脂肪酶在催化酯交換過程中的穩(wěn)定性

李成,王勝杰,季敏,黃清吉,黃仕群,翁新楚

(1.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,上海200444;2.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海200444; 3.大馬棕櫚油技術(shù)研發(fā)(上海)有限公司,上海201108)

脂肪酶在催化酯交換過程中的穩(wěn)定性

李成1,王勝杰2,季敏3,黃清吉3,黃仕群3,翁新楚2

(1.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,上海200444;2.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海200444; 3.大馬棕櫚油技術(shù)研發(fā)(上海)有限公司,上海201108)

脂肪酶是一種能夠在非水相體系中催化酯交換的生物酶.在實(shí)際應(yīng)用過程中,脂肪酶的穩(wěn)定性非常重要,因?yàn)檫@會(huì)直接影響工業(yè)化的成本和效率.針對溫度、時(shí)間、溶劑和?；w對脂肪酶催化酯交換反應(yīng)穩(wěn)定性的影響進(jìn)行了系統(tǒng)的研究.結(jié)果表明,溫度和溶劑極性對脂肪酶催化穩(wěn)定性的影響比較顯著,而時(shí)間和酰基供體的影響不明顯.

脂肪酶;酯交換;穩(wěn)定性

脂肪酶(lipase,E.C.3.1.1.3)是一種既能在水相中水解長鏈酯類化合物,又能在非水相中催化酯類合成反應(yīng)或者酯交換反應(yīng)的酶類[1].它是一種重要的工業(yè)酶類,常用于油脂水解、食品風(fēng)味和香味的改進(jìn)、醫(yī)療醫(yī)藥、皮革絹紡脫脂、低等油脂的改性,以及添加于洗滌劑和化妝品中等[2-3].特別是在油脂化工和有機(jī)合成工業(yè)中,酶催化的反應(yīng)具有條件溫和、耗能低、原料要求低、成品質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn),尤其是1,3-專一脂肪酶可用于特殊脂肪酸、單甘酯的合成及立體選擇性化學(xué)合成和拆分,具有巨大的應(yīng)用潛力[4-6].

在酶法制備類可可脂的研究中,脂肪酶一直是各國科研工作者研究的熱點(diǎn)[7-10].本工作主要研究了脂肪酶在催化酯交換反應(yīng)制備類可可脂過程中的穩(wěn)定性,系統(tǒng)地分析了溫度、時(shí)間、溶劑、?；w等對脂肪酶穩(wěn)定性的影響.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與試劑

棕櫚油中間分提物、硬脂酸,由大馬棕櫚油技術(shù)研發(fā)(上海)有限公司贈(zèng)送.脂肪酶LipozymeTLIM,購自諾維信(中國)有限公司.正己烷、丙酮、乙醚等均為分析純,購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

TECHCOMP7890F氣相色譜儀(上海天美科學(xué)儀器公司),BSA224S-CW電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司),DK-S12電熱恒溫水浴鍋(上海華連醫(yī)療器械有限公司), RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠),MYP11-2恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀表制造有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 脂肪酶酯交換活力

在一定條件下每分鐘交換1μmol硬脂酸需要的酶量定義為1個(gè)脂肪酶活力單位(U).

稱取4.0 g橄欖油和4.0 g硬脂酸于100mL三頸燒瓶中.加入10.0mL正己烷,置于恒溫磁力攪拌器上,溫度為55?C,轉(zhuǎn)速為300 r/min.待溫度穩(wěn)定后加入1.0 g脂肪酶,并開始計(jì)時(shí).5 min后趁熱過濾去除脂肪酶以終止反應(yīng).分離提純甘油三酯,利用氣相色譜檢測酯交換進(jìn)入橄欖油中的硬脂酸含量.

脂肪酶酯交換活力計(jì)算公式為

式中:X為脂肪酶酯交換活力,U/g;M為橄欖油脂肪酸摩爾量,μmol;ΔST為酯交換的硬脂酸占總脂肪酸的比例,%;m為脂肪酶的質(zhì)量,g;T為反應(yīng)時(shí)間,min.

1.3.2 溫度對脂肪酶穩(wěn)定性的影響

稱取4.0 g棕櫚油中間分提物和4.0 g硬脂酸于100 mL三頸燒瓶中.加入10.0 mL正己烷和1.0 g脂肪酶,分別在45,50,55,60,65和70?C下連續(xù)反應(yīng)60 h后,過濾出酶.用正己烷沖洗干凈,檢測脂肪酶酯交換活力.

1.3.3 時(shí)間對脂肪酶穩(wěn)定性的影響

稱取4.0 g棕櫚油中間分提物和4.0 g硬脂酸于100 mL三頸燒瓶中.加入10.0 mL正己烷和1.0 g脂肪酶,在55?C下分別反應(yīng)4,8,12,24,36,48和60 h后,過濾出酶.用正己烷沖洗干凈,檢測脂肪酶酯交換活力.

1.3.4 溶劑對脂肪酶穩(wěn)定性的影響

稱取4.0 g棕櫚油中間分提物和4.0 g硬脂酸于100 mL三頸燒瓶中.加入1.0 g脂肪酶,分別加入10.0 mL正己烷、石油醚、甲苯和丙酮,在55?C條件下反應(yīng)60 h后,過濾出酶.用正己烷沖洗干凈,檢測脂肪酶酯交換活力.

1.3.5 ?；w對脂肪酶穩(wěn)定性的影響

稱取4.0 g棕櫚油中間分提物.分別稱取4.0 g?；w(硬脂酸、硬脂酸甲酯)于100mL三頸燒瓶中.加入1.0 g脂肪酶,10.0mL正己烷在55?C條件下反應(yīng)60 h后,過濾出酶.用正己烷沖洗干凈,檢測脂肪酶酯交換活力.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 溫度對脂肪酶穩(wěn)定性的影響

圖1表示脂肪酶在不同反應(yīng)溫度下,連續(xù)催化棕櫚油中間分提物與硬脂酯交換反應(yīng)60 h后,相對酯交換活力的變化情況.可以看出,當(dāng)反應(yīng)溫度不高于55?C時(shí),脂肪酶在連續(xù)催化60 h后相對酯交換活力變化不是很明顯,說明酶活力的損失很小,相對酯交換活力達(dá)到97.3%.但是當(dāng)反應(yīng)溫度高于55?C時(shí),脂肪酶的相對酯交換活力就出現(xiàn)明顯的下降趨勢.當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到70?C時(shí),60 h后脂肪酶的相對酯交換活力只有67.9%,說明脂肪酶的酯交換活力已經(jīng)出現(xiàn)較大程度的下降.可見,溫度對脂肪酶催化酯交換反應(yīng)的穩(wěn)定性具有較大影響.在實(shí)際應(yīng)用中,應(yīng)該盡量使用較低的反應(yīng)溫度,這樣既可以避免脂肪酶的失活,也可以降低能耗,節(jié)約成本.

圖1 脂肪酶在不同反應(yīng)溫度下連續(xù)催化酯交換反應(yīng)60 h后的相對酯交換活力Fig.1 Relative interesterification activities of lipase at diff erent reaction temperatures for 60 h after catalytic interesterifi cation reactions

2.2 反應(yīng)時(shí)間對脂肪酶穩(wěn)定性的影響

脂肪酶催化酯交換穩(wěn)定性最重要的指標(biāo)就是能夠在一定反應(yīng)溫度條件下,經(jīng)過長時(shí)間的連續(xù)酯交換反應(yīng)而酯交換活力損失較小,這對實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用具有極其重要的意義.本工作通過分析在不同反應(yīng)溫度下反應(yīng)時(shí)間對脂肪酶酯交換活力的影響來判斷脂肪酶的穩(wěn)定性.由圖2可以看出,脂肪酶在相對較低的溫度條件下,催化酯交換反應(yīng)的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于較高的反應(yīng)溫度條件,脂肪酶在低于60?C的酯交換反應(yīng)溫度下的穩(wěn)定性顯著優(yōu)于60?C以上.在55?C反應(yīng)溫度下經(jīng)過連續(xù)反應(yīng)60 h后,相對活力僅下降2.7%,而在70?C反應(yīng)溫度下,相對活力下降的速率明顯加快,達(dá)到了32.1%.反應(yīng)時(shí)間對脂肪酶有一定的影響,當(dāng)催化體系的溫度保持相對較低的時(shí)候,脂肪酶的酯交換活力損失較少.隨著催化體系溫度的升高,脂肪酶的酯交換活力損失開始快速減少.因此,在實(shí)際生產(chǎn)中要控制好整個(gè)反應(yīng)體系的溫度,以防溫度過高使脂肪酶失活.

2.3 溶劑對脂肪酶穩(wěn)定性的影響

本工作選取常用的幾種不同極性的有機(jī)溶劑作為脂肪酶催化酯交換反應(yīng)的有機(jī)相溶劑.從圖3可以看出,溶劑極性越小,脂肪酶的穩(wěn)定性就越高.在弱極性溶劑正己烷和石油醚反應(yīng)體系中,脂肪酶連續(xù)催化酯交換反應(yīng)60 h后的相對活力依然保持在97%以上,說明脂肪酶在弱極性溶劑中的穩(wěn)定更高.這可能是由于在弱極性溶劑中,脂肪酶的三維結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定,不易出現(xiàn)失活.在極性溶劑丙酮中脂肪酶的相對酯交換活力下降速率明顯高于弱極性溶劑,經(jīng)過0 h連續(xù)反應(yīng)后的相對酯交換活力降至56.9%.這可能是由于極性溶劑中的質(zhì)子會(huì)影響脂肪酶酶活中心的氫鍵,從而導(dǎo)致脂肪酶的酯交換活力下降.

圖2 脂肪酶在不同反應(yīng)溫度下連續(xù)催化酯交換反應(yīng)的相對酯交換活力隨時(shí)間的變化Fig.2 Changes of the relative interesterification activities of lipase at diff erent reaction temperatureswith diff erent time in the caltalytic interesterification reactions

圖3 脂肪酶在4種不同溶劑系統(tǒng)中反應(yīng)溫度為55?C下連續(xù)催化60 h后的相對酯交換活力Fig.3 Relative interesterification activities of lipase in 4 diff erent solvent systems after catalytic 60 h of continuous catalytic reaction under 55?C

2.4 酰基供體對脂肪酶穩(wěn)定性的影響

本工作比較了硬脂酸和硬脂酸甲酯兩種?；w對脂肪酶催化酯交換反應(yīng)過程中的穩(wěn)定性的影響,結(jié)果如圖4所示.分析發(fā)現(xiàn),?；w對脂肪酶催化穩(wěn)定性的影響不明顯.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),雖然兩種不同?；w對脂肪酶催化穩(wěn)定性沒有明顯影響,但是?；w硬脂酸甲酯的酯交換反應(yīng)速率明顯高于硬脂酸.在實(shí)際應(yīng)用中可以根據(jù)不同的需求選擇合適的?；w.

3 結(jié)束語

脂肪酶是催化酯交換反應(yīng)中最重要的酶,因其具有立體專一性已被廣泛應(yīng)用于食品、化工等領(lǐng)域.在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中如何保持脂肪酶的穩(wěn)定性是脂肪酶工程研究的重點(diǎn).本工作針對溫度、時(shí)間、溶劑和?；w對脂肪酶催化酯交換反應(yīng)過程中穩(wěn)定性影響的研究,希望可以為脂肪酶的實(shí)際應(yīng)用提供參考.研究發(fā)現(xiàn),溫度和溶劑的極性對脂肪酶催化酯交換反應(yīng)的穩(wěn)定性影響最為顯著,其在相對低溫和弱極性溶劑中的穩(wěn)定性最優(yōu),而高溫和極性溶劑對其穩(wěn)定性影響顯著.因此,在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用過程中,應(yīng)該盡量避免使用極性溶劑作為反應(yīng)溶劑.?；w對脂肪酶催化穩(wěn)定性的影響不明顯,但是不同的?；w對脂肪酶的酯交換反應(yīng)速率有較大影響,以硬脂酸甲酯作為?；w的催化速率明顯高于以硬脂酸作為?；w.

圖4 脂肪酶在不同酰基供體下連續(xù)催化酯交換反應(yīng)60 h后的相對酯交換活力Fig.4 Relative interesterifi cation activities of lipase after 60 h of continuous catalytic reaction in diff erent acyl donors

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Stab ility o f lipase in the process o f cataly tic in teresterifi cation reaction

LICheng1,WANG Shengjie2,JIMin3,OOIChengkeat3,WONG Sookhan3, WENG Xinchu2
(1.School of Environmental and Chemical Engineering,Shanghai University,Shanghai 200444,China; 2.School of Life Sciences,Shanghai University,Shanghai 200444,China; 3.PalmO il Research and Technical Service Institu te of MPOB,Shanghai 201108,China)

Lipase is a kind of enzyme that can catalyze interesterifi cation in a non-aqueous system.Stability of lipase is important in practical applications because of its eff ection of the production cost and effi ciency.To understand the influence of diff erent factors on catalytic stability of lipase,the eff ects of temperature,time,solvents and acyl donor on stability of lipase interesterifi cation are studied.The resu lts show that the eff ects of temperature and solvent polarity on catalytic stability of lipase are significant.But the eff ects of time and acy l donor are not obvious.

lipase;interesterification;stability

TS 201

A

1007-2861(2017)04-0623-05

DO I:10.12066/j.issn.1007-2861.1692

2015-09-08

翁新楚(1962—),男,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)橛椭瘜W(xué).E-mail:wxch@staff.shu.edu.cn