北京豆汁微生物群落分析及淀粉絮凝菌分離鑒定

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(錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001)

北京豆汁微生物群落分析及淀粉絮凝菌分離鑒定

張莉力,劉黎瑩,許云賀*

(錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001)

采集了三個商家的北京豆汁和麻豆腐樣本,共12份,通過高通量測序技術分析其中的細菌群落組成及多樣性,并利用綠豆汁培養(yǎng)基對優(yōu)勢菌進行分離純化和鑒定。結果表明,厚壁菌(Firmicutes)、變形桿菌(Proteobacteria)和擬桿菌(Bacteroidetes)是豆汁和麻豆腐的優(yōu)勢菌門。乳酸乳球菌(Lactococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、乳酸桿菌(Lactobacillus)是豆汁中的優(yōu)勢菌屬,乳酸乳球菌(Lactococcus)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella)和醋酸桿菌(Acetobacter)是麻豆腐中的優(yōu)勢菌屬。利用產(chǎn)酸能力和絮凝淀粉能力篩選出兩株符合豆汁發(fā)酵要求的絮凝產(chǎn)酸菌株D-23和M-10,經(jīng)16S rRNA 測序鑒定分別為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactissubsp.Lactis)和醋酸桿菌(Acetobacterindonesiensis)。這兩株菌對北京豆汁工業(yè)化純菌發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義。

豆汁,麻豆腐,高通量測序,淀粉絮凝菌,分離鑒定

北京豆汁是具有代表性的老北京小吃之一,其歷史悠久,源遠流長[1-4]。豆汁是加工綠豆淀粉后的副產(chǎn)物,在綠豆淀粉加工中也被稱為酸漿[5]。兌入生豆汁是綠豆淀粉加工的關鍵工序,生豆汁發(fā)揮兩方面作用:一方面,生豆汁中的微生物可以作為絮凝劑加速淀粉沉降。生豆汁加入綠豆粉漿中以后,淀粉迅速凝集成絮團并快速沉降,淀粉相對密度最大,占最底層,淀粉上層是含蛋白質、糊精等物質的“麻豆腐”,最上層即為灰綠色的液體,此液體經(jīng)過6～8 h的發(fā)酵變酸后就是生豆汁[6-7],因此兌入生豆汁的另一個作用就是作為發(fā)酵劑,使豆汁發(fā)酵變酸。

豆汁是自然發(fā)酵的產(chǎn)物,產(chǎn)品質量不穩(wěn)定。已有研究表明,不論是絮凝淀粉活性還是發(fā)酵豆汁產(chǎn)酸都是豆汁中的微生物發(fā)揮的作用。所以,研究豆汁的微生物區(qū)系,篩選出具有絮凝淀粉活性的產(chǎn)酸菌,對于豆汁的工業(yè)化發(fā)酵具有重要意義[7-10]。發(fā)酵產(chǎn)酸是豆汁發(fā)酵的主要過程。丁玉振等采用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)技術分別分析了不同商家和實驗室自然發(fā)酵豆汁中的主要產(chǎn)酸菌,確定Lactococcuslactis、Lactobacilluscurvatus和Leuconostoccitreum為主要發(fā)酵產(chǎn)酸菌[1,11]。傳統(tǒng)平板分離技術研究微生物群落具有一定的局限性,為了篩選出可用于豆汁發(fā)酵的菌種,需要更加全面探明自然發(fā)酵豆汁及麻豆腐微生物區(qū)系,本研究利用高通量測序技術,分析不同商家未經(jīng)煮制的豆汁和麻豆腐的微生物多樣性,確定豆汁和麻豆腐的優(yōu)勢菌群,以此為基礎結合傳統(tǒng)平板分離技術篩選既可以加速淀粉沉降又可以發(fā)酵產(chǎn)酸的豆汁發(fā)酵菌,為老北京豆汁的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎[12-13]。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

豆汁 北京不同地點三個商家(DZ、LCQK、LFS)的北京豆汁樣本(未煮制)3個和麻豆腐樣本3個(每個樣本2個重復),豆汁樣本標記為D(D-DZ-1、D-DZ-2;D-LCQK-1、D-LCQK-2;D-LFS-1、D-LFS-2),麻豆腐樣本標記為M(M-DZ-1、M-DZ-2;M-LCQK-1、M-LCQK-2;M-LFS-1、M-LFS-2),共計12個樣本,儲存在液氮中,用于DNA 的提取和高通量測序分析;綠豆和綠豆淀粉 市售食用級;蔗糖、葡萄糖、乳糖、酵母膏、磷酸氫二鉀、乙酸鈉 分析純;綠豆汁培養(yǎng)基 20 g綠豆放于1 L蒸餾水中,煮沸20 min過濾,加入20 g葡萄糖、2 g乳糖、5 g醋酸鈉、5 g酵母提取物、2 g K2HPO4,添加蒸餾水到1 L,121 ℃滅菌15 min;綠豆汁瓊脂培養(yǎng)基 綠豆汁培養(yǎng)基1 L、15 g瓊脂,121 ℃滅菌15 min。

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 上海蘇凈實業(yè)有限公司;LRH-350F生化培養(yǎng)箱 上海捷呈實驗儀器有限公司;HZQ-F200型振蕩培養(yǎng)箱 上海華鄰實業(yè)有限公司;DNA快速提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;TG16K-II臺式高速離心機 濟南福的機械有限公司;PHS-3B精密pH計 上海雷磁儀器廠;UV754PC紫外分光光度計 上海佑科儀表有限公司;JYL-Y99料理機 九陽股份有限公司;OLYMPUS BX53顯微鏡 奧林巴斯(中國)有限公司；S900掃描電鏡 Hitachi公司。

1.2實驗方法

1.2.1 DNA提取與高通量測序 使用DNA提取試劑盒對12個樣本的DNA分別進行提取。使用細菌16S V4 rDNA通用引物序列 520F:AYTGGGYD TAAAGNG;802R:TACNVGGGTATCTAATCC[14],擴增16S rDNA V4 可變區(qū)。擴增條件:初始變性溫度98 ℃、5 min;98 ℃、30 s,50 ℃、30 s,72 ℃、30 s,28個循環(huán);72 ℃、5 min。純化PCR產(chǎn)物,并利用 TruSeq文庫構建試劑盒構建文庫。通過Illumina Miseq平臺測序。測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質量過濾,利用軟件FLASH對通過質量過濾的序列進行連接。運用QIIME進行序列過濾,運用MOTHUR軟件中uchime的方法去除嵌合體序列,得到最終用于后續(xù)分析的優(yōu)質序列。16S rDNA V4 可變區(qū)擴增和測序工作由上海派森諾生物技術有限公司完成。

1.2.2 操作分類單位(OUTs)聚類 在QIIME 中調用 uCLUST的方法對優(yōu)質序列按相似度0.97進行聚類,選取每個類最長的序列為代表序列。在 QIIME 中采用 BLAST的方法與序列數(shù)據(jù)庫Greengene進行比對,獲得每個 OTUs 分類學信息。根據(jù)OTUs列表中的各樣本物種豐度情況,應用軟件MOTHUR中的Summary single 命令,計算3種常用的生物多樣性指數(shù)。利用R 軟件生成組間OTUs 的維恩圖。

1.2.3 菌株的分離 從豆汁和麻豆腐樣本中,每個樣本取25 mL在30 ℃、150 r/min 孵育5 min,進行系列稀釋(10-3～10-8)。每個稀釋度取0.1 mL涂布于含有1%碳酸鈣的綠豆汁瓊脂培養(yǎng)基平板上,30 ℃ 培養(yǎng) 24～48 h[15]。挑取具有碳酸鈣溶解圈的菌落進行純化,直至獲得純菌落為止。將分離到的菌株接入到綠豆汁培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)24 h,以絮凝能力為指標,篩選出對淀粉有絮凝活性的菌株。

1.2.4 絮凝率(FR)和pH測定 將分離篩選到的菌株接入綠豆汁培養(yǎng)基中,在30 ℃培養(yǎng)24 h,經(jīng)兩次擴培,測定發(fā)酵液的pH和絮凝率。絮凝率測定方法:80 mL 蒸餾水中加入0.4 g綠豆淀粉,再加入2 mL菌株發(fā)酵液,在容器中攪拌2 min 后,靜置5 min。對照組使用蒸餾水替代發(fā)酵液。通過測量上清液吸光度的變化,計算絮凝率,公式如下:

式中:A為550 nm對照組光密度值,B為550 nm樣本光密度值。

1.2.5 16S rDNA擴增與測序 取篩選菌株發(fā)酵液5 mL,4000×g離心10 min,棄上清,使用DNA提取試劑盒提取DNA。使用引物27F(AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG)和1492R(CTACGGCTACCTTGTT ACGA)擴增菌株的16S rDNA,擴增條件為 95 ℃、5 min后進入35個擴增循環(huán)(95 ℃、30 s,58 ℃、30 s,72 ℃、90 s),最后72 ℃延伸7 min。純化PCR 產(chǎn)物,進行測序,測序工作由上海派森諾生物技術有限公司完成。測得的序列與GenBank 序列進行比對(BLASTn)[16-18]。

1.2.6 細菌黏附淀粉顆粒的掃描電鏡觀察 將分離到的菌株(D-23和M-10)分別接入綠豆汁培養(yǎng)基中,在30 ℃培養(yǎng)24 h后為分離菌株培養(yǎng)液。取綠豆淀粉2.5 g 加水100 mL攪拌均勻,加入分離菌株培養(yǎng)液10 mL,攪拌均勻,沉淀5 min后去上清,收集底部結合細菌的淀粉顆粒。結合細菌的淀粉顆粒使用3%戊二醛溶液固定,置于離子濺射儀的樣本倉中,噴金后,取出,在掃描電鏡觀察室進行觀察[19]。

1.2.7 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 19.0 進行ANOVA單因素方差分析及LSD多重檢驗(p<0.05),數(shù)值以均值±標準誤表示[20]。

2 結果與分析

2.1 DNA提取與高通量測序

使用DNA提取試劑盒對樣本的DNA進行提取后,應用細菌16S V4 rDNA通用引物進行PCR擴增,所有樣本都能擴增出有效條帶,滿足后續(xù)Illumina Miseq平臺測序要求。高通量測序建庫過程中的PCR擴增會產(chǎn)生嵌合體序列,測序過程中會產(chǎn)生點突變等測序錯誤,為了保證分析結果的準確性,需要對有效序列進行進一步過濾和去除嵌合體處理,得到最終用于后續(xù)分析的優(yōu)質序列。測序得到每個樣本的有效序列數(shù)和優(yōu)質序列數(shù)見表1。

表1 高通量測序獲得樣本序列數(shù) Table 1 Number of samples sequence by high-throughput sequencing

2.2 OUTs聚類及注釋

通過對樣本V4 可變區(qū)進行PCR擴增,使用Illumina Miseq平臺測序,各組獲得的OTUs數(shù)量見圖1。D組(D-DZ、D-LFS、D-LCQK)共獲得637個OTUs,其中D-DZ 組428個,D-LFS組449個,D-LCQK組391個(圖1a)。M組(M-DZ;M-LFS;M-LCQK)共獲得656個OTUs,其中M-DZ組450個,M-LFS組406個,M-LCQK組327個(圖1b)。豆汁組中共有OTUs個數(shù)為218個,而在麻豆腐組中共有OTUs個數(shù)為147個。從OUT總數(shù)(637和656)來看,豆汁和麻豆腐差不多,但是從不同商家共有的OUTs數(shù)量(218和147)來看,豆汁中多于麻豆腐。

圖1 各組間OTUs分布Fig. 1 Analysis of shared OTUs of different groups

菌群Alpha多樣性是指一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內的多樣性,多樣性指數(shù)是反映豐富度和多樣性的綜合指標。Chao和ACE指數(shù)是計算菌群豐度的指數(shù),Chao或ACE指數(shù)越大,說明群落豐富度越高;Shannon指數(shù)是計算菌群多樣性的指數(shù),Shannon值越大,說明群落多樣性越高。從表2可以看出,豆汁樣本間多樣性指數(shù)差異不顯著(p>0.05),說明豆汁中細菌的豐富度和多樣性在不同商家之間變化不大。麻豆腐是生產(chǎn)綠豆淀粉的副產(chǎn)物,位于豆汁的下層,其中含有蛋白質等適于微生物生長豐富的營養(yǎng)物質,在麻豆腐中存在大量具有絮凝淀粉能力的微生物。從表3可以看出,不同商家之間麻豆腐中的細菌多樣性差異顯著(p<0.05),即M-LCQK組的Shannon指數(shù)顯著低于(p<0.05)M-DZ和M-LFS組。

表2 豆汁中微生物多樣性指數(shù)Table 2 Microbiota diversity index of Douzhir

注:同列肩標相同小寫字母表示差異不顯著(p>0.05)。

表3 麻豆腐微生物多樣性指數(shù)Table 3 Microbiota diversity index of Ma tofu

注:同列肩標不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);表4同。

2.3豆汁和麻豆腐中微生物組成分布

12個樣本中共檢測到6個門,三個商家的豆汁微生物區(qū)系相近,Firmicutes是最豐富的菌門(67%以上),其次是Proteobacteria和Bacteroidetes(圖2)。 Firmicutes和Proteobacteria菌門在D-DZ、D-LFS和D-LCQK組中分別占有97.95%、97.79%和96.28%。在M-DZ和 M-LFS組中 Firmicutes是最豐富的菌門,但是在M-LCQK 組中Proteobacteria 是最豐富的菌門。由此可以看出,除了M-LCQK組外,所有的豆汁樣本及M-DZ和M-LFS組都是Firmicutes占絕對優(yōu)勢,其次為Proteobacteria(圖2)。在三個商家的豆汁和麻豆腐中，F(xiàn)irmicutes和Proteobacteria兩個門的微生物之和占94%以上。

圖2 豆汁和麻豆腐中微生物在門水平的組成Fig.2 Distribution of Douzhir and Ma tofu microbiota composition at phylum level注:a. D-DZ;b. D-LFS;c. D-LCQK;d. M-DZ;e. M-LFS;f. M-LCQK；圖3同。

豆汁在屬水平上的分布見圖3。三個不同商家來源的豆汁中優(yōu)勢菌屬均為Lactococcus、Streptococcus、Klebsiella和Lactobacillus,所有豆汁樣本中Lactococcus含量均最高,從37.6%至54.53%。

麻豆腐樣本在屬水平上的分布見圖3。M-LFS和M-LCQK中均含有Acetobacter,且占絕對優(yōu)勢,M-LCQK中含量達80.67%,M-LFS為31.09%。M-DZ中,Lactococcus為優(yōu)勢菌屬,三個不同商家來源的麻豆腐中都含有Lactobacillus,且含量均在10%以上。

在M-LFS和M-LCQK樣本中占絕對優(yōu)勢的Acetobacter在豆汁樣本中含量不高。麻豆腐的主要成分是蛋白質,綠豆淀粉乳加入生豆汁后pH下降,一些蛋白質沉降下來,位于淀粉上層,豆汁下層;而豆汁的主要成分是一些可溶性的物質,二者的營養(yǎng)成分的差異可能是豆汁與麻豆腐菌群差異的主要原因[2]。

陳宇翔等[3]采用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)技術分析了北京豆汁的優(yōu)勢菌群,分離出36株乳酸菌,確定豆汁主要是乳酸菌發(fā)酵的產(chǎn)物,Lactococcuslactis和Lactobacilluscurvatus為主要發(fā)酵乳酸菌。丁玉振等[1]在實驗室進行了豆汁自然發(fā)酵實驗,認為細菌產(chǎn)酸是綠豆乳自然酸化的主要原因,主要產(chǎn)酸微生物為Lactococcuslactis和Leuconostoccitreum。高通量測序技術與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術對豆汁的微生物菌群的檢測結果存在一定的差異,平板培養(yǎng)技術未分離檢測到Klebsiella、Streptococcus和Acetobacter等菌屬,這可能是由于傳統(tǒng)技術受所選擇培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度等條件的限制,并不適合所有微生物的生長。其次,豆汁本身就是自然發(fā)酵的產(chǎn)物,其菌群受到自然條件和操作條件的影響,不同批次、不同商家和不同季節(jié)的豆汁其菌群存在差異[12-13,21]。

2.4絮凝淀粉菌株的分離和鑒定

利用含有碳酸鈣的綠豆汁培養(yǎng)基平板,從樣本中分離出56株有碳酸鈣溶解圈的產(chǎn)酸菌株,之后以是否對淀粉具有絮凝能力為指標,初步篩選出8株對淀粉有絮凝活性的菌株。以絮凝率和pH為指標復篩發(fā)酵液pH在4.0以下且絮凝率高的菌株。從表4中可以看出,菌株D-23和M-10的絮凝率大于50%,顯著高于其他菌株(p<0.05),而且發(fā)酵液pH在4以下。

表4 初篩菌株的絮凝率和pHTable 4 FR and pH of primary screening strains

圖3 豆汁和麻豆腐中微生物在屬水平的組成Fig.3 Distribution of Douzhir and Ma tofu microbiota composition at genera level

16S rRNA測序結果比對表明 D-23 菌株為Lactococcuslactissubsp.lactis,M-10菌株為Acetobacterindonesiensis。D-23菌株是從豆汁樣本中分離篩選到的,從圖3可以看出,三個不同商家來源的豆汁中優(yōu)勢菌屬均為Lactococcus。M-10菌株是從麻豆腐樣本中分離篩選到的,從圖3可以看出,Acetobacter是麻豆腐樣本中M-LFS和M-LCQK組的優(yōu)勢菌屬?？梢?本研究篩選到的兩株菌D-23和M-10都來自于樣本中的優(yōu)勢菌屬。

2.5菌株黏附淀粉顆粒的顯微分析

在光學顯微鏡下觀察到加入篩選菌株發(fā)酵液前后綠豆淀粉的分布狀態(tài):圖4(a)為加入篩選菌株發(fā)酵液前,淀粉顆粒在顯微鏡下均勻分布;圖4(b、c)為加入篩選菌株D-23和M-10發(fā)酵液后,眾多淀粉顆粒凝聚成大的絮凝體。通過掃描電鏡可以觀察到菌體細胞結合到淀粉顆粒表面(圖5),將眾多淀粉顆粒粘結在一起,使淀粉顆粒凝集成大的絮凝體,正是淀粉顆粒變大后重力增加,從而加速了淀粉的沉降。研究表明,Lactococcuslactis在用于綠豆淀粉加工的酸漿(豆汁在綠豆淀粉加工中也被稱為酸漿)中也被分離出來過,且被證明是該菌體而不是菌體產(chǎn)的代謝產(chǎn)物具有加速綠豆淀粉沉降的作用[6-7]。對甘薯酸漿中的微生物絮凝性研究也表明,絮凝活性物質分布于菌體上[22-23]。Acetobacterindonesiensis是本研究首次分離出來被證明具有絮凝淀粉活性的產(chǎn)酸菌。

圖4 淀粉顆粒凝集的光學顯微鏡圖 Fig.4 Optical micrograph of starch granule aggregation

圖5 菌株D-23和M-10黏附淀粉顆粒掃描電鏡圖 Fig.5 Scanning electron micrograph of starch granules with attached D-23 and M-10 cells

本研究所篩選的2株有淀粉結合活性的產(chǎn)酸菌株可以作為開發(fā)豆汁發(fā)酵劑的菌種,為北京豆汁的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。

3 結論

Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes是豆汁和麻豆腐的優(yōu)勢菌門,Firmicutes和Proteobacteria兩個門的微生物之和占94%以上。Lactococcus、Streptococcus、Klebsiella和Lactobacillus是豆汁中的優(yōu)勢菌屬,Lactococcus、Lactobacillus和Acetobacter是麻豆腐中的優(yōu)勢菌屬。

利用平板分離技術從豆汁和麻豆腐的優(yōu)勢菌中分離篩選出2株具有絮凝淀粉活性的產(chǎn)酸菌(Lactococcuslactissubsp.Lactis和Acetobacterindonesiensis),2株菌對淀粉的絮凝率均在50%以上,發(fā)酵液的pH在4.0以下。本研究為北京豆汁工業(yè)化純菌發(fā)酵生產(chǎn)奠定了基礎。

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AnalysisofBeijingDouzhirmicrobiotaandisolationandidentificationofadvantagebacteriumcapableofflocculatingstarch

ZHANGLi-li,LIULi-ying,XUYun-he*

(College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China)

12 samples of Douzhir(D groups)and Ma tofu(M groups)were collected from three manufacturers. High-throughput sequencing was used to analyze composition and diversity of bacterial community. Based on this method,dominant bacteria were screened and identified using mung bean juice as medium. In both Douzhir and Ma tofu,dominant bacteria belonged to Firmicutes,Proteobacteria and Bacteroidetes. In Douzhir of three manufacturers,predominant genera wereLactococcus,Streptococcus,KlebsiellaandLactobacillus. In Ma tofu of three manufacturers,predominant genera wereLactococcus,LactobacillusandAcetobacter. After sequencing of 16S rRNA,they belong toLactococcuslactissubsp.LactisandAcetobacterindonesiensisrespectively. These two strains had important significance for industrial fermentation production of Beijing Douzhir.

Douzhir;Ma tofu;high-throughput sequencing;starch-flocculating strains;isolation and identification

2017-02-28

張莉力(1977-)，女，博士，副教授，主要從事食品微生物方面的研究，E-mail：13634967549@163.com。

*通訊作者:許云賀(1978-)，男，博士，副教授，主要從事畜牧微生物應用方面的研究，E-mail：sn_97@126.com。

國家自然科學基金項目(31301499)；遼寧省自然科學基金項目(2014022052，2014022046)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)16-0136-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.026