砂粒粒徑對日本囊對蝦非特異性免疫和抗氧化酶活性的影響

王庚申，謝建軍，何 杰，施 慧，汪 瑋，許文軍

（1．浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316021；2．浙江海洋大學水產(chǎn)學院，浙江舟山 316022）

砂粒粒徑對日本囊對蝦非特異性免疫和抗氧化酶活性的影響

王庚申1，謝建軍1，何 杰1，施 慧1，汪 瑋1，許文軍2

（1．浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316021；2．浙江海洋大學水產(chǎn)學院，浙江舟山 316022）

為了探究砂粒底質(zhì)對日本囊對蝦免疫水平的影響，實驗對不同砂粒粒徑處理組日本囊對蝦的非特異性免疫及抗氧化酶活性差異進行了比較分析。結(jié)果表明，3個砂粒底質(zhì)組日本囊對蝦的ACP、AKP和LSZ酶活性均高于無底質(zhì)組，并且酶活性隨著砂粒粒徑的增大而降低。幾種抗氧化酶活性也有類似結(jié)果，砂粒底質(zhì)組日本囊對蝦SOD、CAT及T－AOC酶活性也隨著砂粒粒徑的增大而降低，而MDA酶活性隨著砂粒粒徑的增大而升高，說明在粗砂底質(zhì)中日本囊對蝦體內(nèi)細胞受損程度更高。通過對各砂粒底質(zhì)組日本囊對蝦免疫水平的差異比較發(fā)現(xiàn)，粒徑＜0．5mm的細砂更適合在日本囊對蝦工廠化和高位池精養(yǎng)模式中應用。

日本囊對蝦；砂粒粒徑；非特異性免疫；抗氧化酶

日本囊對蝦Marsupenaeus japonicus俗稱花蝦、竹節(jié)蝦、車蝦等，具有生長快、耐低溫、耐干露能力強等優(yōu)點，養(yǎng)殖潛力巨大，是我國重要的蝦類養(yǎng)殖品種之一[1]。其營養(yǎng)豐富，味道鮮美，市場價格高，且具生長快、耐低溫、耐干露能力強等特點，深受消費者和養(yǎng)殖業(yè)者的喜愛。我國20世紀80年代開展全人工養(yǎng)殖以來，沿海各省市均有養(yǎng)殖，并形成一定的規(guī)模[2]。經(jīng)過多年的養(yǎng)殖實踐和摸索，日本囊對蝦養(yǎng)殖技術(shù)不斷完善，池底覆砂的工廠化和高位池精養(yǎng)模式已成為其新興的養(yǎng)殖模式[3]。

日本囊對蝦具有潛沙和底質(zhì)選擇等生物學特性，對底質(zhì)要求較高，馬宜山等[4]研究認為沙底質(zhì)和泥沙底質(zhì)更利于日本囊對蝦的生長，臧維玲等[5]則通過觀察實驗發(fā)現(xiàn)日本囊對蝦幼蝦更喜歡細砂底質(zhì)。目前有關日本囊對蝦底質(zhì)選擇的研究多集中在對生長和成活的影響[6]，而針對砂粒底質(zhì)對日本囊對蝦免疫水平影響的研究尚未見報道。本研究擬設置不同粒徑的砂粒底質(zhì)，比較不同砂粒粒徑條件下日本囊對蝦免疫酶活性的變化情況，以期為日本囊對蝦工廠化和高位池精養(yǎng)模式提供理論參考。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

實驗于2016年7月22日－8月12日在浙江省海洋水產(chǎn)研究所西軒島試驗場進行，所用日本囊對蝦取自試驗場精養(yǎng)塘，平均體長 2．76±0．18 cm，平均體質(zhì)量 0．27±0．03 g，于室內(nèi)水泥池中暫養(yǎng) 7 d。暫養(yǎng)期間，微充氣，日換水量30%，每天06:00和18:00，過量投喂天邦牌對蝦配合飼料，3 h后吸出殘餌和糞便。實驗用砂購于市場，預先經(jīng)不同規(guī)格的篩網(wǎng)篩選，并經(jīng)高錳酸鉀浸泡消毒，清水沖洗，晾干后使用。

1．2 實驗設計

實驗容器為160 L塑料水槽，規(guī)格為76 cm×55 cm×45 cm。本實驗設3個覆砂組（LGS組：粒徑＞2．5 mm；MGS組：粒徑 1～2 mm；SGS組：粒徑＜0．5 mm），砂層厚度為 10 cm，1個對照組（NS組：無砂），每組設 3個重復。暫養(yǎng)結(jié)束后，每個水槽內(nèi)放養(yǎng)規(guī)格相近的健康幼蝦50尾，適應24h后開始正式實驗。實驗期間，每天06:00和18:00投喂天邦牌對蝦配合飼料，日投餌量根據(jù)攝食情況而定，其它條件與暫養(yǎng)期間相同。分別于實驗的第0 d、5 d、10 d、15 d、20 d收集日本囊對蝦全蝦，每個平行取2尾組成混合樣，全部樣品－80℃保存待測酶活性。

1．3 樣品處理

準確稱量樣品，按重量體積比加入9倍的1．5%生理鹽水組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清稀釋后用于免疫酶活性測定。

1．4 免疫酶活性測定

免疫酶活性采用試劑盒測定，購自南京建成生物工程研究所。酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）活性測定采用磷酸苯二鈉法[7]；溶菌酶（LSZ）以溶壁微球菌凍干粉為底物，采用HULTMARK等[8]的方法改進進行；超氧化物歧化酶（SOD）測定采用黃嘌呤氧化法；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－px）采用5－二硫代硝基苯甲酸法測定；過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用鉬酸銨法；丙二醛（MDA）的測定采用硫代巴比妥酸法；總抗氧化能力（T－AOC）采用ABTS法測定；蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法。

1．5 統(tǒng)計分析

用SPSS 20．0軟件進行單因素方差分析及Duncan多重比較進行數(shù)據(jù)分析處理，以P＜0．05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2．1 砂粒粒徑對日本囊對蝦非特異性免疫的影響

不同處理組日本囊對蝦ACP活性在前5 d變化趨勢有所差異，SGS組和MGS組ACP酶活升高，LGS組和NS組則明顯下降；5 d之后，各組日本囊對蝦ACP酶活均先降后升。4個處理組日本囊對蝦平均ACP酶活大小依次為SGS組、MGS組、LGS組和NS組。

各處理組日本囊對蝦AKP酶活如圖1－b所示。SGS組和MGS組AKP酶活基本保持平穩(wěn)，下降幅度較小，而LGS組AKP酶活在試驗過程中持續(xù)下降；NS組在前5 d快速下降，隨后保持平穩(wěn)。試驗前期，3個砂粒處理組AKP活性顯著高于NS組（P＜0．05），但試驗結(jié)束時LGS組AKP活性低于NS組。

不同處理組日本囊對蝦LZM酶活變化趨勢有所不同（圖1－c）。SGS組和MGS組LZM酶活在前10d出現(xiàn)下降，MGS組下降幅度大于SGS組（P＞0．05）；10d之后兩組LZM酶活開始上升，并保持穩(wěn)定。LGS組LZM酶活在前15 d持續(xù)下降，之后開始上升，NS組則在前10 d快速下降，隨后波動幅度較小。4個處理組日本囊對蝦平均 LZM 酶活分別為 SGS 組（38．57±3．01）、MGS 組（35．19±5．55）、LGS 組（33．48±10．63）、NS 組（28．01±8．38）。

圖1 砂粒粒徑對日本囊對蝦非特異性免疫的影響Fig．1 Effect of grand size on non－specific immune enzymes activities of M.japonicus

2．2 砂粒粒徑對日本囊對蝦抗氧化酶活性的影響

各處理組日本囊對蝦SOD酶活變化情況如圖2－a所示。SGS組和MGS組日本囊對蝦SOD酶活在試驗期間先升后降，但總體波動幅度較?。籒S組和LGS組SOD酶活則在前5 d明顯上升，隨后開始逐漸下降，波動幅度大于 SGS組和 MGS 組（P＞0．05）。

4個處理組日本囊對蝦GSH－PX酶活在前10 d均先升后降，NS組升高幅度顯著高于砂粒底質(zhì)組（P＜0．05）；SGS組和MGS組GSH－PX酶活在10 d之后基本保持平穩(wěn)，LGS組和NS組則再次出現(xiàn)明顯的波動。4個處理組日本囊對蝦平均GSH－PX酶活為SGS組＜MGS組＜LGS組＜NS組。

不同砂粒處理組日本囊對蝦CAT酶活變化趨勢基本一致，前期先升后降，至15 d時達到最低，隨后開始升高。LGS組和NS組日本囊對蝦CAT酶活波動幅度大于SGS組和MGS組（P＜0．05）。4個處理組日本囊對蝦平均GSH－PX酶活大小依次為SGS組、MGS組、LGS組、NS組。

各處理組日本囊對蝦MDA活性變化情況見圖2－d。SGS組、MGS組和NS組日本囊對蝦MDA活性變化差異不顯著（P＞0．05），在前5 d出現(xiàn)升高，隨后波動下降，而LGS組MDA活性在試驗期間則先升后降，波動幅度與其他處理組差異顯著（P＜0．05）。4個處理組日本囊對蝦平均GSH－PX酶活分別為SGS組（0．94±0．47）、MGS 組（0．96±0．42）、LGS 組（1．41±0．35）、NS 組（1．13±0．56）。

不同處理組日本囊對蝦T－AOC活性變化情況有所不同，SGS組T－AOC活性在試驗期間變化較小，僅在第10 d時出現(xiàn)波動下降。MGS組、LGS組和NS組在前10 d均先升后降，波動幅度差異顯著（P＜0．05），10 d之后基本保持穩(wěn)定，變化幅度較?。≒＞0．05）。不同處理組日本囊對蝦平均T－AOC活性分別為SGS組（5．48±0．63）、MGS 組（4．35±0．55）、LGS 組（3．97±1．68）、NS 組（4．33±2．13）。

圖2 砂粒粒徑對日本囊對蝦抗氧化酶活性的影響Fig．2 Effect of grand size on antioxidant enzymes activities of M.japonicus

3 討論

研究表明，外界因素的脅迫可以影響對蝦的免疫功能，比如溫度、鹽度、外界刺激等[9-10]，而目前有關砂粒底質(zhì)對對蝦免疫影響的研究還比較少。底質(zhì)是對蝦主要的生長、棲息和活動場所，在對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中占有重要地位。張沛東等[11]認為底質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特征與對蝦的行為活動關系密切，在高密度精養(yǎng)條件下，適宜的底質(zhì)可以有效地減少因養(yǎng)殖密度增加而引發(fā)的機體健康狀況和免疫力下降。因此，本文對不同粒徑砂粒底質(zhì)對日本囊對蝦的免疫功能的影響進行了研究。

對蝦的免疫反應比較原始，體內(nèi)不能產(chǎn)生免疫球蛋白，為保護自身免受傷害，機體形成了非特異性的免疫保護機制。對蝦的非特異性免疫主要包括體液免疫和細胞免疫，其中體液免疫主體是血淋巴中的酶、免疫因子和調(diào)節(jié)因子[12]。當外來異物侵入機體時，識別因子會先進行識別，然后誘導血細胞合成免疫因子，最后經(jīng)過一系列的免疫反應清除外來病原體，從而達到免疫的目的[13]。ACP、AKP、LSZ等都是對蝦體內(nèi)重要的非特異性免疫酶。ACP、AKP是兩種重要的代謝調(diào)控酶，同時也是巨噬細胞溶酶體酶的標志酶，通過形成水解酶體系消除異物，從而起到免疫防御的功能[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，3個不同粒徑的砂粒組日本囊對蝦的ACP、AKP和LSZ酶活均高于無底質(zhì)組；而在3個砂粒組中，非特異性免疫酶活隨著砂粒粒徑的增大而降低，究其原因可能是，在粗砂組和無底質(zhì)組中日本囊對蝦的潛沙行為受到抑制，影響了機體對環(huán)境變化的調(diào)節(jié)與整合，從而導致機體非特異性免疫能力下降[11]。另外還發(fā)現(xiàn)試驗期間3個砂粒底質(zhì)組日本囊對蝦的ACP、AKP和LSZ酶活基本呈現(xiàn)波動震蕩的趨勢，且波動幅度較小，而無底質(zhì)組酶活則均出現(xiàn)了明顯的下降，說明砂粒底質(zhì)更有利于維持非特異性免疫酶活性的穩(wěn)定。

MDA是脂質(zhì)過氧化物分解后的重要產(chǎn)物，間接反映細胞的受損程度，其含量的測定常與SOD和CAT的測定配合使用[16]。本實驗中，LGS組日本囊對蝦的平均MDA酶活最高，其次是NS組，說明在LGS組和NS組日本囊對蝦細胞受損的程度更高，蝦體免疫防御能力下降。SOD是一種重要的抗氧化酶，其活性高低間接反映了機體清除活性氧自由基的能力[17]，它能夠讓活性氧發(fā)生歧化，生成過氧化氫和氧氣，而GSHPX和CAT可以將過氧化氫還原成水，三者的聯(lián)合使用可以有效防止生物細胞受自由基的損傷[18]。T-AOC是綜合反映了機體非酶抗氧化系統(tǒng)和抗氧化酶系共同完成抗氧化作用。本研究中，實驗前期各試驗組SOD、CAT及T-AOC酶活均呈現(xiàn)升高趨勢，升高幅度依次為NS組、LGS組、MGS組和SGS組，這可能與日本囊對蝦在無底質(zhì)組和粗砂粒組受到的外界刺激更多，導致機體細胞產(chǎn)生了大量的活性氧自由基，從而誘導了抗氧化酶的合成[19]。實驗中后期，SOD、CAT及T-AOC酶活則隨著砂粒粒徑的增加而下降，究其原因可能是當日本囊對蝦長期處于外界脅迫環(huán)境中，抗氧化酶活性不能無限制上升，達到峰值后會出現(xiàn)下降，即有學者提出的“免疫疲勞”現(xiàn)象[20]；另一方面持續(xù)的外界底質(zhì)刺激會使蝦體生理機能失調(diào)，也會導致抗氧化酶活性的下降[17]。

本研究結(jié)果顯示，3個砂粒底質(zhì)組日本囊對蝦的非特異性免疫酶活（ACP、AKP和LZM）均高于無底質(zhì)組，其中以SGS組最高，同時SGS組的SOD、CAT及T-AOC酶活也明顯高于其他試驗組，MDA則低于他其試驗組，說明SGS組日本囊對蝦的免疫能力最高，細胞受損程度最小。因此，綜合比較認為，粒徑<0.5 mm的細砂更適合在日本囊對蝦工廠化和高位池精養(yǎng)模式中應用。

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Effects of Non-Specific Immunity and Activities of Antioxidant Enzymes of Marsupenaeus japonicus in Response to Grain Size

WANG Geng－shen,XIE Jian－jun,HE Jie,et al
(Marine and Fishery Research Institute of Zhejiang Ocean University,Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province,Key Laboratory of Marinculture and Enhancement of Zhejiang Province,Zhoushan 316021,China)

In order to investigate the effect of grainsize into immune status of Marsupenaeus japonicus,the activities of non－specific immune enzymes and antioxidant enzymes in different grain size groups(LGS:＞2．5mm,MGS:1－2 mm,SGS:＜0．5 mm,NS:control)were studied．Three non－spectific immune enzymes(ACP,AKP and LSZ)and five antioxidase enzymes(SOD,CAT,GSH－px,MDA and T－AOC)of M.japonicuswere determinined．The results showed that the activitiesof non－spectific immune enzymesin grand groups were higher than thecontrol group;and the activities were gradually decreased with the increasing grand size．The SOD,CAT and T－AOC activities were also decreased gradually with the increasing grand size．The MDA activity was increased gradually with the increasing grand size．That indicated the cell damage of M.japonicus in coarsegrain was higher than that in the fine grain．Therefore,fine sandwith grain size less than 0．5 mm is suggested for cultivating M.japonicus in the factory and high pool intensive mode．

Marsupenaeus japonicus;grandsize;non－spectific immunity;antioxidase

S968．22

A

1008－830X(2017)02－0109－06

2017－01－02

浙江省科技廳項目（2015F30003；2015F50004）

王庚申（1988－），男，河南周口人，工程師，研究方向：海水健康養(yǎng)殖．E－mail:wgs－1988@163．com

許文軍，教授級高級工程師．E－mail:xwenjun@sina．com