響應(yīng)面法優(yōu)化菲律賓蛤仔黏附污泥多糖的提取工藝

周海軍，穆 軍，邢 宇

（浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

響應(yīng)面法優(yōu)化菲律賓蛤仔黏附污泥多糖的提取工藝

周海軍，穆 軍，邢 宇

（浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

菲律賓蛤仔黏附污泥（RPM）具備優(yōu)異生物絮凝、脫色、沉淀性能，推測是由黏附污泥中的活性微生物產(chǎn)生的多糖類大分子為主引起的。本文通過響應(yīng)面法研究了菲律賓蛤仔黏附污泥多糖（RPMP）的最佳提取工藝。首先通過單因素實(shí)驗(yàn)考察了提取溫度、提取時(shí)間、水料比、提取次數(shù)對RPMP提取產(chǎn)率的影響，確定了單獨(dú)適宜的提取溫度、提取時(shí)間、水料比和提取次數(shù)。進(jìn)而通過響應(yīng)面法選取提取溫度、提取時(shí)間、水料比作為變量，多糖產(chǎn)率為響應(yīng)值進(jìn)行各項(xiàng)提取參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到RPMP的最佳提取工藝：提取溫度為92℃，提取時(shí)間為4 h，水料比為20 mL/g，提取2次。在最佳提取參數(shù)下實(shí)際提取率是0.121%±0.002%（n=3），與模型預(yù)測的提取率0.122%較接近。因此，用響應(yīng)面法對菲律賓蛤仔黏附污泥的多糖（RPMP）提取條件的優(yōu)化方案是合理可行的。本研究為進(jìn)一步闡明RPM的絮凝分子機(jī)理以及精制活性成分奠定了基礎(chǔ)。

菲律賓蛤仔黏附污泥；多糖提??；響應(yīng)面優(yōu)化

絮凝劑在給水處理、污水凈化、食品和發(fā)酵工程等領(lǐng)域有著極為廣泛而關(guān)鍵的應(yīng)用[1-2]。微生物絮凝劑是由微生物產(chǎn)生的具有絮凝活性的天然高分子化合物，無毒無害且易降解，因此備受人們關(guān)注[3-4]。對微生物絮凝劑的化學(xué)組成進(jìn)行分析可知絕大多數(shù)都是以多糖為主要成分的胞外聚合物[5-7]。

菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum是一種重要的貝殼類海產(chǎn)品，目前全世界每年的養(yǎng)殖產(chǎn)量約為400×104t[8]。菲律賓蛤仔黏附污泥（RPM），特指新鮮貝類在除沙過程中貝類吐出的絮團(tuán)狀的泥沙沉淀物，濕重產(chǎn)量約為貝類重量的十分之一。前期研究表明，RPM雖然來自于貝類，卻表現(xiàn)出極佳的微生物絮凝劑特征，具備絮凝、脫色、重金屬去除等典型微生物絮凝劑活性；由RPM分離到大量的微生物絮凝劑產(chǎn)生菌，部分菌株對高嶺土的絮凝效果明顯，對多種模擬染料廢水的染料脫色率達(dá)到95%以上[9-10]，加大了RPM作為一種天然生物絮凝劑，實(shí)質(zhì)上是由其中的活性微生物產(chǎn)生的微生物絮凝劑的推測。

本研究試圖從菲律賓蛤仔黏附污泥中提取具有絮凝活性的多糖類大分子物質(zhì)（RPMP），采用目前較流行的響應(yīng)面法優(yōu)化出最佳提取工藝，從而為闡明RPM的絮凝分子機(jī)理以及精制活性成分奠定基礎(chǔ)。迄今為止，這是首次對菲律賓蛤仔黏附污泥中絮凝活性組分的優(yōu)化分離。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

本研究中菲律賓蛤仔采集于浙江省舟山市普陀區(qū)朱家尖一處海水養(yǎng)殖場。無水乙醇、濃硫酸、苯酚和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000型，上海亞榮生化儀器廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9023A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HWS24型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（Multifuge 1R型，塞默飛世爾科技有限公司）；循環(huán)水式真空泵（SHB-Ⅲ型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；渦旋振蕩器（VG3S025型，IKA）；電子天平（LE204E型，上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；便攜式可見分光光度計(jì)（DR1900型，上海世祿儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 黏附污泥的預(yù)處理

從養(yǎng)殖場采集5 kg鮮活的菲律賓蛤仔置于潔凈的敞口塑料容器內(nèi)，加入5 L經(jīng)自然沉淀的天然海水暫養(yǎng)過夜。18～24 h后撈出蛤仔，余液靜置10 min，棄掉容器上層海水，將底部蛤仔黏附污泥（RPM）收集置于燒杯中備用。取出適量濕泥在烘箱中50℃烘干至恒重，得到的干泥用于工藝流程的探究。

1.3.2 提取工藝

工藝流程：干泥→熱水提取→離心→上清液→濃縮→醇沉→離心→沉淀物烘干→粗多糖。

具體操作是：稱取干泥粉末適量，依據(jù)各設(shè)定的提取條件加入一定體積的蒸餾水，于熱水浴中進(jìn)行多糖提取。提取液于10 000 r/min、4℃條件下離心10 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/10，濃縮液加入無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為75%，充分振蕩，4℃冰箱中靜置過夜，8 000 r/min、4℃條件下離心20 min，保留沉淀物。將沉淀物置于50℃烘箱中烘干，即為菲律賓蛤仔黏附污泥多糖粗提物（RPMP）。

1.3.3 多糖提取率的測定

采用苯酚-硫酸法[11-12]對水提溶液中的多糖含量進(jìn)行測量。制得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線是A=0.010 9 C+0.032 1，R2=0.998 7，其中C為總糖濃度（mg/L），A為490 nm處的吸光度。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

單因素試驗(yàn)中所用的干泥的質(zhì)量為1 g，分別以提取溫度、提取時(shí)間、水料比為單變量考察因素，以多糖提取率為目標(biāo)，在不同條件下進(jìn)行多糖提取實(shí)驗(yàn)。

（1）時(shí)間對提取的影響

各取1 g干泥，液固比 20：1，在溫度為 90℃的恒溫水浴中分別浸提 1、2、3、4、5 h，各提取 1次，分別計(jì)算多糖得率。

（2）溫度對提取的影響

各取 1 g干泥，液固比 20：1，溫度為 60、70、80、90、100 ℃的熱水中分別浸提 3 h，各提取 1 次，分別計(jì)算多糖得率。

（3）料液比對提取的影響

各取 1 g 干泥，按液固比 10：1、15：1、20：1、25：1、30：1，分別在 90 ℃的恒溫水浴中浸提 3 h，各提取 1次，分別計(jì)算多糖得率。

（4）提取次數(shù)對提取的影響

各取1 g干泥，在液固比30：1，溫度為90℃的恒溫水浴中分別浸提1、2、3、4次，每次浸提3 h，分別計(jì)算多糖得率。

1.3.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以干泥多糖得率為指標(biāo)，以提取溫度（X1），提取時(shí)間（X2），提取料液比（X3）為實(shí)驗(yàn)變量，通過響應(yīng)面分析法，采取Box-Behnkn三因素三水平模型優(yōu)化多糖的提取工藝參數(shù)。為便于統(tǒng)計(jì)計(jì)算，將實(shí)驗(yàn)變量設(shè)為-1、0、+1三個(gè)水平，各因素的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平及編碼見表1。

表1 BBD中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平編碼Tab.1 Level and code for experimental variable of BBD design

其中xi是自變量的編碼值，X0是自變量在中心點(diǎn)的實(shí)際值，△Xi是步長差值。計(jì)算值如下：

Box-Behnkn中心設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案見表2，中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括12個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)和5個(gè)重復(fù)的中心點(diǎn)。依據(jù)表2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將實(shí)際得到的多糖產(chǎn)率值填入對應(yīng)的結(jié)果中。

單因素實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS進(jìn)行顯著性分析。Box-Behnken設(shè)計(jì)采用Design Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及二次回歸模型的建立，顯著性由F-檢驗(yàn)來確定。P<0.05用來表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是否顯著。響應(yīng)面的回歸結(jié)果可用回歸二次方程來表示，該數(shù)學(xué)模型公式包括一次項(xiàng)，二次項(xiàng)，相互交叉影響項(xiàng)。

其中Y是響應(yīng)值，β0、βi、βii、βij分別是回歸方程的截距，一次項(xiàng)系數(shù)，二次項(xiàng)系數(shù)，交互項(xiàng)系數(shù)。Xi和Xj是獨(dú)立的互不相關(guān)的變量（i≠j）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對黏附污泥多糖產(chǎn)率的影響

如圖1A所示，固定提取的溫度為90℃，料液比為20 mg/L，提取時(shí)間為3 h，提取次數(shù)為1次，分別加熱 1、2、3、4、5 h。結(jié)果顯示多糖產(chǎn)率從 1 h 到 4 h 呈逐漸上升趨勢（P＜0．05），然而隨著加熱的時(shí)間延長至5 h后，多糖產(chǎn)率呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于多糖浸提過程伴隨著提取時(shí)間延長，溶解在水中的部分溶解的多糖被降解，當(dāng)多糖降解的速率大于多糖溶出的速率時(shí)，產(chǎn)率就會(huì)出現(xiàn)下降現(xiàn)象。這種加熱時(shí)間對多糖產(chǎn)率影響的關(guān)系以前也曾報(bào)道過[13]，因此將最佳提取的時(shí)間初步選在4 h。

2．1．2 提取溫度對黏附污泥多糖產(chǎn)率的影響

如圖1B所示，固定料液比為20 mg/L，提取時(shí)間為3 h，提取次數(shù)為1次時(shí)，提取溫度分別為60、70、80、90、100℃。結(jié)果顯示，提取溫度從60℃到90℃時(shí)對多糖產(chǎn)率有明顯影響（P＜0．05）。從90℃到100℃時(shí)，多糖產(chǎn)率略有下降。這可能是隨著提取溫度升高，水溶液的熱分子運(yùn)動(dòng)加快，導(dǎo)致黏附在污泥上的多糖溶解出來速度加快。當(dāng)溫度繼續(xù)增加時(shí)，部分多糖的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定使溶解在水中的多糖的產(chǎn)率下降。因此將90℃作為優(yōu)化設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。一般來說，多糖提取溫度都是在85～95℃范圍內(nèi)較為普遍[14]。

2．1．3 水料比對黏附污泥多糖產(chǎn)率的影響

如圖1C所示，固定溫度為90℃，提取時(shí)間為3 h，提取次數(shù)為1次時(shí)，水料比分別為10:1、15:1、20:1、25:1、30:1。結(jié)果顯示，水料比從10:1上升至20:1，水料比對多糖產(chǎn)率的影響差異達(dá)到顯著水平（P＜0．05）。而從20:1到30:1，水料比對多糖產(chǎn)率的影響不那么顯著（P＞0．05）。這可能是由于隨著水料比的增大，多糖分子的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散能力一直提高，從而會(huì)使多糖產(chǎn)提取率不斷提高，但當(dāng)糖分子的濃度在水中達(dá)到溶解平衡時(shí)，繼續(xù)溶出的可能性小[15]?？紤]到之后濃縮步驟的難易，所以選擇20:1作為水料比的中心點(diǎn)。

2．1．4 提取次數(shù)對黏附污泥多糖產(chǎn)率的影響

如圖1D所示，固定溫度為90℃，提取時(shí)間為3 h，水料比為20:1時(shí)，提取次數(shù)分別為1、2、3、4次。研究結(jié)果表明，提取次數(shù)從1次到2次時(shí)多糖提取率有極顯著影響（P＜0．05）。隨著提取次數(shù)增大，多糖產(chǎn)率呈上升趨勢。但當(dāng)提取次數(shù)增大到3、4次時(shí)變化趨于平緩（P＞0．05）。結(jié)合提取成本和綜合原料利用率來看，提取實(shí)驗(yàn)用2次較為合適。

圖1 提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、水料比（C）、提取次數(shù)（D）對提取率的影響Fig．1 Extraction time(A),extraction temperature(B),water to solid ratio(C),and number of extraction times(D)on the yield of RPMP．Data are shown as the mean±SD(n=3)

2．2 多因素響應(yīng)面分析

BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組合的多糖產(chǎn)率見表2，多糖產(chǎn)率響應(yīng)面二次模型方差分析結(jié)果見表3。從得到的數(shù)據(jù)來看，BBD中心組合實(shí)驗(yàn)得到的回歸模型值F值為43．29，只有0．01%能引起模型F值噪聲，屬于非常顯著的水平（P＜0．001），表明該模型是顯著的。失擬F值2．65意味該模型相對于實(shí)驗(yàn)絕對誤差無顯著差異（P＞0．05）。此模型的預(yù)計(jì)回歸決定系數(shù)0．982 38和實(shí)驗(yàn)校正系數(shù)0．959 7基本一致，表明僅有小于5%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差。

通過Design expert 8．0．6軟件得到的多糖提取模擬回歸方程是：

從 X1，X2，X3的 P 值來看，X2＜X1＜X3，提取時(shí)間、提取溫度、水料比這三個(gè)因素對實(shí)驗(yàn)的顯著性影響大小為提取溫度＞提取時(shí)間＞水料比。只有當(dāng)“Pro＞F”的值小于0．05時(shí)，該項(xiàng)指標(biāo)才算是顯著性水平[15]。

表2 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組合及蛤仔黏附污泥多糖提取結(jié)果Tab．2 BBD matrix and response values of extraction yield for polysaccharide from RPM

表3 多糖產(chǎn)率響應(yīng)面二次模型方差分析Tab．3 Variance of response surface quadratic model for RPMP yield

2．3 主要因素交互影響分析

響應(yīng)曲面圖和等高線圖是從外觀圖象上對統(tǒng)計(jì)軟件建立的二次回歸方程的直觀描述。圖形能反映所選取的自變量的交互作用對實(shí)驗(yàn)變量的影響是否顯著，對變量條件是否符合實(shí)驗(yàn)的需要做個(gè)評(píng)判。等高線若呈橢圓形，對應(yīng)的變量交互作用顯著，等高線若呈圓形，對應(yīng)的變量交互效應(yīng)不顯著[14]。

圖2 提取時(shí)間（X1）、提取溫度（X2）和水料比（X3）對泥多糖提取的響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface plot depicting the effect of the extraction time(X1),extraction temperature(X2),water to solid ratio(X3)on the polysaccharide extraction yield from RPM

2.3.1 提取溫度（X2）和提取時(shí)間（X1）

從圖2A可以看出，當(dāng)固定水料比在零點(diǎn)水平，開始時(shí)隨著提取溫度（X2）和提取時(shí)間（X1）的不斷增加，多糖提取率相應(yīng)值也在增大，當(dāng)過了頂點(diǎn)峰值后，隨著提取溫度和提取時(shí)間的進(jìn)一步增大，多糖的提取率在下降。從等高線圖上的圓形可以看出，提取溫度和提取時(shí)間的交互作用對多糖提取率的影響不顯著。

2.3.2 提取時(shí)間（X1）和水料比（X3）

從圖2B可以看出，當(dāng)固定提取溫度比在零點(diǎn)水平，開始時(shí)隨著提取時(shí)間和水料比的不斷增加，多糖提取率相應(yīng)值也在增大，從等高線圖上的圓形可以看出，水料比和提取時(shí)間的交互作用對多糖提取率的影響顯著。這和回歸方程X1X3的系數(shù)有顯著性影響是一致的。

2.3.3 提取溫度（X2）和水料比（X3）

從圖2 C可以看出，當(dāng)固定提取時(shí)間比在零點(diǎn)水平，開始時(shí)提取溫度和水料比的不斷增加，多糖提取率相應(yīng)值也在增大，當(dāng)過了頂點(diǎn)峰值后，隨著提取溫度和水料比進(jìn)一步增大，多糖的提取率在下降。從等高線圖上的圓形可以看出，提取溫度和提取時(shí)間的交互作用對多糖提取率的影響不顯著。

2.4 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

通過RSM模型以及Design expert 8.0.6數(shù)據(jù)處理分析，得到菲律賓蛤仔黏附污泥多糖提取最佳工藝條件提取溫度為91.59℃，提取時(shí)間為4.07 h，水料比為20.07 mL/g，提取次數(shù)為2次。為方便操作，各個(gè)工藝參數(shù)實(shí)際提取溫度為92℃、提取時(shí)間為4 h、水料比為20 mL/g、提取次數(shù)為2次。提取實(shí)驗(yàn)平行3次，得到多糖實(shí)際產(chǎn)率為0.121±0.002%（n=3），和預(yù)測值0.122%較接近（表4），表明RSM模型建立的實(shí)驗(yàn)方案是合理的。

表4 最佳條件下的泥多糖提取率實(shí)際值和預(yù)測值Tab.4 Experimental and predicted yields of RPMP under optimal conditions

3 結(jié)論

本文通過響應(yīng)面法首次研究了菲律賓蛤仔黏附污泥多糖的最佳提取工藝。首先通過單因素實(shí)驗(yàn)考察了提取溫度、提取時(shí)間、水料比、提取次數(shù)對菲律賓蛤仔黏附污泥多糖提取產(chǎn)率的影響，進(jìn)而通過響應(yīng)面法選取提取溫度、提取時(shí)間、水料比作為變量，多糖產(chǎn)率為響應(yīng)值進(jìn)行各項(xiàng)提取參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計(jì)。由多因素交互作用分析得出，水料比和提取時(shí)間的交互作用對多糖提取率的影響顯著（P<0.05），提取溫度和提取時(shí)間的交互作用以及提取溫度和水料比的交互作用對多糖提取率的影響不顯著（P<0.05）。最終通過回歸方程的優(yōu)化處理得到多糖的最佳提取工藝條件為：提取溫度為92℃，提取時(shí)間為4.0 h，水料比為20 mL/g，提取次數(shù)為2次。在最佳條件參數(shù)下預(yù)測提取率是0.122%，實(shí)際提取率是0.121±0.002%，二者較為一致，表明該實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方案是合理可行的。

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Response Surface Methodology Used for Extraction Process Optimization of Polysaccharides from Ruditapes philippinarum Conglutination Mud

ZHOU Hai-jun,MU Jun,XING Yu
（School of Marine Science&Technology of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China）

Ruditapes philippinarum conglutination mud(RPM)showed good activities of flocculation,decolorization and settling,which is speculated contributing to polysaccharides produced by bioflocculant-producing microbes inside the mud.In this research,response surface methodology(RSM)was employed to optimize the extraction conditions of R.philippinarum conglutination mud polysaccharides(RPMP)based on Box-Behnken design.Firstly single factor experiment,including extraction time,extraction temperature,ratio of water to solid,and number of extraction times,was performed to obtain each suitable extraction condition.Afterwards,extraction time,extraction temperature and ratio of water to solid were selected for RPMP extraction optimization based on Box-Behnken design.Results indicated that the best extraction parameters were:extraction time 4 h,extraction temperature 92℃,ratio of water to solid 20 mL/g and twice extraction.Under the optimized extraction conditions,the observed extraction yield of RPMP 0.121%±0.002%(n=3)was in close agreement with the predicted yield 0.122%,which revealed that the RSM model was suitable for the optimization of the extraction process.This study laid a foundation for further elucidation of the molecular mechanism of RPMand the purification of its active components.

Ruditapes philippinarum conglutination mud;polysaccharide extraction;response surface methodology optimization

X703

A

1008－830X(2017)02－0115－07

2017-02-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21109004314）；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201510340008）；舟山科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014C41018）

周海軍（1989-），男，湖北蘄春人，研究方向：海洋環(huán)境污染防治.

穆軍，教授.E-mail:2240254374@qq.com