3株果實(shí)采后葡萄孢屬真菌ITS區(qū)rDNA序列與碳源代謝指紋圖譜分析

姚 婷， 陳其葳， 張 燕， 張 萌， 何欣萌， 王友升

(北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室， 北京 100048)

3株果實(shí)采后葡萄孢屬真菌ITS區(qū)rDNA序列與碳源代謝指紋圖譜分析

姚 婷， 陳其葳， 張 燕， 張 萌， 何欣萌， 王友升*

(北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室， 北京 100048)

從采后貯藏過(guò)程中發(fā)病的草莓、藍(lán)莓和櫻桃果實(shí)中分離到3株絲狀真菌138#、233#和366#。綜合形態(tài)學(xué)特征觀察與ITS區(qū)rDNA序列分析結(jié)果，可確定3株真菌均為葡萄孢屬病原菌(Botrytis)。分子鑒定進(jìn)化樹和碳源代謝聚類分析結(jié)果，都得到菌株138#與366#在一個(gè)大的分支上，而菌株233#在一個(gè)分支上。菌株138#鑒定結(jié)果與Botrytiscinerea(KJ937044.1)在同一分支上親緣性達(dá)100%，且與366#親緣性達(dá)99%；菌株233#鑒定結(jié)果與Botrytiselliptica(EU519207.1) 在同一分支上且親緣性達(dá)100%。95種碳源代謝指紋圖譜分析的結(jié)果表明，3株葡萄孢屬病原菌對(duì)吐溫80、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-D-葡萄糖胺和苦杏仁苷等67種碳源的代謝能力相同，包括56種最適碳源、1種可利用碳源和10種不可利用碳源，Biolog系統(tǒng)中鑒定出3株絲狀真菌均與B.cinereaPers.BGA相近，其中菌株233#與B.cinerea的代謝指紋圖譜最為相近。

果實(shí)； 葡萄孢菌； ITS區(qū)rDNA序列分析； 碳源代謝指紋圖譜

葡萄孢屬真菌是果蔬采后貯藏期間常見(jiàn)的侵染性病原菌，是分布廣泛的兼性寄生菌，有性態(tài)為富氏葡萄核盤菌(Botryotiniafuckeliana)[1-2]。目前報(bào)道最多的灰葡萄孢菌(B.cinerea)屬半知菌亞門絲胞綱絲胞目淡色孢科葡萄孢屬真菌，能引起藍(lán)莓、番茄、葡萄和草莓等果蔬的采后病害[3-5]；而蔥腐葡萄孢菌(B.allii)和蒜蔥鱗葡萄孢霉(B.squamosa)能引起蒜薹 “爛窩病”[6]。此外，也有關(guān)于蠶豆葡萄孢(B.fabae)和擬蠶豆葡萄孢(B.fabiopsis)能引起蠶豆赤斑病的報(bào)道[7]。但該屬其他病原菌引起的病害報(bào)道較少，而且不同寄主來(lái)源的葡萄孢屬病原菌屬內(nèi)種間的親緣關(guān)系尤其對(duì)碳源利用的差異性，還需進(jìn)一步闡明。

利用不同物種間的ITS區(qū)rDNA序列構(gòu)建進(jìn)化樹，可確定微生物屬內(nèi)種間的親緣關(guān)系[8-10]。利用不同物種對(duì)碳源的適應(yīng)性不同，F(xiàn)F鑒定板上培養(yǎng)的霉菌在Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)中可得到目的菌株對(duì)不同碳源的利用情況，獲得該菌種的碳源代謝指紋圖譜[11-13]。前期利用ITS區(qū)rDNA序列和碳源代謝指紋圖譜分析對(duì)桃、李果實(shí)采后褐腐病菌的親緣關(guān)系進(jìn)行區(qū)分的結(jié)果表明，2種方法具有可比性[14]。但目前未見(jiàn)利用ITS區(qū)rDNA序列和碳源代謝指紋圖譜分析對(duì)于果實(shí)采后葡萄孢屬病原菌之間親緣關(guān)系的報(bào)道。

本研究從采后貯藏期間發(fā)病的草莓、藍(lán)莓和櫻桃果實(shí)中分離到3株絲狀葡萄孢屬(Botrytis)病原真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和真菌ITS 區(qū)rDNA序列分析，并比較分析碳源代謝指紋聚類和分子鑒定系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，以期為不同果實(shí)采后灰霉病菌的營(yíng)養(yǎng)生理研究、病害防治及真菌種間關(guān)系研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株

絲狀病原真菌138#、233#和366#分別分離于采后貯藏過(guò)程中自然發(fā)病草莓、藍(lán)莓和櫻桃果實(shí)。

1.1.2培養(yǎng)基

馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)：取200 g馬鈴薯切片加1 L蒸餾水，煮沸30 min后的濾汁，加入瓊脂18 g、葡萄糖20 g、加水補(bǔ)足1 L，121 ℃滅菌20 min。麥芽浸粉培養(yǎng)基(ME)：瓊脂18 g、麥芽浸粉20 g，調(diào)節(jié)pH值至5.5±0.2，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3試劑與儀器設(shè)備

三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸鈉(SDS) 、乙二胺四乙酸鈉(EDTA) 購(gòu)自Amersco公司。Invitrogen公司合成PCR引物ITS-4和ITS-5、天根生化試劑公司DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2×Taq PCR MasterMix。FF MICRO PLATE，美國(guó)Biolog公司。

Axio Image A1型顯微鏡，德國(guó)Zeiss公司；生物安全柜，美國(guó)Thermo公司；微生物鑒定系統(tǒng)，美國(guó)

Biolog公司；PCR儀，美國(guó)Bio-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種的分離、純化與回接

取發(fā)病的草莓、藍(lán)莓和櫻桃果實(shí)發(fā)病與未發(fā)病交界處組織于PDA上，25 ℃培養(yǎng)1～3 d。取菌落外緣菌塊，分別3點(diǎn)轉(zhuǎn)接到PDA和ME上，25 ℃培養(yǎng)7,14 d后觀察菌落形態(tài)和孢子形態(tài)特征。以75%乙醇對(duì)健康無(wú)損傷的草莓、藍(lán)莓和櫻桃果實(shí)表面消毒后刺傷，傷口處接種純化后的菌塊，觀察果實(shí)接種處的病癥。

1.2.2基因組DNA的提取及ITS區(qū)PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定

采用改良后SDS-氯化芐法提取待鑒定菌株的DNA[9]。以ITS-4和ITS-5為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出ITS區(qū)，PCR產(chǎn)物由華大基因測(cè)序，結(jié)果在NCBI同源序列比對(duì)，在StrainInfo中搜索模式菌株，將3株分離菌ITS區(qū)rDNA序列與同源序列和模式菌株序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并且構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.3碳源代謝指紋圖譜分析

用棉簽收集26 ℃下PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)120 h后的3株病原菌的孢子，用FF-IF濁度標(biāo)準(zhǔn)液制備T(透光率)=(75+2)%的菌懸液。在FF微孔板中每孔加100 μL菌懸液，26 ℃培養(yǎng)7 d后，用Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)讀取96孔FF板鑒定結(jié)果，獲得病原菌的代謝指紋圖譜，F(xiàn)F板的碳源分布如表1。

表1 FF板的碳源分布

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與回接

分別從自然發(fā)病的“雙流冬”草莓、“兔眼”藍(lán)莓和“水晶”櫻桃果實(shí)發(fā)病部位分離到絲狀真菌138#、233#和366#，見(jiàn)圖1a、1b、1c。將分離得到菌株純化后回接到草莓、藍(lán)莓和櫻桃果實(shí)傷口處，在接種部位均出現(xiàn)病癥(見(jiàn)圖1d、1e、1f)，并能從該病害部位再次分離得到相應(yīng)病原菌，因此，可確定它們均為相應(yīng)果實(shí)的病原菌。

2.2 病原菌的形態(tài)觀察

2.2.1菌落形態(tài)

將3株真菌138#、233#和366#在PDA和ME上25 ℃培養(yǎng)7 d和14 d，觀察菌落特征，見(jiàn)圖2。

圖1 3株病原真菌在不同果實(shí)上分離與回接時(shí)的病癥Fig.1 Symptoms of isolated fruits and reinululated fruits of three fungal pathogens

圖2 3株病原菌在PDA和ME培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)7 d和14 d的菌落特征Fig.2 Colony growth of three isolated strains cultured on ME and PDA plates for 7 d and 14 d at 25 ℃

由圖2的菌落形態(tài)表明，3株菌在PDA和ME上25 ℃培養(yǎng)條件下均生長(zhǎng)旺盛、外觀干燥、不透明、呈絨毛狀，菌絲滲透在培養(yǎng)基表面淺層，有色素產(chǎn)生。菌株138#的菌落質(zhì)地松散、呈棕色，PDA培養(yǎng)的菌絲更旺盛但顏色較淺；培養(yǎng)7 d后，在PDA培養(yǎng)的菌落直徑較大，而ME培養(yǎng)的菌落呈現(xiàn)明顯的圓形輪紋(圖2a、2d)；繼續(xù)培養(yǎng)至14 d時(shí)，菌落向培養(yǎng)基周圍的均勻伸展，后期菌落整體呈現(xiàn)灰綠色且有球狀物，以PDA上球狀物偏多(圖2g、2j)。類似的，菌株233#的菌落質(zhì)地松散，培養(yǎng)7d在ME上呈灰綠色，而在PDA上呈淺棕色(圖2b、2e)；繼續(xù)培養(yǎng)至14 d，菌落表面出現(xiàn)球狀突起，以PDA培養(yǎng)基上球狀物偏多且菌落由淺棕色變?yōu)榛野咨?，而ME板則由灰綠色變成黃綠色(圖2h、2j)。相比而言，培養(yǎng)7 d后，菌株366#在兩種培養(yǎng)基上的菌落均質(zhì)地緊密且菌絲較短、呈棕色，但ME上的菌落顏色較淺(圖2c、2f)；培養(yǎng)14 d后，兩種培養(yǎng)基上的菌絲顏色均加深(圖2i、2l)。

2.2.2顯微形態(tài)

使用顯微鏡觀察3株絲狀真菌138#、233#和366#的形態(tài)，見(jiàn)圖3。

圖3 3株病原菌的顯微形態(tài)Fig.3 Morphological characteristics of three fungal pathogens

由圖3可知，3株病原菌的顯微形態(tài)基本一致，菌絲呈細(xì)長(zhǎng)隔膜狀，菌絲分枝較多且內(nèi)部隔膜觀察清晰，成熟菌絲頂端長(zhǎng)有分生孢子，分生孢子梗緊密聚集成簇，上生葡萄狀分生孢子，卵圓形或球形，單孢。

2.3 基因組DNA PCR擴(kuò)增

圖4為3株病原菌ITS區(qū)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測(cè)的結(jié)果。由圖4可以看出DNA片段大小約600 bp，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果一致。

2.4 構(gòu)建ITS區(qū)rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹

將3株灰葡萄孢屬真菌的ITS區(qū)rDNA基因PCR擴(kuò)增片段的序列在NCBI上比對(duì)得到同源序列，利用MEGA6軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖5，3株病原真菌中，菌株138#鑒定為Botrytiscinerea(KJ937044.1)，親緣性達(dá)100%，而且與菌株366#在一個(gè)大分支上，親緣性達(dá)99%；而菌株233#鑒定為Botrytiselliptica(EU519207.1)，親緣性達(dá)100%。

圖4 3株病原真菌的ITS區(qū)rDNA電泳檢測(cè)圖譜Fig.4 Agarose gel electrophoresis results of ITS rDNA sequence of three strains

圖5 3株以ITS rDNA基因序列為分子標(biāo)記的灰葡萄孢菌菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Positions of three fungi strains based on ITS rDNA sequence in phylogenetic tree

2.5 碳源代謝指紋圖譜分析

將3株真菌138#、233#和366#在FF板上進(jìn)行碳源代謝測(cè)試，與對(duì)照菌種BotrytiscinereaPers.BGA對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可以看出，3株菌對(duì)95種碳源的適應(yīng)性很強(qiáng)，能利用的碳源均達(dá)75種以上，不同菌株之間的碳源代謝指紋圖譜存在一定差異。3株菌共有67種碳源利用程度相同，包括吐溫80、N-乙酰-D-葡萄糖胺、苦杏仁苷、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖醇、D-纖維二糖、α-環(huán)式糊精、β-環(huán)式糊精、糊精、D-果糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、龍膽二糖、α-D-葡萄糖、α-D-葡萄糖-1-磷酸、D-葡萄糖醛酸、丙三醇、肝糖、2-酮-D-葡糖酸、α-D-乳糖、乳果糖、麥芽糖醇、麥芽糖、麥芽三糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-松三糖、D-蜜二糖、β-甲基-D-半乳糖苷、β-甲基-D-葡萄糖苷、異麥芽酮糖、D-蜜三糖、L-鼠李糖、水楊苷、水蘇糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、D-木糖、γ-氨基丁酸、溴代丁二酸、反丁烯二酸、D-蘋果酸、奎寧酸、癸二酸、琥珀酸、琥珀酸單甲酯、L-丙胺酰胺、L-丙氨酰-甘氨酸、L-天門冬酰胺、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、L-鳥氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸和腺苷等56種最適碳源，N-乙酰-D-半乳糖胺、i-赤蘚糖醇、葡糖醛酰胺、m-肌醇、β-羥丁酸、γ-羥丁酸、D-乳酸甲酯、L-乳酸、N-乙酰-L谷氨酸和5′-磷酸腺苷等10種不可利用碳源，以及1種可利用碳源p-羥基苯乙酸。其中，與Biolog數(shù)據(jù)庫(kù)中BotrytiscinereaPers.BGA的代謝指紋圖譜最相近的是菌株233#，兩者僅對(duì)熊果苷的利用程度差異較大；其次是菌株138#，利用程度差異較大的碳源僅有D-葡萄糖胺和尿苷；而與菌株366#利用情況相同的碳源僅有51種。

聚類分析可將具有相似碳源代謝特征的菌進(jìn)行分類，從而有效反映不同菌株在代謝上的關(guān)系。對(duì)3株分離到的灰霉病菌，采用歐氏距離測(cè)量，2樣本間用Average Linkage法聯(lián)結(jié)，以95種碳源的利用情況作為聚類變量，進(jìn)行聚類分組，結(jié)果如圖6，通過(guò)系統(tǒng)聚類分析可將3株病原真菌直觀清楚的區(qū)分開來(lái)，其中菌株366#與138#首先聚為一類，其次是菌株233#，最后與數(shù)據(jù)庫(kù)中的B.cinereaPers. BGA聚類在一起。

表2 3株灰霉菌的碳源代謝指紋圖譜

++表示最適碳源，+表示可利用碳源，-表示不可利用碳源；對(duì)照菌株為BotrytiscinereaPers.BGA。

圖6 3 株灰葡萄孢屬真菌碳源代謝指紋圖譜的聚類分析Fig.6 Clustering drawing of three isolated Botrytis strains by gresemblance of metabolic fingerprinting

3 討 論

本研究的結(jié)果表明，草莓138#和櫻桃366#病原菌均鑒定為灰葡萄孢菌B.cinerea，據(jù)報(bào)道B.cinerea可引起藍(lán)莓和草莓灰霉病[1,5]，但未見(jiàn)引起櫻桃灰霉病的報(bào)道。類似地，本研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓233#為百合葡萄孢菌B.elliptica，引起藍(lán)莓灰霉病的有B.cinerea、B.byssoidea、B.aclada、B.squamosa和B.fabae等[15]，但由百合葡萄孢菌B.elliptica引起的藍(lán)莓病害未見(jiàn)報(bào)道。

此外，本研究對(duì)3株灰霉病菌ITS區(qū)序列的變異性分析發(fā)現(xiàn)，菌株138#和366#與B.cinerea在同一分枝，而菌株233#與B.elliptica在同一分枝上。碳源代謝指紋圖譜的結(jié)果也表明，菌株138#和366#在同一分枝上，再與菌株233#聚為一類，最后與Biolog系統(tǒng)中的模式菌株B.cinereaPers. BGA聚類。雖然分子系統(tǒng)進(jìn)化樹分類與碳源代謝聚類分析對(duì)3株灰霉病菌種間分類一致，但菌株233#對(duì)碳源的利用情況與B.cinereaPers. BGA碳源代謝最相近，即屬內(nèi)不同種間對(duì)碳源的代謝具有可比性，同一物種對(duì)碳源的利用存在差異性。這可能由于它們的碳源代謝除受自身遺傳限制外，還受菌體自身生長(zhǎng)狀況等環(huán)境條件影響。

對(duì)95種碳源的代謝指紋圖譜表明，3株葡萄孢屬病原菌可以利用的碳源都在75種以上，表明葡萄孢屬病原菌對(duì)不同碳源的適應(yīng)性較強(qiáng)，這可能是該屬病原菌侵染范圍廣、難以進(jìn)行有效生物防治的原因。因此，為研究拮抗酵母菌利用競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)與空間方式發(fā)揮生防效果來(lái)防治葡萄孢屬真菌導(dǎo)致的病害，還需進(jìn)一步深入挖掘?qū)μ荚创x指紋圖譜的特異性。

4 結(jié) 論

從采后貯藏期間自然發(fā)病的草莓、藍(lán)莓和櫻桃果實(shí)分離得到3株絲狀真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITS區(qū)rDNA序列分析，確定均為葡萄孢屬真菌(Botrytisspp.)。對(duì)比ITS區(qū)rDNA序列進(jìn)化樹和碳源代謝聚類分析，3株葡萄孢屬真菌分子鑒定和碳源代謝種間分類一致。對(duì)95種碳源代謝指紋圖譜分析表明，3株葡萄孢屬真菌均能利用75種以上碳源，其中菌株233#B.cinereaPers. BGA碳源代謝最相近。

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(責(zé)任編輯：李 寧)

AnalysisofrDNAITSandCarbonMetabolicFingerprintingofBotrytisNeesIsolatedfromThreeFruits

YAO Ting, CHEN Qiwei, ZHANG Yan, ZHANG Meng, HE Xinmeng, WANG Yousheng*

(BeijingAdvancedInnovationCenterforFoodNutritionandHumanHealth/BeijingLaboratoryforFoodQualityandSafety,BeijingTechnologyandBusinessUniversity,Beijing100048,China)

Three strains 138#，233#and 366#were isolated from infected strawberry, blueberry and cherry fruit. All the fungal pathogens were identified asBotrytisNees by morphological characterization and rDNA ITS analysis. The results obtained by the analysis of both morphological characterization and rDNA ITS sequence showed that strains 138#and 366#belonged to the same species and were closely related toB.cinerea(KJ937044.1). In contrast, strain 233#had a close phylogenetic relationship withB.elliptica(EU519207.1). The biolog microbial identification system with FF microplate was applied for 95 different carbon and nitrogen sources utilization tests of three pathogens, and the result of the carbon metabolic fingerprinting showed that three strains had 67 carbon sources in common, including fifty-six optimal carbon sources, one available carbon source and ten unavailable carbon sources. In addition, metabolic profiling revealed that three fungi were all closely related toB.cinereaPers. BGA and 233#was the nearest toB.cinereaPers. BGA.

fruit；BotrytisNees； rDNA ITS sequence analysis； carbon metabolic fingerprinting

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.04.007

2095-6002(2017)04-0049-07

姚婷， 陳其葳， 張燕， 等. 3株果實(shí)采后葡萄孢屬真菌ITS區(qū)rDNA序列與碳源代謝指紋圖譜分析[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2017,35(4):49-55. YAO Ting, CHEN Qiwei, ZHANG Yan, et al. Analysis of rDNA ITS and carbon metabolic fingerprinting of fourBotrytisNees isolated from three fruits[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(4):49-55.

2017-04-21

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD16B06)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31471626)。

姚 婷，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)；

TS255.36; Q93-331

： A

*王友升，男，教授，主要從事果蔬綠色保鮮及其高值化方面的研究，通信作者。