不同前處理方式對(duì)水晶刺葡萄枝葉中白藜蘆醇含量的影響

李含晰，徐豐，石雪暉，劉昆玉，鐘曉紅*，楊國(guó)順

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院/湖南省葡萄工程技術(shù)研究中心，長(zhǎng)沙 410128）

不同前處理方式對(duì)水晶刺葡萄枝葉中白藜蘆醇含量的影響

李含晰，徐豐，石雪暉，劉昆玉，鐘曉紅*，楊國(guó)順

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院/湖南省葡萄工程技術(shù)研究中心，長(zhǎng)沙 410128）

本文以水晶刺葡萄葉片和新梢為試驗(yàn)材料，采用超聲波輔助提取白藜蘆醇，高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè)其含量，并分別對(duì)烘干溫度、破碎度對(duì)其白藜蘆醇含量的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明，水晶刺葡萄樣品前處理在50～100 ℃范圍內(nèi)最佳烘干溫度為90 ℃，在30～100目范圍內(nèi)最佳粉碎度為40目，在此處理下，水晶刺葡萄葉片白藜蘆醇含量達(dá)到6.22±0.34 μg/g，水晶刺葡萄新梢白藜蘆醇含量達(dá)到11.23±0.29 μg/g。

高效液相色譜法；水晶刺葡萄；白藜蘆醇；前處理

白藜蘆醇（Resveratrol）是植物次生代謝產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇存在順?lè)词疆悩?gòu)體，自然界中多存在反式白藜蘆醇[1]，比順式白藜蘆醇生物活性和藥理作用高。研究表明，白藜蘆醇具有降低血脂、降低粥動(dòng)脈硬化、抗癌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等藥理作用[2-4]。野生葡萄種質(zhì)資源刺葡萄（Vitis davidii Fo?x.）的葉、新梢、果皮、酒渣中都含有大量白藜蘆醇[5-8]。在湖南省懷化市發(fā)現(xiàn)的水晶刺葡萄是刺葡萄的新類型[9]，該刺葡萄生物學(xué)性狀與普通刺葡萄有較大的差異，普通刺葡萄的果實(shí)都為紫黑色，而水晶刺葡萄的果實(shí)為白色。目前刺葡萄的研究多集中于種質(zhì)資源[10-12]、抗病性[13-14]、釀酒[15-16]等方面，功能成分方面也多集中于刺葡萄籽油和花色素的提取與利用[17-19]，而有關(guān)水晶刺葡萄白藜蘆醇前處理以及檢測(cè)方面的相關(guān)報(bào)道較少。本試驗(yàn)以水晶刺葡萄修剪后的葉片、新梢為試驗(yàn)材料，采用超聲波輔助提取白藜蘆醇，高效液相色譜檢測(cè)其含量，再分別對(duì)前處理中烘干溫度、粉碎度對(duì)白藜蘆醇含量的影響進(jìn)行研究，為水晶刺葡萄修剪后的廢棄枝葉中白藜蘆醇的開(kāi)發(fā)以及利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及設(shè)備

供試材料：試驗(yàn)以水晶刺葡萄修剪后的葉片、新梢為材料，采摘于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄教學(xué)科研基地，基地采用“V”型架，株行距1.0 m×2.5 m，南北行向，2012年高接，砧木為紅地球，常規(guī)管理措施。

供試試劑：白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（Aladdin公司，分析標(biāo)準(zhǔn)品）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；超純水。

試驗(yàn)設(shè)備：Agilent 1260 LC高效液相色譜系統(tǒng)工作站，DAD檢測(cè)器；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器；電子分析天平；30目、40目、60目、100目標(biāo)準(zhǔn)篩。

1.2 方法

1.2.1供試樣品含水量測(cè)定

稱取修剪后的水晶刺葡萄葉片、新梢各200 g，清洗掉灰塵，平鋪在干燥鋁盤中，厚度適中，放入烘箱中烘干至樣品質(zhì)硬而脆、質(zhì)量不再改變。重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，含水量計(jì)算公式如下：

式中：W1為新鮮樣品質(zhì)量（g）；W2為烘干樣品質(zhì)量（g）。

1.2.2白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取5.000 mg白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇混勻，定容為200 μg/mL的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成5、10、20、40、80 μg/mL溶液進(jìn)樣分析，以白藜蘆醇濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程。

1.2.3供試樣品前處理工藝

（1）烘干溫度。分別稱取同一批修剪后的水晶刺葡萄葉片和新梢，分別放置在50 ℃、70 ℃、90 ℃條件下烘干至葉片和新梢質(zhì)硬而脆、質(zhì)量不再改變，記錄干燥時(shí)間，過(guò)40目標(biāo)準(zhǔn)篩備用，用超聲波輔助法提取白藜蘆醇。

（2）粉碎度。取90 ℃條件下烘干水晶刺葡萄葉片和新梢，粉碎處理，分別過(guò)30目、40目、60目、100目標(biāo)準(zhǔn)篩備用，采用超聲波輔助提取法進(jìn)行白藜蘆醇的提取。

1.2.4水晶刺葡萄枝葉中白藜蘆醇超聲波提取

準(zhǔn)確稱取樣品粉末1.00 g，置于50 mL離心管中，加25 mL甲醇，封口避光超聲1 h，11000 r/min高速離心10 min，取上清液，定容至25 mL棕色容量瓶中。進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即為待測(cè)樣品溶液。

1.2.5水晶刺葡萄枝葉中白藜蘆醇含量檢測(cè)

參照楊星星[3]的HPLC檢測(cè)方法測(cè)定白藜蘆醇含量，并對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行一定修改。色譜條件：（1）色譜柱：Agilent ZORBA SB-C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；（2）流動(dòng)相：水-乙腈，梯度洗脫程序：0～10 min，10%乙腈；10～20 min，20%乙腈；20～30 min，40%乙腈，30～35 min，85%乙腈；35～45 min，10%乙腈；（3）流速：0.8 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm。各樣品重復(fù)處理6次，計(jì)算白藜蘆醇含量的平均值，白藜蘆醇含量計(jì)算公式如下：

式中：C為根據(jù)回歸方程計(jì)算得到的白藜蘆醇質(zhì)量濃度（μg/mL）；V為提取溶液體積（mL）；W為所稱取樣品粉末質(zhì)量（g）。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)運(yùn)用Origin 8.0和SPSS 17.0版數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，白藜蘆醇含量的單位為：μg/g（以干重質(zhì)量計(jì)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試樣品含水量測(cè)定

新鮮水晶刺葡萄葉片含水量平行測(cè)定3次，得含水量78.00%、80.67%、81.33%，取平均含水量為80.00%。

新鮮水晶刺葡萄新梢含水量平行測(cè)定3次，得含水量72.40%、71.60%、71.60%，取平均含水量為71.87%。

2.2 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

測(cè)定稀釋標(biāo)準(zhǔn)品白藜醇濃度，得到白藜蘆醇線性回歸方程為Y=173.89X+14.313，方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，表明線性關(guān)系良好。信噪比（S/N）為3∶1時(shí)，得到白藜蘆醇質(zhì)量濃度最低檢出限為0.03 μg/mL。

將5 μg/mL的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和水晶刺葡萄葉片、新梢供試樣品溶液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，依次進(jìn)樣，得到白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液、水晶刺葡萄葉片、新梢供試樣品溶液（見(jiàn)圖1、圖2和圖3）的色譜圖，白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液的保留時(shí)間為20.801 min，供試樣品溶液的保留時(shí)間20.840～20.945 min。

2.3 烘干溫度對(duì)水晶刺葡萄枝葉中白藜蘆醇含量的影響

由表1可知，隨著烘干溫度的升高，烘干時(shí)間不斷縮短，白藜蘆醇含量也不斷提高。葉片在50～90 ℃溫度范圍內(nèi)隨著烘干溫度升高，烘干時(shí)間縮短，白藜蘆醇含量不斷增加。當(dāng)烘干溫度為90 ℃時(shí)，烘干時(shí)間最少，為4.7 h，比50 ℃所用的時(shí)間節(jié)省了3.06倍，白藜蘆醇含量達(dá)到最高，為6.22±0.34 μg/g，比50 ℃時(shí)的白藜蘆醇含量提高了3.51倍；新梢在50～90 ℃范圍內(nèi)隨著烘干溫度升高，白藜蘆醇含量快速提高，當(dāng)烘干溫度為90 ℃時(shí)，烘干時(shí)間最少，為8.7 h，比50℃時(shí)所用的時(shí)間節(jié)省了4.13倍，白藜蘆醇含量達(dá)到最高，為11.23±0.29 μg/g，比50℃時(shí)的白藜蘆醇含量提高了5.82倍。在50～90 ℃范圍內(nèi)，新梢的烘干時(shí)間始終比葉片所需的時(shí)間多，多了將近1倍，而新梢的白藜蘆醇含量始終比葉片高，這說(shuō)明新梢白藜蘆醇含量比葉片含量相對(duì)較高。

2.4 粉碎度對(duì)水晶刺葡萄枝葉中白藜蘆醇含量的影響

由表2可知，水晶刺葡萄供試品粉末粉碎度不同，白藜蘆醇含量也不同。水晶刺葡萄葉片粉末從30目到40目時(shí)隨著粉碎度增加，白藜蘆醇含量也增加，當(dāng)粉碎度為40目時(shí)，白藜蘆醇含量達(dá)到最高，為6.22±0.34 μg/g，而破碎度超過(guò)40目后，白藜蘆醇含量明顯減少；水晶刺葡萄新梢粉末從30目到40目時(shí)隨著粉碎度增加，白藜蘆醇含量也增加，當(dāng)粉碎度為40目時(shí)，白藜蘆醇含量達(dá)到最高，為11.23±0.29 μg/g，而破碎度超過(guò)40目后，白藜蘆醇含量有所減少。

綜上所述，水晶刺葡萄樣品前處理在50～100 ℃范圍內(nèi)最佳烘干溫度為90 ℃，在30～100目范圍內(nèi)最佳粉碎度為40目。

圖1 反式-白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

3 討論與結(jié)論

在筆者前期試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在水晶刺葡萄鮮葉中檢測(cè)不到白藜蘆醇，但在不同溫度烘干后，都有白藜蘆醇被檢測(cè)出，且不同烘干溫度對(duì)白藜蘆醇含量的影響較大，尤其是在90 ℃烘干溫度下，水晶刺葡萄葉片白藜蘆醇含量達(dá)到6.22±0.34 μg/g，新梢中含量達(dá)到11.23±0.29 μg/g，這可能是離體后的樣品還具有生物活性，在受到非生物脅迫時(shí)（高溫），白藜蘆醇等次生代謝物合成加劇。謝紅旗等[20]的研究表明，中藥材的采后干燥過(guò)程，對(duì)于藥材來(lái)說(shuō)是一個(gè)水分脅迫的過(guò)程，在這一過(guò)程中會(huì)啟動(dòng)植物的抗旱應(yīng)激機(jī)制而導(dǎo)致某些次生代謝產(chǎn)物的量上升，本研究結(jié)果與此結(jié)論一致。還有可能是烘干溫度越高，烘干時(shí)間就越短，白藜蘆醇的降解時(shí)間也縮短。

圖2 水晶刺葡萄葉片中白藜蘆醇色譜圖

圖3 水晶刺葡萄新梢中白藜蘆醇色譜圖

水晶刺葡萄葉片的樣品粉碎度對(duì)白藜蘆醇含量的影響較大，通過(guò)粉碎可以將在薄壁細(xì)胞組織內(nèi)的白藜蘆醇釋放出來(lái)。粉碎度越大，樣品粉末越細(xì)，在相同的樣品質(zhì)量與溶劑體積條件下，粉末進(jìn)樣量增加，即在一定范圍內(nèi)，隨著破碎度的增加，增大了粉末與提取溶劑的接觸面積，含量提高。但當(dāng)樣品過(guò)于粉碎，粉末目數(shù)增加到一定量時(shí)，固液分離的難度加大，過(guò)濾時(shí)濾渣中殘留的濾液量增多，損失加大，使含量反而下降，且粉末過(guò)細(xì)，提取出的雜質(zhì)也越多，不利于色譜檢測(cè)分析。本研究與王漫等[21]的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)果較為一致。

不同前處理方式對(duì)水晶刺葡萄枝葉白藜蘆醇提取有較大影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，水晶刺葡萄樣品前處理在50～100 ℃范圍內(nèi)最佳烘干溫度為90 ℃，在30～100目范圍內(nèi)最佳粉碎度為40目。在此處理下，刺葡萄葉片白藜蘆醇含量達(dá)到6.22±0.34 μg/g，刺葡萄新梢白藜蘆醇含量達(dá)到11.23±0.29 μg/g。

表1烘干溫度對(duì)白藜蘆醇含量的影響

表2 粉碎度對(duì)白藜蘆醇含量的影響

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The influences of different pretreatment methods on the resveratrol contents of young sprouts and leaves in Vitis davidii Fo?x Shuijing

LI Hanxi, XU Feng, SHI Xuehui, LIU Kunyu, ZHONG Xiaohong*, YANG Guoshun
(Horticulture and Landscape College of Hunan Agricultural University/Hunan Engineering Technology Research Center for Grape, Changsha 410128)

In this paper, ultrasonic-assisted method were used to extract resveratrol from leaves and yound sprouts of Vitis davidii Fo?x Shuijing respectively, to determine the resveratrol content by HPLC method. The influences of different drying temperature and degree of aperture on the content of resveratrol and the content variation of resveratrol in leaves and young sprouts of Vitis davidii Fo?x Shuijing were investigated. The results showed that the optimum drying temperature and degree of fragmentation were 90 ℃ and 40 meshes respectively, in which the content of resveratrol in leaves reached 6.22±0.34 μg/g, the content of resveratrol in young sprouts reached 11.03±0.29 μg/g.

HPLC; Vitis davidii Fo?x Shuijing; resveratrol; pretreatment method

S663.1

：A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.04.006

2017-06-06

湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（cx2013B291）

李含晰（1992-），女，碩士研究生，主要從事葡萄功能成分研究。E-mail: 2686863245@qq.com

*通訊作者：鐘曉紅，女，教授，E-mail: xh-zhong@163.com