雙菌株聯(lián)合固態(tài)發(fā)酵冷榨核桃粕提高產(chǎn)品納豆激酶活性的研究

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(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

雙菌株聯(lián)合固態(tài)發(fā)酵冷榨核桃粕提高產(chǎn)品納豆激酶活性的研究

王瑞珍,蔡天嬌,徐亞飛,任璐,雷宏杰*,徐懷德*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

為提高納豆芽孢桿菌單菌發(fā)酵品的納豆激酶(nattokinase,NK)活性并減少產(chǎn)品的不良氨味,采用戴爾凱氏有孢圓酵母、植物乳桿菌分別與納豆芽孢桿菌聯(lián)合固態(tài)發(fā)酵核桃粕。結(jié)果表明:納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母在接種量3%、菌種配比2∶1、發(fā)酵溫度34 ℃、發(fā)酵時(shí)間60 h的條件下得到的核桃粕發(fā)酵品NK活性達(dá)2040.82 U/g,提高了70.42%,揮發(fā)性鹽基氮含量為64.18 mg/100 g,降低了84.37%;納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌在接種量9%、菌種配比1.5∶1、發(fā)酵溫度42 ℃、發(fā)酵時(shí)間60 h的條件下得到的發(fā)酵品NK活性為1966.02 U/g,提高了64.18%,揮發(fā)性鹽基氮含量為62.68 mg/100 g,降低了84.74%?；旌暇N發(fā)酵品的氨味顯著減少,改善了傳統(tǒng)發(fā)酵品的風(fēng)味。

核桃粕,納豆芽孢桿菌,戴爾凱氏有孢圓酵母,植物乳桿菌,固態(tài)發(fā)酵,納豆激酶

核桃(JuglansregiaL.)屬胡桃科(Juglandaceae)核桃屬(JuglansL.)植物。我國是世界第一大核桃生產(chǎn)國[1],栽培面積8000多萬畝,產(chǎn)量達(dá)300多萬噸[2]。核桃仁營養(yǎng)豐富,脂肪含量高達(dá)60%以上[3],蛋白質(zhì)含量約為14%～18%,氨基酸種類齊全[4];冷榨核桃油的核桃粕蛋白達(dá)30%～40%[5],殘油12%～14%[6],水分5%～7%,是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源,適用于加工各種食品和保健品。

納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilsnatto)是食品用益生菌[7-8],發(fā)酵過程中可產(chǎn)生納豆激酶(nattokinase,NK)、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多種酶系[9]。納豆激酶具有纖溶活性強(qiáng)、可口服、副作用小、作用時(shí)間長[10]等特點(diǎn),成為較為理想的保健及抗血栓藥物[11]。以大豆、豆粕、菜籽粕或馬鈴薯渣為原料的有關(guān)納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)NK的研究已有報(bào)道[12-15],牛麗亞等[16]采用嗜酸乳桿菌和納豆芽孢桿菌聯(lián)合發(fā)酵豆粕,提高了豆粕營養(yǎng)價(jià)值，使蛋白酶活力達(dá)2240.9 U/g。劉麗莉[17]用蠟樣芽胞桿菌、植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵牛骨粉,蛋白酶的活力提高,膠原多肽的質(zhì)量濃度達(dá)3.62 mg/mL。孫軍德等[18]采用沼澤紅假單胞菌和納豆芽孢桿菌混合固態(tài)發(fā)酵淀粉豆,NK活性提高53.74%的同時(shí)氨味明顯降低。王常蘇等[19]用納豆芽孢桿菌與毛霉混合固態(tài)發(fā)酵黃豆,NK活性提高88.11%,并改善了納豆的口感。核桃粕成本低、安全,也可以發(fā)酵生產(chǎn)富含納豆激酶產(chǎn)品,高瑞雄等[20]用納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵冷榨核桃粕,NK活性達(dá)到1522 U/g,發(fā)酵品有氨味,可以采用混合菌種發(fā)酵核桃粕進(jìn)一步提高NK活性和產(chǎn)品品質(zhì),減少氨味,但相關(guān)研究未見報(bào)道。

為此,本論文以冷榨核桃粕為原料,采用戴爾凱氏有孢圓酵母、植物乳桿菌分別與納豆芽孢桿菌聯(lián)合固態(tài)發(fā)酵提高NK活性,為核桃粕的綜合利用和新產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

冷榨核桃粕 河北綠嶺莊園食品有限公司，粗蛋白31.70%,粗脂肪9.86%,水分7.63%;納豆芽孢桿菌(CICC 10023) 中國工業(yè)菌種保藏中心;白葡萄酒酵母RW、紅葡萄酒酵母SY 安琪酵母股份有限公司;保加利亞乳桿菌(Yo-Mix 300LYo 50 Dcu) 由CHR HANSEN公司提供;戴爾凱氏有孢圓酵母(WKZ1-2)、植物乳桿菌(20261)、嗜熱鏈球菌(1.1855) 本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;尿激酶(5000 U) 購于美國ADM公司;凝血酶(1000 U)、牛纖維蛋白原 購自Sigma公司;其他試劑 國產(chǎn)分析純。

YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;SPH-2102C立式雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SW-CJ-2D型(實(shí)用垂直新穎)雙人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2培養(yǎng)基

納豆芽孢桿菌的斜面、液體培養(yǎng)基 均為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[20]。

白葡萄酒酵母RW、紅葡萄酒酵母SY、戴爾凱氏有孢圓酵母的斜面培養(yǎng)基YPD:酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L,調(diào)pH 6.5,加20 g/L瓊脂得斜面培養(yǎng)基。

白葡萄酒酵母RW、紅葡萄酒酵母SY、戴爾凱氏有孢圓酵母的液體種子培養(yǎng)基YPD:酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L,調(diào)pH 6.5。

嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌的斜面、液體培養(yǎng)基均為MRS培養(yǎng)基[16]。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子液制備 分別配制液體培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基,將保藏的菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基,34 ℃培養(yǎng)24 h使菌種活化。取活化菌種兩環(huán)接入裝有25 mL液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中,置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)(34 ℃,150 r/min),本實(shí)驗(yàn)選取納豆芽孢桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌均培養(yǎng)12 h的種子液,戴爾凱氏有孢圓酵母、白葡萄酒酵母RW、紅葡萄酒酵母SY均培養(yǎng)16 h的種子液。

1.3.2 原料預(yù)處理 將冷榨核桃粕過20目篩網(wǎng)。分別稱取核桃粕10 g、氯化鈉0.15 g和葡萄糖0.1 g于100 mL錐形瓶中,加15 mL蒸餾水,調(diào)pH為7.0±0.2,于室溫下浸泡2 h,121 ℃高壓滅菌鍋濕熱滅菌20 min,冷卻后接入種子液,并于恒溫振蕩器中37 ℃恒溫發(fā)酵,轉(zhuǎn)速150 r/min。接種發(fā)酵48 h后,于4 ℃冰箱后熟24 h。

1.3.3 NK活性測定方法 采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法[20]。

1.3.4 揮發(fā)性鹽基氮含量測定 采用半微量定氮法,參照GB T5009.44-2003。

1.3.5 菌種優(yōu)化 在菌種比例1∶1,接種量9%,發(fā)酵溫度為37 ℃,發(fā)酵時(shí)間48 h的發(fā)酵條件下,對(duì)嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、戴爾凱氏有孢圓酵母、白葡萄酒酵母RW、紅葡萄酒酵母SY分別與納豆芽孢桿菌混合發(fā)酵,以NK活性為指標(biāo),優(yōu)選適合發(fā)酵的菌種。

1.3.6 單因素實(shí)驗(yàn) 選擇戴爾凱氏有孢圓酵母、植物乳桿菌分別與納豆芽孢桿菌混合發(fā)酵的方法,以NK活性為指標(biāo),分析接種量、菌種配比、葡萄糖添加量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵品中的NK活性影響。

接種量分別設(shè)定為3%、5%、7%、9%、11%的種子液,其中菌種配比(納豆芽孢桿菌:戴爾凱氏有孢圓酵母、納豆芽孢桿菌∶植物乳桿菌)為1.5∶1,葡萄糖添加量為0.5%,發(fā)酵溫度37 ℃,發(fā)酵時(shí)間48 h;

菌種配比(納豆芽孢桿菌:戴爾凱氏有孢圓酵母、納豆芽孢桿菌:植物乳桿菌)分別設(shè)定為1∶2、1∶1.5、1∶1、1.5∶1、2∶1,其中接種量為9%,葡萄糖添加量為0.5%,發(fā)酵溫度為37 ℃,發(fā)酵時(shí)間為48 h;

葡萄糖添加量分別設(shè)定為0%、0.5%、1.0%、1.5%、2%,其中接種量為9%,菌種配比為1∶1,發(fā)酵溫度為37 ℃,發(fā)酵時(shí)間為48 h;

發(fā)酵溫度分別設(shè)定為28、31、34、37、42 ℃,其中接種量為9%,菌種配比為1∶1,葡萄糖添加量為1%,發(fā)酵時(shí)間為48 h;

發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)定為12、24、36、48、60 h,其中接種量為9%,菌種配比為1∶1,葡萄糖添加量為1%,發(fā)酵溫度為37 ℃。

1.3.7 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以NK活性為指標(biāo),采用納豆芽孢桿菌分別與戴爾凱氏有孢圓酵母、植物乳桿菌混合發(fā)酵,固定葡萄糖添加量為1.0%。以接種量、菌種配比、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間為影響因素按L16(45)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),確定最優(yōu)發(fā)酵條件。納豆芽孢桿菌分別與戴爾凱氏有孢圓酵母、植物乳桿菌混合發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)的各因素水平分別見表1、表2。

表1 納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發(fā)酵正交設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design of fermentation by the mixed strains ofBacillus subtils natto and Torlaspora delbrueckii

表2 納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment of fermentation by the mixed strains ofBacillus subtils natto and Lactobacillus plantarum

1.4數(shù)據(jù)處理

利用Minitab 16.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析,并通過Tukey法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)間差異的顯著性(p<0.05),每個(gè)實(shí)驗(yàn)3次重復(fù),結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1不同乳酸菌與納豆芽孢桿菌混合發(fā)酵核桃粕對(duì)納豆激酶活性的影響

由圖1可以看出,不同菌種混合發(fā)酵對(duì)納豆激酶活性的影響存在顯著性差異。其中,納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發(fā)酵納豆激酶活性最高,酶活達(dá)1524.47 U/g。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇植物乳桿菌與納豆芽孢桿菌混合進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。

圖1 不同乳酸菌與納豆芽孢桿菌混合發(fā)酵對(duì)納豆激酶活性的影響Fig.1 Effect of fermentation by the mixed strains of different Lactic acid bacteria and Bacillus subtils natto on nattokinase activity注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。N-納豆芽孢桿菌,S-嗜熱鏈球菌,B-保加利亞乳桿菌,Z-植物乳桿菌。

2.2不同酵母菌與納豆芽孢桿菌混合發(fā)酵核桃粕對(duì)納豆激酶活性的影響

由圖2可知,納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發(fā)酵納豆激酶活性最高,活性為1386.54 U/g,故本實(shí)驗(yàn)選擇戴爾凱氏有孢圓酵母與納豆芽孢桿菌混合進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。

圖2 不同酵母菌與納豆芽孢桿菌混合發(fā)酵對(duì)納豆激酶活性的影響Fig.2 Effect of fermentation by the mixed strains of different Saccharomycetes and Bacillus subtils natto on nattokinase activity注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。N-納豆芽孢桿菌,SY-紅葡萄酒酵母,RW-白葡萄酒酵母,T-戴爾凱氏有孢圓酵母。

2.3固態(tài)發(fā)酵核桃粕產(chǎn)納豆激酶的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 接種量對(duì)納豆激酶活性的影響 由圖3可知,不同接種量對(duì)發(fā)酵品的NK活性產(chǎn)生不同的影響,NK活性隨接種量的增加呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發(fā)酵的接種量為5%的菌種種子液時(shí),NK活性達(dá)到最大值,為1733.00 U/g。當(dāng)納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發(fā)酵的接種量為7%的菌種種子液時(shí),NK活性達(dá)到最大值,為1755.84 U/g。當(dāng)接種量太小時(shí),隨著接種量的增加,納豆芽孢桿菌密度逐漸增加[21],產(chǎn)生的納豆激酶量也隨之增加。當(dāng)接種量太大時(shí),菌體細(xì)胞的生長繁殖消耗了過多的底物營養(yǎng)物質(zhì),產(chǎn)生大量的代謝廢物[22],加快菌體細(xì)胞衰老,導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低,NK活性下降。

圖3 接種量對(duì)納豆激酶活性的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on nattokinase activity

2.3.2 菌種配比對(duì)納豆激酶活性的影響 圖4顯示了菌種配比(納豆芽孢桿菌:戴爾凱氏有孢圓酵母、納豆芽孢桿菌:植物乳桿菌)對(duì)NK活性的影響。

圖4 菌種配比對(duì)納豆激酶活性的影響Fig.4 Effect of proportion of inoculums on nattokinase activity

結(jié)果表明,NK活性隨菌種比例的增加呈先升高后降低的趨勢,適宜的納豆芽孢桿菌和植物乳桿菌比例范圍(1∶1.5～1.5∶1)對(duì)NK的合成具有促進(jìn)作用。當(dāng)納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母的比例為1∶1時(shí),NK活性達(dá)到最大值,約為1725.76 U/g。當(dāng)納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌的比例為1∶1時(shí),是適合NK合成的最佳接種比例,NK活性達(dá)到最大值,約為1745.71 U/g。菌種比例太大太小都不利于NK活性的提高,過多接種納豆芽孢桿菌或植物乳桿菌及戴爾凱氏有孢圓酵母可能會(huì)使得菌種間協(xié)同作用不但不能發(fā)揮,反而由于兩菌種對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的競爭[23],抑制了NK的生成。

2.3.3 葡萄糖添加量對(duì)納豆激酶活性的影響 結(jié)果表明,葡萄糖添加量為1.0%時(shí),戴爾凱氏有孢圓酵母、植物乳桿菌分別與納豆芽孢桿菌混合發(fā)酵,NK活性均達(dá)到最大值,分別為1689.35、1678.22 U/g。葡萄糖過高過低都不利于NK活性的提高。葡萄糖是單糖,微生物易利用,無水解等過程,是一種速效碳源[22],可以在發(fā)酵過程中提供大量碳源,以維持其持續(xù)增長,NK活性提高。而葡萄糖添加量過多,發(fā)酵基質(zhì)中碳氮比例增大,對(duì)菌種繁殖不利[23],從而導(dǎo)致NK活力下降。當(dāng)葡萄糖添加量分別為0.5%、1.0%和1.5%時(shí),NK活性之間均無顯著性差異(p>0.05)。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇1.0%的葡萄糖添加量。

圖5 葡萄糖添加量對(duì)納豆激酶活性的影響Fig.5 Effect of glucose content on nattokinase activity

2.3.4 發(fā)酵溫度對(duì)納豆激酶活性的影響 結(jié)果表明,NK活性隨發(fā)酵溫度的升高呈先升高后降低的趨勢。納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發(fā)酵在發(fā)酵溫度為34 ℃的條件下,NK活性達(dá)到最大值,約為1721.72 U/g,表明納豆芽孢桿菌在該溫度條件下能較好的生長繁殖,且其代謝產(chǎn)生的NK具有較高的活性。而納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發(fā)酵在發(fā)酵溫度為37 ℃的條件下,NK活性達(dá)到最大值,約1721.66 U/g。溫度過低時(shí),微生物的生長速率慢,代謝產(chǎn)物生成的速度降低[24],導(dǎo)致NK活性低;但溫度過高時(shí),會(huì)引起微生物菌體的過早衰老死亡及NK耐熱性差[25],從而使NK活性下降。

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)納豆激酶活性的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on nattokinase activity

2.3.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆激酶活性的影響 由圖7可知,NK活力隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發(fā)酵在發(fā)酵時(shí)間為48 h的條件下,NK活性達(dá)到最大值,約為1716.15 U/g。當(dāng)納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發(fā)酵在發(fā)酵時(shí)間為48 h的條件下,NK活性達(dá)到最大值,約為1702.72 U/g。在48 h之前,菌種隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而迅速生長繁殖,產(chǎn)生并積累NK,使得酶活性增加。在48 h之后,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,菌種進(jìn)入衰亡期,NK活性降低,這是由于菌種代謝或核桃粕內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生酶抑制性物質(zhì),或是NK進(jìn)一步轉(zhuǎn)化或降解為其他物質(zhì),還可能是由于發(fā)酵時(shí)間過長而導(dǎo)致有害產(chǎn)物的積累[26],從而使得NK活性降低。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆激酶活性的影響Fig.7 Effect of fermentation time on nattokinase activity

2.4正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.4.1 納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以NK活性為指標(biāo)做正交分析,納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發(fā)酵核桃粕的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可以看出,對(duì)于納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發(fā)酵,NK活力最高是1927.48 U/g。四因素對(duì)NK活性的影響主次順序?yàn)?C發(fā)酵溫度>A接種量>D發(fā)酵時(shí)間>B菌種配比,即發(fā)酵溫度對(duì)NK活性影響最大,為決定性因素,其次為接種量、發(fā)酵時(shí)間,而菌種配比的影響最小。

表3 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 3 Experimental design and results for orthogonal analysis

納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發(fā)酵的理論最優(yōu)組合為A1B4C3D4,即接種量3%,菌種配比為2∶1,34 ℃下發(fā)酵60 h,進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測得NK活性為2040.82 U/g,與正交實(shí)驗(yàn)中NK活性(最高為1927.48 U/g)相比有所提高,提高了5.88%。

納豆芽孢桿菌單菌發(fā)酵核桃粕,NK活性為1197.51U/g,揮發(fā)性鹽基氮含量為410.72 mg/100 g。相比于納豆芽孢桿菌單菌發(fā)酵品,戴爾凱氏有孢圓酵母與納豆芽孢桿菌混合發(fā)酵產(chǎn)品NK活性顯著提高(p<0.01),提高了70.42%,揮發(fā)性鹽基氮含量為64.18 mg/100 g,降低了84.37%。戴爾凱氏有孢圓酵母與納豆芽孢桿菌混合發(fā)酵效果優(yōu)良。孫軍德[18]采用納豆芽孢桿菌與沼澤假單胞菌混合發(fā)酵,揮發(fā)性鹽基氮含量降低了79.81%,王帆等[27]用乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌混合發(fā)酵魚肉香腸,揮發(fā)性鹽基氮含量降低了80.91%,氨味明顯減輕。其原因是戴爾凱氏有孢圓酵母在發(fā)酵過程中與納豆芽孢桿菌競爭營養(yǎng)物質(zhì),減弱了核桃粕中蛋白質(zhì)的分解速度[14],因而減少揮發(fā)性鹽基氮的生成;戴爾凱氏有孢圓酵母在發(fā)酵過程中分解培養(yǎng)基中的糖類,產(chǎn)生醇香味[28],戴爾凱氏有孢圓酵母與納豆芽孢桿菌混合發(fā)酵品氨味減少,提高適口性。

2.4.2 納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以NK活性為指標(biāo)做正交分析,納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發(fā)酵核桃粕的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis for orthogonal experiment

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,對(duì)于納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發(fā)酵,NK活性最高是1871.83 U/g。四因素對(duì)NK活性的影響主次順序?yàn)?C發(fā)酵溫度>D發(fā)酵時(shí)間>A接種量>B菌種比例。即發(fā)酵溫度對(duì)NK活性影響最大,為決定性因素,其次為發(fā)酵時(shí)間、接種量,而菌種配比的影響最小。

納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發(fā)酵的理論最優(yōu)組合為A4B3C4D4,即接種量9%,菌種配比為1.5∶1,42 ℃下發(fā)酵60 h,進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測得NK活性為1966.02 U/g,高于其他16組,所得到的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果合理。

相比于NK活性和揮發(fā)性鹽基氮含量分別為1197.51U/g、410.72 mg/100 g的納豆芽孢桿菌單菌發(fā)酵品,納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合發(fā)酵產(chǎn)品的NK活性顯著提高(p<0.01),提高了64.18%,揮發(fā)性鹽基氮含量為62.68 mg/100 g,降低了84.74%,顯著減輕了產(chǎn)品的氨味。植物乳桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸與氨及胺類等堿性物質(zhì)發(fā)生中和反應(yīng),降低了揮發(fā)性鹽基氮的含量[29]。此外,植物乳桿菌可降解精氨酸、組氨酸、天門冬氨酸等產(chǎn)生雜醇和在發(fā)酵過程中產(chǎn)生有機(jī)酸,兩者又可進(jìn)行酯化反應(yīng)縮水生成酯類物質(zhì)[29],對(duì)產(chǎn)品的整體香氣起到柔和作用?；旌暇N發(fā)酵氨味減少,改善了傳統(tǒng)發(fā)酵品的風(fēng)味。

3 結(jié)論

單因素和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合菌種發(fā)酵冷榨核桃粕的最佳條件為:接種量3%,菌種配比2∶1,發(fā)酵時(shí)間60 h,發(fā)酵溫度34 ℃。而納豆芽孢桿菌與植物乳桿菌混合菌種發(fā)酵冷榨核桃粕的最優(yōu)條件為:接種量9%、菌種比例為1.5∶1、發(fā)酵溫度42 ℃、發(fā)酵時(shí)間60 h。與納豆芽孢桿菌單菌發(fā)酵品相比,混合菌種發(fā)酵均可顯著提高NK活性(p<0.01),降低揮發(fā)性鹽基氮含量(p<0.01),從而有效減輕發(fā)酵品的不良氨味。因此,本研究為混合菌種發(fā)酵提高核桃粕發(fā)酵品的品質(zhì)提供了理論依據(jù)和方法指導(dǎo)。

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Studyofimprovingnattokinaseactivitythroughsolid-statefermentationofcold-pressingwalnutdregsbycompoundstrains

WANGRui-zhen,CAITian-jiao,XUYa-fei,RENLu,LEIHong-jie*,XUHuai-de*

(College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China)

To improve nattokinase(NK)activity of fermentation products byBacillussubtilsnattoand reduce the ammonia smell,solid-state fermentation of walnut dregs by the mixed strains ofBacillussubtilsnattoandTorlasporadelbrueckii(BacillussubtilsnattoandLactobacillusplantarum)was investigated. Results showed that the optimum technological parameters of fermentation by the mixed strains ofBacillussubtilsnattoandTorlasporadelbrueckiiwere as follows:inoculation amount of 3%,proportion of inoculums of 2∶1,fermentation temperature of 34 ℃,fermentation time of 60 h. In this fermentation conditions,the NK activity was 2040.82 U/g,increasing by 70.42%. The content of volatile base nitrogen was 64.18 mg/100 g,decreasing by 84.37%. In addition,the optimum technological parameters of fermentation by the mixed strains ofBacillussubtilsnattoandLactobacillusplantarumwere as follows:inoculation amount of 9%,proportion of inoculums of 1.5∶1,fermentation temperature of 42 ℃,fermentation time of 60 h. In these fermentation conditions,the NK activity was 1966.02 U/g,increasing by 64.18%. The content of volatile base nitrogen was 62.68 mg/100 g,decreasing by 84.74%. The mixed strains fermentation could decrease the ammonia smells significantly,improve the flavor of traditional fermentation products.

walnut dregs;Bacillussubtilsnatto;Torlasporadelbrueckii;Lactobacillusplantarum;solid-state fermentation;nattokinase

2017-01-05

王瑞珍(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：果蔬貯藏與加工,E-mail:wrz1003420723@sina.com。

*通訊作者:雷宏杰(1984-)，男，博士，講師，研究方向：果蔬加工與食品生物技術(shù)，E-mail：leihongjie000@163.com。 徐懷德(1964-)，男，大學(xué)本科，教授，研究方向：果品蔬菜貯藏與加工和天然產(chǎn)物提取，E-mail:xuhuaide@aliyun.com。

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2016KTCQ02-22)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)16-0112-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.022