茶的鐵觀音，在酶促氧化等反應(yīng)的影響下，部分茶多酚遭受損失，最終保留量較少；作為不發(fā)酵茶的銀毫保留的多酚類物質(zhì)最多。

[1] 周金偉，陳 雪，易有金，等. 不同類型茶葉體外抗氧化能力的比較分析[J]. 中國食品學(xué)報，2014，14（8）：262-269.

[2] 趙 航，盛婧雪，李全順，等. 3種茶提取物對MCF-7細胞增殖、凋亡的影響及其與蛋白激酶B的相關(guān)性[J]. 中國生物制品學(xué)雜志，2011，24（1）：30-33.

[3] 金 亮，李小白，華 僑，等. 不同種類茶葉抗氧化活性及茶湯顏色參數(shù)比較[J]. 中國食品學(xué)報，2016，16（2）：242-250.

[4] 高玉萍，唐德松，龔淑英. 茶提取物抗氧化活性與茶多酚、兒茶素關(guān)系探究[J]. 中國食品學(xué)報，2013，13（6）：40-47.

[5] Karolina A W，Anna O，Tomasz O，et al. The influence of common free radicals and antioxidants on development of Alzheimer’s Disease[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy，2016，78（1）：39-49.

[6] Chen Y，Wang M F，Rosen R T，et al. 2,2-Dipheny1-1-picrylh ydrazy lradical-scavengingative components from polygonum multiflorum Thunb[J]. Joumal of Agricultural Food Chemistry，1999，（47）：226-228.

[7] 高 強，吳振瑩，方 玲，等. 青檀內(nèi)生真菌球毛殼的抗氧化活性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：293-296.

[8] Qixiao Z，Ruijie Y，Leilei Y et al. Screening of lactic acid bacteria with potential protective effects against cadmium toxicity[J]. Food Control，2015，（54）：23-30.

[9] 田寶玉，林麗萍，黃 薇，等. 低值水產(chǎn)品蛋白資源酶解產(chǎn)物的抗氧化性分析和評價[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（26）：110-114.

[10] Patrizia D，Aquila，Giuseppina Rose et al. SIRT3 gene expression: a link between inherited mitochondrial DNA variants and oxidative stress[J]. Gene，2012，497（2）：323-329.

[11] 郭紅英. 麥胚蛋白酶解物的制備及其抗氧化功能研究[D]. 鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué)，2009.

[12] 東 方，揭國良，何普明. 不同發(fā)酵程度茶葉的體內(nèi)與體外抗氧化功能比較[J]. 中國茶葉加工，2015，（4）：40-45.

（責(zé)任編輯：夏亞男）

Antioxidant Activity of Aqueous Extract of Tea

LUO Si-yuan1，GUO Hong-ying1,2，LI Qing-ming1,2，YANG Zhang-qing1
（1. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Changsha 410128, PRC）

Taking three kinds of tea, Yinhao, Tie Guanyin, Pu’er tea as the materials, added 150 times boiling water and soaked for 10 min, 15, 20, 2 and 30 min, through four chemical model (recucing power, scavenging activity against DPPH·and·OH and chelating activity) to investigate the antioxidant capacity of three kinds of tea aqueous extracts. The results showed that the antioxidant capacity of aqueous extract from not fermented tea Yinhao was the strongest and when the tea was soaked for 20 min, its aqueous extract had the best antioxidant capacity. According to the data obtained from four chemical models, the antioxidation effect of 3 kinds of tea water extract was: non-fermented tea (Yinhao) ＞ half fermentation tea (Tie Guanyin) ＞ fermentation tea (Pu’er).

tea; aqueous extract; antioxidant activity; fermented tea

TS272

：A

：1006-060X（2017）08-0081-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.008.022

2017-06-19

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)基金項目（11YJ17）

羅思媛（1996-），女，湖南邵陽市人，本科，主要從事農(nóng)副產(chǎn)品加工技術(shù)的研究。

郭紅英