論酒精發(fā)酵中酵母菌的有效活化與營養(yǎng)管理

都振江，徐金輝，曹明秀*

（1. 中糧長城葡萄酒（煙臺）有限公司，山東蓬萊 265608；2. 吐魯番樓蘭酒莊股份有限公司，新疆鄯善 838201；3. 上海杰兔工貿(mào)有限公司，上海 200120）

論酒精發(fā)酵中酵母菌的有效活化與營養(yǎng)管理

都振江1，徐金輝2，曹明秀3*

（1. 中糧長城葡萄酒（煙臺）有限公司，山東蓬萊 265608；2. 吐魯番樓蘭酒莊股份有限公司，新疆鄯善 838201；3. 上海杰兔工貿(mào)有限公司，上海 200120）

本文通過大量的研究案例和成果，深入論述了酵母的活化保護及營養(yǎng)管理的重要性及其對酒精發(fā)酵的貢獻。在酵母活化復(fù)水時應(yīng)用專業(yè)活化保護劑Goferm Protect，可以補充大量甾醇類，強化酵母菌細胞膜，顯著增強其生存能力，降低死亡率。在酒精發(fā)酵1/3階段，使用有機營養(yǎng)劑Fermaid O，相比使用單純的無機氮源DAP，不僅能夠提高發(fā)酵速率，縮短發(fā)酵時間，而且顯著提升了葡萄酒的感官品質(zhì)。

酒精發(fā)酵；酵母菌；活化保護劑；營養(yǎng)

在葡萄酒釀造中，酵母面臨滲透壓、長時間處于不斷上升的乙醇酒汁中、自生菌的競爭、培養(yǎng)基的酸度以及營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等環(huán)境限制[1]。酵母菌應(yīng)對不同的環(huán)境脅迫有多種反應(yīng)機制：細胞內(nèi)累積甘油以應(yīng)對外界高滲透壓；排出質(zhì)子以調(diào)節(jié)pH；胞內(nèi)排出乙醇；釋放嗜殺型毒素以抵抗自生菌污染等。然而一旦環(huán)境中的限制因素作用時間長并不斷加強時，有機體必須調(diào)動能量和資源來應(yīng)對挑戰(zhàn)，同時，防御系統(tǒng)越來越弱，對外界的刺激越來越敏感，直至死亡。具體到酒精發(fā)酵中，會引起發(fā)酵偏差或緩慢，酒汁感官品質(zhì)差，甚至?xí)斐砂l(fā)酵停滯。因此，對酵母菌進行有效活化和營養(yǎng)管理是保障酒精發(fā)酵順利進行的關(guān)鍵工藝點。

1 酵母的選用及有效活化

生物個體對環(huán)境的反應(yīng)能力是不同的，例如不同酵母的耐酒精能力也不同，因此，針對糖度較高的葡萄酒汁發(fā)酵，通常會選用耐酒精的經(jīng)典款酵母BDX、D254、Clos、DV10、EC1118、L2226及L2323等[2]。

為了抵制發(fā)酵惡劣環(huán)境，可以在酵母活化時為酵母添加一層甾醇，強化酵母細胞膜，提高在困難環(huán)境中的生存能力。在一定條件下，酵母自身在氧氣參與的條件下可以合成甾醇，但是過多的氧氣會給酵母帶來不穩(wěn)定的甾醇。在酵母復(fù)水活化階段，酵母菌能將復(fù)水活化液中的甾醇加入到自身細胞膜上。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Goferm Protect活化保護的酵母細胞膜在電鏡下觀察明顯比未經(jīng)處理組厚實[3-4]。

在酒精發(fā)酵過程中，高糖、高酸、高澄清或缺氧的環(huán)境對酵母的影響是非常顯著的。圖1顯示了三種酵母在酒精發(fā)酵完成后死亡細胞數(shù)量的變化[3-4]。由圖1可以觀察到，三種酵母菌株DV10、KD和58W3在添加活化保護劑Goferm Protect后，均顯著的增強自身生存能力，空白組的死亡率明顯高于Goferm Protect組。試驗也證實營養(yǎng)劑在發(fā)酵動力學(xué)和感官方面有非常積極的影響，而對酵母存活率沒有直接影響。因此，使用專業(yè)酵母活化保護劑能夠使酵母更強地抵抗含有酒精和其他毒素等基質(zhì)脅迫和壓力，顯著降低感官偏差的風(fēng)險。

2 全面平衡的營養(yǎng)

抵抗環(huán)境脅迫存活下來只是酵母的第一道關(guān)卡，如何在酒精發(fā)酵中更好的表現(xiàn)出其品質(zhì)也是同樣重要的。葡萄汁中平衡充足的營養(yǎng)物質(zhì)是酵母順利完成發(fā)酵的前提條件，這些主要的營養(yǎng)物質(zhì)包括：酵母可同化利用氮、礦物質(zhì)、維生素等[5]。

2.1 氮源

葡萄汁中的氮以不同的形式存在：蛋白質(zhì)、多肽、銨離子（NH4+）和其他α-氨基酸。酵母可同化利用氮由銨離子和除脯氨酸以外的α-氨基酸組成。純天然葡萄汁中的可同化吸收利用氮濃度在60～500 mg/L之間，根據(jù)葡萄的品種、年份以及微氣候略有不同。通常情況下，天然葡萄汁中的可同化利用氮是缺乏的?？赏玫軌虮唤湍肝绽煤铣傻鞍踪|(zhì)，保障自身繁殖，對發(fā)酵動力學(xué)也有重要影響。酵母前期的自身繁殖會消耗大量的可同化利用氮，后期氮水平降低，酵母的蛋白合成和糖轉(zhuǎn)運功能降低，此時加入外源可同化利用氮將提高發(fā)酵速率，縮短發(fā)酵時間。

廣泛的研究發(fā)現(xiàn)，氮的最佳添加時間是1/3酒精發(fā)酵階段（當酵母數(shù)量達到最大值時），此時葡萄汁中的氮消耗殆盡[6]。在酒精發(fā)酵開始時應(yīng)控制無機氮源的大量存在，否則會導(dǎo)致酵母大量快速繁殖，氮被大量消耗的同時會產(chǎn)生過多的熱量，從而不會有多余的氮供酵母消耗將糖轉(zhuǎn)化為酒精。如果是有機氮源，可以在酒精發(fā)酵開始時添加，并在1/3階段補加。因為可同化吸收氮中的氨基酸態(tài)氮（有機氮）和銨離子氮（無機氮）吸收利用方式是不同的。氨基酸通過主動運輸?shù)姆绞竭M入細胞累積，能夠被直接利用合成蛋白質(zhì)，降解為NH4+或者轉(zhuǎn)化為谷氨酸。這種吸收利用方式相比無機氮的利用緩慢、穩(wěn)定而有效，而NH4+直接被酵母消耗掉而未必有益。

圖1 Goferm Protect對酵母存活率的影響

2.1.1氨基酸對酵母酯類物質(zhì)產(chǎn)量的影響

葡萄汁中的氨基酸組成及含量對葡萄酒的香氣感官有重要影響，換句話說，發(fā)酵中氨基酸的含量影響著酒精和酯類物質(zhì)的生成。在新疆霞多麗葡萄汁中分別添加無機氮源DAP、有機營養(yǎng)劑包（Fermaid O）和營養(yǎng)劑組合（DAP和Fermaid O）進行發(fā)酵對比，圖2顯示了部分試驗結(jié)果，添加與DAP相同含量可同化利用氮（50 mg/L）的復(fù)合營養(yǎng)劑，各種酯類化合物均有不同程度的增加；而添加24 mg/L的有機營養(yǎng)劑包Fermaid O的處理中多種酯類化合物均顯著增加[6-7]。可以得出結(jié)論：等量的可同化利用氮（YAN），含有部分氨基酸態(tài)氮的營養(yǎng)劑更能促進酯類化合物的生成；而相比營養(yǎng)劑組合，完全有機營養(yǎng)劑包Fermaid O（即使可同化利用氮含量低，但氨基酸含量更高）更能夠顯著提升酯類物質(zhì)產(chǎn)量。

圖2 DAP和Fermaid O含量對酯類物質(zhì)產(chǎn)量的影響（2014霞多麗，中國新疆）

2.1.2不同氮源對硫醇物質(zhì)產(chǎn)量的影響

硫醇化合物的生成也與氮的代謝有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵中過多的銨離子（無機氮）或在開始發(fā)酵時添加過多的銨離子（無機氮）會限制酵母對葡萄品種香氣硫醇物質(zhì)的釋放[8]。這種現(xiàn)象可被解釋為代謝阻遏，銨離子阻斷了酵母氨基酸的合成和轉(zhuǎn)運，進而限制硫醇前體物質(zhì)半胱氨酸進入細胞，最終使細胞內(nèi)合成不穩(wěn)定易分解的硫醇。在新疆赤霞珠葡萄上試驗顯示（圖3），當發(fā)酵中使用無機氮源DAP時，硫醇物質(zhì)3-MH和3-MHA產(chǎn)量明顯降低[6-7]。另一個試驗（圖4）是對法國羅納河谷的鴿籠白葡萄酒精發(fā)酵開始時和1/3酒精發(fā)酵階段分別添加兩種不同的有機營養(yǎng)劑進行發(fā)酵，可以發(fā)現(xiàn)，兩種有機營養(yǎng)劑對3-MH和3-MHA的產(chǎn)出均有積極作用，能夠促進硫醇物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和釋放[6-7]。

2.1.3有機營養(yǎng)劑對葡萄酒感官品質(zhì)的影響

酯類物質(zhì)和硫醇類物質(zhì)是葡萄酒中的主要香氣成分，酯類和硫醇產(chǎn)量的增加必將提升葡萄酒的香氣品質(zhì)。通過大量的感官試驗對比，有機營養(yǎng)劑和無機氮源營養(yǎng)劑的應(yīng)用效果（圖5）有顯著差別，而且，有機營養(yǎng)在發(fā)酵中的應(yīng)用對葡萄酒最終的感官品質(zhì)具有非常積極的影響，所釀酒品深受專業(yè)品酒者的喜愛，口感更復(fù)雜，香氣更濃郁和持久[6-7]。

圖3 DAP對3-MH和3-MHA產(chǎn)量的影響

2.2 礦物質(zhì)

葡萄汁中礦物質(zhì)的生物利用率通常很低，因其經(jīng)常和葡萄汁中的其他成分（如蛋白質(zhì)和多酚）結(jié)合。過熟的葡萄礦物質(zhì)含量更低，而被真菌感染的葡萄會被消耗掉大量礦物質(zhì)。土壤類型和栽培管理對礦物質(zhì)含量也有重要影響。此外，葡萄中各種礦物質(zhì)之間的平衡也很重要，研究發(fā)現(xiàn)過多的鈣會抑制鎂的正常吸收。酵母細胞對鎂需求高，因為鎂參與一些酶的激活，在糖酵解途徑中，對酵母的己糖激酶和磷酸果糖激酶活性起著重要作用；鎂穩(wěn)定細胞膜結(jié)構(gòu)，在抵抗酒精滲透壓方面也有重要作用，有限的鎂會限制酵母的生長和發(fā)酵活度。有研究顯示，鉀素缺乏會影響酵母細胞存活率，尤其在低pH環(huán)境中容易引起發(fā)酵停滯[9]。因此，補足豐富多樣的礦物質(zhì)對酒精發(fā)酵具有積極作用。

2.3 維生素

生物素是維生素的一種，對發(fā)酵中酯類物質(zhì)的產(chǎn)生和酵母細胞的活力有重要作用。當生物素缺乏時，會顯著影響酵母細胞生長。泛酸（維生素B5）幫助避免H2S和揮發(fā)酸的產(chǎn)生。硫胺素（維生素B1）對發(fā)酵速率有重要影響，缺乏容易引起發(fā)酵停滯，供應(yīng)充足能夠增進酵母細胞數(shù)量和發(fā)酵速率[10]。在發(fā)酵初期，大多數(shù)葡萄汁含有酵母需要的部分主要維生素，但是變化很快。例如硫胺素和生物素在發(fā)酵的第一個階段很快被消耗掉，如果硫胺素和SO2的結(jié)合則不能被酵母利用。在預(yù)發(fā)酵階段，野生菌也會消耗大部分的主要維生素。因此，補足維生素的極其重要。

圖5 有機營養(yǎng)劑對葡萄酒感官品質(zhì)的影響（2012維歐尼，法國羅納河谷）

表1 活化保護劑及發(fā)酵營養(yǎng)劑各種主要成分分析

3 活化保護劑及發(fā)酵營養(yǎng)劑的主要成分

表1列出了添加量0.30 g/L的Goferm Protect、Fermaid E、Fermaid O以及DAP的各種重要因子或營養(yǎng)成分和可同化利用氮含量。Goferm Protect是一種酵母活化保護劑，其主要成分為甾醇，在酵母復(fù)水活化時添加，可強化酵母細胞膜，顯著增強細胞生存能力，降低其死亡率。雖然Goferm Protect也含有部分營養(yǎng)物質(zhì)（氨基酸、維生素、礦物質(zhì)），但其不能替代發(fā)酵營養(yǎng)助劑。DAP只是簡單的無機氮源，而沒有其他營養(yǎng)物質(zhì)，如果葡萄汁只是簡單的氮缺乏，可以在1/3酒精發(fā)酵階段適當補充。Fermaid O是完全有機發(fā)酵全營養(yǎng)包，富含多種有機營養(yǎng)（特別是氨基酸），對葡萄酒的感官品質(zhì)有重要影響。Fermaid E是一種復(fù)合發(fā)酵全營養(yǎng)包，是無機氮源和有機全營養(yǎng)包的組合，氨基酸含量較Fermaid O略低。

4 小結(jié)

保障酒精發(fā)酵質(zhì)量水平的第一個關(guān)鍵工藝點，就是對酵母的復(fù)水活化與保護。專業(yè)活化保護劑Goferm Protect的應(yīng)用，為酵母補充甾醇而強化其細胞膜，顯著增強其生存能力和健康活力，提高接種酵母的活化率。

天然葡萄汁中的營養(yǎng)物質(zhì)通常是缺乏和不均衡的，并且在酒精發(fā)酵開始時易被酵母快速消耗殆盡以滿足其細胞增殖。在酒精發(fā)酵啟動及1/3階段及時補充有機營養(yǎng)包Fermaid O或復(fù)合全營養(yǎng)包 Fermaid E，使葡萄汁中均衡且富含酵母所需各種重要有機營養(yǎng)物（氨基酸、維生素、礦物質(zhì)）。不僅能夠提高發(fā)酵穩(wěn)定性和水平，縮短發(fā)酵時間，而且能夠促進酯類和硫醇物質(zhì)的生成，保障口感細膩，從而顯著提升葡萄酒的感官品質(zhì)。

[1] 徐國強, 杜婕, 吳滿珍, 等. 酒精發(fā)酵過程中釀酒酵母耐受環(huán)境脅迫的研究進展[J]. 微生物學(xué)雜志, 2013(6): 80-83.

[2] 俞惠明, 曹明秀. 淺談炎熱氣候條件下葡萄收獲時間及釀酒方案的選擇[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2017(2): 57-60.

[3] The state of the art. Yeast nutrition and protection for good alcoholic fermentation[EB/OL]. [2017-06-05]. http://www.vawa.net/ winemaking-articles/Lallemand%20Yeast%20Nutrition.pdf.

[4] Goferm protect detail[EB/OL]. [2017-06-04]. http://www. lallemandwine.com/ australia-new-zealand/ products/catalogue/ product-detail/6/nutrient-protectors/4/goferm-protect/.

[5] 李雪霞, 秦曉媛, 雷順新. 葡萄汁生產(chǎn)及研究現(xiàn)狀[J]. 輕工科技, 2010, 26(2): 1-3.

[6] The wine expert. The many roles of nitrogen in alcoholic fermentation[R/OL]. [2017-06-05]. http://www.lallemandwine.com/ wp-content/uploads/2015/08/WE8-Nitrogen.pdf.

[7] ORTIZ-JULIEN A, DUMONT A, LORDAT E, et al. Nitrogen plays many roles during fermentation uncovering the relationship between nitrogen and aroma development[J].Wine & Vines, 2016(1): 117-121.

[8] SUBILEAU M, SCHNEIDER R, SALMON J M, et al. New insights on 3-mercaptohexanol (3MH) biogenesis in Sauvignon Blanc wines: Cys-3MH and (E)-hexen-2-al are not the major precursors[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2008, 56(19): 9230-9235.

[9] KUDO M, VAGNOLI P, BISSON L F. Imbalance of pH and potassium concentration as a cause of stuck fermentations[J]. American Journal of Enology & Viticulture, 1998, 49(3): 295-301.

[10] BATAILLON M, RICO A, SABLAYROLLES J M, et al. Early thiamin assimilation by yeasts under enological conditions: Impact on alcoholic fermentation kinetics[J]. Journal of Fermentation & Bioengineering, 1996, 82(2): 145-150.

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.04.030

2017-06-11

都振江，男，工程碩士，高級工程師，國家葡果酒評委，長期從事葡萄與葡萄酒的技術(shù)與管理工作。

*通訊作者：曹明秀（1991-），女，工學(xué)碩士學(xué)位，研究方向食品科學(xué)。E-mail: cmingxiu@jatou.com