N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑在枯草芽孢桿菌的構(gòu)建

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(1.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049;3.上?？萍即髮W(xué),上海 201210;4.上海大學(xué),上海 200444)

N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑在枯草芽孢桿菌的構(gòu)建

李思杰1,2,3,紀(jì)明華1,趙利超1,4,史吉平1,3,孫俊松1,3,*

(1.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049;3.上?？萍即髮W(xué),上海 201210;4.上海大學(xué),上海 200444)

對(duì)食品安全認(rèn)可的枯草芽孢桿菌進(jìn)行菌株改造,利用生物發(fā)酵法制備N(xiāo)-乙酰神經(jīng)氨酸。首先通過(guò)基因合成獲取來(lái)自枯草芽孢桿菌溶源體的Pholin啟動(dòng)子并構(gòu)建了pMK4-Pholin-GFP質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌,以GFP為報(bào)告基因,對(duì)Pholin及其它常見(jiàn)的強(qiáng)啟動(dòng)子進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄效率的比較,然后將優(yōu)化后的Pholin用于構(gòu)建N-乙酰神經(jīng)氨酸表達(dá)質(zhì)粒pMK4-Pholin-neuBC。研究結(jié)果顯示:Pholin啟動(dòng)子是一種優(yōu)異的枯草芽孢桿菌組成型強(qiáng)啟動(dòng)子,在利用LB進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中,Pholin的轉(zhuǎn)錄效率為同樣方式構(gòu)建下的P43啟動(dòng)子的2.62倍。通過(guò)N-乙酰神經(jīng)氨酸表達(dá)質(zhì)粒,可以成功地在枯草芽孢桿菌168菌株中實(shí)現(xiàn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的重組生產(chǎn),搖瓶培養(yǎng)中N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量為0.226 g/L。本文為枯草芽孢桿菌進(jìn)行N-乙酰神經(jīng)氨酸的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)奠定了研究基礎(chǔ)。

啟動(dòng)子,N-乙酰神經(jīng)氨酸,枯草芽孢桿菌

N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)能促進(jìn)大腦發(fā)育,具有改善人體記憶力、抗病毒等功效,在食品保健品和醫(yī)藥領(lǐng)域均有重要的用途[1]。但是,N-乙酰神經(jīng)氨酸單體的制備成本較高,因此近年來(lái)多種微生物被用于N-乙酰神經(jīng)氨酸的外源生產(chǎn),如大腸桿菌通過(guò)外源表達(dá)UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因(neuC)和N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因(neuB),并通過(guò)敲除相關(guān)的基因已經(jīng)可以高產(chǎn)Neu5Ac[2],但大腸桿菌作為革蘭氏陰性菌,在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)積累大量的內(nèi)毒素[3]。因此,利用食品安全領(lǐng)域認(rèn)可的枯草芽孢桿菌進(jìn)行Neu5Ac的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要的研究和應(yīng)用前景。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

枯草芽孢桿菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不高,生長(zhǎng)迅速,發(fā)酵密度高,其微生物菌體或發(fā)酵產(chǎn)品在食品和制藥領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[4];枯草芽孢桿菌在外源蛋白生產(chǎn)時(shí),不僅表達(dá)量高,還可借助強(qiáng)大的分泌系統(tǒng)進(jìn)行分泌表達(dá),可以大大降低外源蛋白的分離成本,因此是許多食品工業(yè)用酶的首選宿主細(xì)胞。但枯草芽孢桿菌的遺傳操作不如大腸桿菌便捷高效,然而近年來(lái)枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)得到了全面的提升,無(wú)論遺傳工具還是宿主細(xì)胞生產(chǎn)性能的優(yōu)化,均取得了大量成果,可使用的遺傳工具逐步增多,為枯草芽孢桿菌的改造創(chuàng)造了條件。枯草芽孢桿菌168菌株為實(shí)驗(yàn)室常用的菌株,其轉(zhuǎn)化效率較高,遺傳及代謝圖譜比較清晰;與其相近的枯草芽孢桿菌164菌株(ATCC 6051a)基因組序列也已公開(kāi),對(duì)于外源蛋白具有更好的分泌效果,但轉(zhuǎn)化操作不及168菌株[5]。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)將comk基因[6]整合到枯草芽孢桿菌164菌株中,利用comk的誘導(dǎo)表達(dá)將164菌株的轉(zhuǎn)化效率提高了千倍以上,得到了具有更高轉(zhuǎn)化效率的枯草芽孢桿菌164S菌株。

此外,在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化過(guò)程中,高效啟動(dòng)子的搜尋、驗(yàn)證和應(yīng)用一直是一項(xiàng)十分重要的研究?jī)?nèi)容,盡管有不少已被工業(yè)應(yīng)用,如P43、PxylA、PamyQ、P1398等[7-8],但是由于蛋白種類及基因大小、蛋白折疊等各方面的差異性,仍然需要更多不同的高效啟動(dòng)子以滿足不同重組生產(chǎn)菌株構(gòu)建的需要。研究發(fā)現(xiàn)含Φ105前噬菌體的枯草芽孢桿菌168溶源菌,因?yàn)槭删w強(qiáng)大的表達(dá)元件,在工業(yè)酶生產(chǎn)菌株的構(gòu)建中得到應(yīng)用[9],而Φ105是一類溫和的噬菌體,可以作為載體,高效而特異地將外源基因整合到枯草芽孢桿菌168菌株[10]。Yun-Chung Leung等將Φ105噬菌體Holin蛋白編碼區(qū)進(jìn)行了改造,使其具有插入外源基因表達(dá)外源蛋白的性能[11]。為了避免完整噬菌體基因組DNA引入細(xì)胞后帶來(lái)的菌株裂解的風(fēng)險(xiǎn),在本研究中,分離了Pholin啟動(dòng)子,并對(duì)其核心序列進(jìn)行了優(yōu)化,將基因合成后的啟動(dòng)子克隆到質(zhì)粒pMK4-GFP載體中,以GFP的激發(fā)熒光量為標(biāo)記,進(jìn)行Pholin與P43、P1398及PxylA的轉(zhuǎn)錄效率的對(duì)比;并將N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(neuB)和UDP-G1cNac 2-差向異構(gòu)酶(neuC)的基因克隆到Pholin之后,構(gòu)建了Neu5Ac的合成途徑,利用枯草芽孢桿菌進(jìn)行了Neu5Ac的重組表達(dá)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

實(shí)驗(yàn)中用到的質(zhì)粒及菌種 均見(jiàn)表1;枯草芽孢桿菌培養(yǎng)的LB培養(yǎng)基 酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉10 g/L;Neu5Ac合成發(fā)酵所用的甘油培養(yǎng)基 甘油40 g/L,氯化銨4.0 g/L,氯化鉀2.5 g/L,硫化鎂0.9 g/L,胰蛋白胨2.5 g/L,碳源中所用的甘油可由10～20 g/L的葡萄糖所代替;限制性內(nèi)切酶PstI、EcoRI、XmaI 購(gòu)自賽默飛世爾公司;Taq DNA聚合酶及Primer star 購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;木糖及N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;PCR清潔試劑盒、質(zhì)粒小劑量提取試劑盒等 來(lái)自杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司;One Step Cloning Kit 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;DNA測(cè)序及合成 由上海生工生物工程公司完成。

Synergy H1型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio Tek公司;S1000型PCR儀器 美國(guó)BIO-RAD公司;HE90型DNA凝膠電泳系統(tǒng) 上海天能公司;RID-10A/SPD-20A高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

圖1 Pholin啟動(dòng)子序列Fig.1 Alignment of DNA sequences of Pholinpromoters注:序列中上一行為優(yōu)化后的,下面的一行為原始啟動(dòng)子序列,加粗的序列為Xma I位點(diǎn),方框中所列的為修改前后的保守區(qū)啟動(dòng)子序列,其中“.”為堿基缺失位點(diǎn)。

1.2.1 Pholin啟動(dòng)子序列的優(yōu)化和構(gòu)建 Pholin啟動(dòng)子存在兩個(gè)明顯的由-35和-10組成的雙啟動(dòng)區(qū),第一個(gè)啟動(dòng)區(qū)的-35區(qū)域的TAAACA在設(shè)計(jì)中替換為更經(jīng)典的TTGACA,而-10區(qū)域TTTTAT堿基序列替換為T(mén)ATAAT;再將第二個(gè)啟動(dòng)區(qū)域的-35區(qū)域TAGACA堿基序列替換為T(mén)TAGCA,而-10區(qū)域TTGAG被更改為T(mén)ATAAT,如圖1所示。優(yōu)化后的Pholin啟動(dòng)子序列送交公司進(jìn)行DNA合成,并TA克隆到pUC57載體上,該啟動(dòng)子Pholin還設(shè)計(jì)了XmaI位點(diǎn)(圖1中黑色粗體字)用于啟動(dòng)子的克隆,以完成GFP表達(dá)質(zhì)粒pMK4-Pholin-GFP及N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑表達(dá)質(zhì)粒pMK4-Pholin-neuBC的構(gòu)建。

1.2.2 Pholin啟動(dòng)子表達(dá)效率驗(yàn)證 不同啟動(dòng)子以相同的方式克隆到pMK4質(zhì)粒上,將構(gòu)建的五種表達(dá)質(zhì)粒pMK4-GFP、pMK4-Pholin-GFP、pMK4-P1398-GFP、pMK4-PxylA-GFP及pMK4-P43-GFP分別轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌164S菌株[13]。其中,質(zhì)粒pMK4-GFP攜帶表達(dá)GFP的基因,但是不含啟動(dòng)子元件。分別挑取3～5個(gè)不同的轉(zhuǎn)化子,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵并測(cè)定GFP蛋白熒光表達(dá)量。在搖瓶發(fā)酵時(shí),將種子液按照1%的比例接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL的三角瓶中,37 ℃,200 r/min振蕩連續(xù)培養(yǎng)48 h,每間隔4 h進(jìn)行取樣,測(cè)定細(xì)胞的生物量和GFP熒光強(qiáng)度。

細(xì)胞的生物量的測(cè)定方法:將發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)連續(xù)倍比稀釋后,測(cè)量OD600值,并將獲得的0.3～0.5區(qū)間的值乘以稀釋倍數(shù)得到樣品的準(zhǔn)確OD600,以此作為生物量進(jìn)行對(duì)比。

GPF熒光測(cè)定方法:對(duì)搖瓶發(fā)酵菌液進(jìn)行取樣,菌液經(jīng)梯度稀釋100倍后用于GFP的熒光檢測(cè)。取200 μL稀釋后的菌液置于96孔板中,放入酶標(biāo)儀進(jìn)樣器中開(kāi)始熒光測(cè)定,測(cè)量時(shí)選擇熒光檢測(cè)模式,讀數(shù)類型選擇“endpoint”,設(shè)定激發(fā)光波長(zhǎng)為485 nm,檢測(cè)光波長(zhǎng)為520 nm,設(shè)定測(cè)量溫度30 ℃。

1.2.3 Neu5Ac合成菌株的構(gòu)建 含有neuB及neuC的DNA片斷通過(guò)基因合成獲得,以質(zhì)粒pUC57-neuBC為DNA模板,所需引物分別為neuF1:GTAAAACGACGGCCAGTGAATTCCTATCATTTTATAT CCTTAAAAACTTTTTGTGTGC,以及neuR1:GGGGG CAGTTTAGAACCCGGGTAACAAGGAGGAATAAAAA ATGAAAGAAATAAAAATAC;質(zhì)粒pMK4-Pholin-GFP進(jìn)行XmaI/EcoRI 雙酶切并經(jīng)清潔后,按1∶3的比例和純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行一步法克隆(InFusion Cloning),所用試劑盒為One Step Cloning Kit,電轉(zhuǎn)感受態(tài)大腸桿菌DH5α后[14],經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證獲得neuBC的表達(dá)質(zhì)粒pMK4-Pholin-neuBC,再以電轉(zhuǎn)化的方法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌168中[15],構(gòu)建N-乙酰神經(jīng)氨酸的重組生產(chǎn)菌株。

1.2.4 Neu5Ac合成的發(fā)酵 Neu5Ac搖瓶發(fā)酵時(shí),先挑取3個(gè)不同的重組子單克隆,接入LB種子培養(yǎng)基,再將種子液以1%體積比接種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL的三角瓶中,37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。在第一批發(fā)酵數(shù)據(jù)收集時(shí),加入甘油的含量為20 g/L,但由于細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,對(duì)培養(yǎng)基的碳源進(jìn)行了替代優(yōu)化;第二批發(fā)酵數(shù)據(jù)收集時(shí),一組發(fā)酵培養(yǎng)基,將甘油的含量補(bǔ)加至40 g/L;另一組,將甘油替換為1%含量的葡萄糖。

1.2.5 液相色譜測(cè)定Neu5Ac含量 利用液相色譜測(cè)定Neu5Ac產(chǎn)量,所用色譜柱為Aminex HPX-87H柱,檢測(cè)器為島津RID-l0A型示差檢測(cè)器,檢測(cè)參數(shù)設(shè)定為流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4,流速為0.8 mL/min,柱溫為65 ℃,進(jìn)樣量為20 μL。先進(jìn)行N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。具體為,稱量Neu5Ac標(biāo)品,用去離子水稀釋成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 g/L五個(gè)濃度,根據(jù)上述條件進(jìn)行分析。收集數(shù)據(jù)后,以Neu5Ac濃度為縱坐標(biāo)Y軸,對(duì)應(yīng)的液相色譜峰面積為橫坐標(biāo)X值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.00000544X+0.0171,相關(guān)系數(shù)R2=0.9999107。收集的發(fā)酵液樣品,12000 r/min離心5 min,取20 μL上清液以同樣的方法進(jìn)行測(cè)定,并根據(jù)公式將峰面積換算得出Neu5Ac的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1含Pholin啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

Pholin在枯草芽孢桿菌中并沒(méi)有被單獨(dú)使用過(guò),根據(jù)其序列的特點(diǎn),針對(duì)引發(fā)高效轉(zhuǎn)錄的兩個(gè)保守區(qū),均進(jìn)行了序列優(yōu)化(圖1),然后將設(shè)計(jì)的啟動(dòng)子序列送交生物公司進(jìn)行了DNA合成,并TA克隆到載體pUC57上,將pUC57-Pholin和攜帶啟動(dòng)子P43的質(zhì)粒pMK4-P43-GFP同時(shí)進(jìn)行限制性內(nèi)切酶PstI和XmaI消化,酶切片斷以試劑盒清潔后進(jìn)行連接,構(gòu)建了pMK4-Pholin-GFP質(zhì)粒(圖2左半部分所示);neuBC同樣經(jīng)基因合成并TA克隆到載體pUC57上,并以pUC57-neuBC為模板獲得含neuBC的PCR產(chǎn)物,該DNA與經(jīng)XmaI/EcoRI酶切的質(zhì)粒pMK4-Pholin-GFP進(jìn)行一步法克隆(圖2右半部分所示),得到表達(dá)N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑的質(zhì)粒pMK4-Pholin-neuBC。

圖2 表達(dá)質(zhì)粒pMK4-Pholin-GFP和pMK4-Pholin-neuBC的構(gòu)建Fig.2 Construction of pMK4-Pholin-GFP and pMK4-Pholin-neuBC

2.2 Pholin啟動(dòng)子表達(dá)效率的比較研究

圖3 綠色熒光蛋白在LB培養(yǎng)基中的表達(dá)以及生物量的變化曲線Fig.3 The profile of cellular biomass and emitted GFP fluorescence of recombinant cells cultivated in LB broth

將分別轉(zhuǎn)化了pMK4-GFP、pMK4-Pholin-GFP、pMK4-P1398-GFP、pMK4-PxylA-GFP及pMK4-P43-GFP質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌164S重組菌株,進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng),測(cè)定細(xì)胞的OD600值和GFP熒光強(qiáng)度。圖3(a)結(jié)果清晰地顯示,含pMK4-GFP的重組菌,因質(zhì)粒不含啟動(dòng)子,發(fā)酵過(guò)程中,熒光值一直很低;而其它重組菌均表達(dá)了大量的GFP,但是菌液在稀釋后測(cè)得的熒光值顯示,48 h時(shí)Pholin啟動(dòng)子帶來(lái)的熒光表達(dá)強(qiáng)度值為55799.0 a.u.,與其他啟動(dòng)子橫向比較,為PxylA啟動(dòng)子的4.28倍,P43啟動(dòng)子的2.62倍,P1398啟動(dòng)子的1.88倍。由此可以證明Pholin啟動(dòng)子是一個(gè)非常優(yōu)異的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子,其啟動(dòng)效應(yīng)強(qiáng)于傳統(tǒng)的組成型P43啟動(dòng)子及誘導(dǎo)型PxylA和P1398啟動(dòng)子。此外,由生物量測(cè)定曲線可看出,搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)24 h后,枯草芽孢桿菌164S重組菌開(kāi)始進(jìn)入延滯期,GFP的表達(dá)也趨近于飽和,熒光增加開(kāi)始放緩,說(shuō)明Pholin啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式為典型的組成型方式。圖3(b)所示,攜帶不同質(zhì)粒的重組枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和細(xì)胞數(shù)幾乎完全一致,在0～28 h細(xì)胞持續(xù)增殖,而在32 h之后OD600逐漸下降。但搖瓶發(fā)酵過(guò)程中GFP的熒光值卻呈現(xiàn)不一樣的變化,但基本趨勢(shì)是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),實(shí)時(shí)熒光量不斷增加,這是由于GFP蛋白與細(xì)胞的衰竭速率不一致造成的。

2.3 N-乙酰神經(jīng)氨酸的表達(dá)研究

利用Neu5Ac合成途經(jīng)的重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,所用的培養(yǎng)基以甘油為碳源,這是由于前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,在類似的培養(yǎng)基中,以甘油為碳源可以產(chǎn)生較高的N-乙酰神經(jīng)氨酸。如圖4(a)所示,N-乙酰神經(jīng)氨酸的表達(dá)量,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增大,在36 h左右達(dá)到最大值,濃度為0.226 g/L。利用微生物發(fā)酵法,重組大腸桿菌Neu5Ac的產(chǎn)量在高密度發(fā)酵時(shí)可以達(dá)到7.85 g/L[16],而在枯草芽孢桿菌重組菌的高密度發(fā)酵中,Neu5Ac的產(chǎn)量的提高也不多(數(shù)據(jù)未顯示),因此推測(cè)枯草芽孢桿菌存在可能的Neu5Ac分解代謝途徑,未來(lái)將從分析枯草芽孢桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控方面著手,通過(guò)Neu5Ac分解旁路途徑的敲除來(lái)提高Neu5Ac的發(fā)酵產(chǎn)量。此外,如圖4(b)所示,在1.0%甘油為碳源的培養(yǎng)基中,重組168菌株的細(xì)胞量出現(xiàn)增長(zhǎng)緩慢的現(xiàn)象,發(fā)酵液的最高OD600低于1.2,推測(cè)可能是由于Pholin啟動(dòng)子的高轉(zhuǎn)錄水平給宿主細(xì)胞帶來(lái)尚不知原因的代謝負(fù)擔(dān),而當(dāng)培養(yǎng)基中的碳源更換成1.0%葡萄糖時(shí),菌株的最高OD600可以提高到3～4之間,但是還是沒(méi)法達(dá)到如圖3(b)所示的164重組菌株的細(xì)胞量。而且,將主要碳源更換成葡萄糖,或者以164為宿主細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵,這兩種措施均可以提高細(xì)胞的生物發(fā)酵量,但是Neu5Ac的合成量卻更低(數(shù)據(jù)未顯示),提示neuBC轉(zhuǎn)錄水平的高低可能不是影響Neu5Ac合成量的關(guān)鍵因素。因此,有必要在未來(lái)把Pholin啟動(dòng)子構(gòu)建到其它外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)中,通過(guò)與已知高效生產(chǎn)菌株的比較及分析,以進(jìn)一步提升該啟動(dòng)子在芽孢桿菌菌株設(shè)計(jì)及優(yōu)化中的應(yīng)用前景。

圖4 枯草芽孢桿菌168菌株發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量和生物量積累Fig.4 The yield of Neu5Ac by recombinant Bacillus subtilis 168 and its growth curve in shaking flasks

3 結(jié)論

以開(kāi)發(fā)更高效食品工業(yè)酶的枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)為目的,以來(lái)自噬菌體的Pholin為目標(biāo),運(yùn)用序列優(yōu)化、基因合成的方式進(jìn)行分子改造,并以GFP為報(bào)告蛋白,證明從前噬菌體分離出的Pholin啟動(dòng)子具有很強(qiáng)的啟動(dòng)效應(yīng);還構(gòu)建了N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成途徑,通過(guò)neuBC的表達(dá),使枯草芽孢桿菌得以合成Neu5Ac,其在搖瓶發(fā)酵中產(chǎn)量達(dá)到了0.226 g/L。同時(shí)研究中還發(fā)現(xiàn),neuBC的強(qiáng)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞的高密度生長(zhǎng)受限,提示組成型強(qiáng)表達(dá)的neuBC可能不是提高Neu5Ac產(chǎn)量的關(guān)鍵因素,因此后續(xù)研究中將對(duì)Pholin進(jìn)行進(jìn)一步改造,加入具有IPTG誘導(dǎo)效應(yīng)的調(diào)控序列使其成為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[17],同時(shí)開(kāi)展Neu5Ac重組生產(chǎn)菌株的高密度發(fā)酵研究,以大幅提高Neu5Ac的表達(dá)水平。

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ConstructionofN-acetylneuraminicacidsynthesispathwayinBacillussubtilis

LISi-jie1,2,3,JIMing-hua1,ZHAOLi-chao1,4,SHIJi-ping1,3,SUNJun-song1,3,*

(1.Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China; 3.ShanghaiTech University,Shanghai 201210,China; 4.Shanghai University,Shanghai 200444,China)

Synthesis of N-acetylneuraminic acid usingBacillussubtilisis favorable due to high expression level and the fact thatB.subtilismeets the strict safety criteria for application in food industry. In this study,a recombinantBacillussubtiliswas constructed and used for fermentation studie in N-acetylneuraminic acid production. First,a unique promoter Pholinoriginated fromB.subtilislysogen was optimized for heterologous transcription,which level was evaluated by comparison study together with other promoters routinely used inBacillus. The results showed that GFP fluorescence level from recombinant strain containing plasmid pMK4-Pholin-GFP was 2.62 times of that obtained by promoter P43. The acetylneuraminic acid expression cassetteneuBCwas then inserted behind Pholinin pMK4 to construct pMK4-Pholin-neuBC,which was transformed intoB.subtilis168. The recombinantB.subtiliswas able to produce up to 0.226 g/L N-acetylneuraminic acid in fermentation study using shaking flasks,which laid a solid basis for further strain optimization and industrial production of N-acetylneuraminic acid.

promoter;N-acetylneuraminic acid;Bacillussubtilis

2017-02-13

李思杰(1988-)，男，碩士研究生，研究方向：酶工程與生物化工，E-mail：lixuan7707@sina.com。

*通訊作者:孫俊松(1974-)男，博士，研究員，研究方向：酶工程與生物化工，E-mail：sunjs@sari.ac.cn。

上海市科委長(zhǎng)三角技術(shù)聯(lián)合攻關(guān)領(lǐng)域項(xiàng)目(15295810600)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)16-0131-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.025