魷魚蛋白抗氧化肽的穩(wěn)定性及抗疲勞和抗癌活性

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(嶺南師范學院化學化工學院,廣東高校新材料工程技術開發(fā)中心,廣東湛江 524048)

魷魚蛋白抗氧化肽的穩(wěn)定性及抗疲勞和抗癌活性

胡小軍,江敏*,王標詩,余炳生,苗碗根,馮凌凌

(嶺南師范學院化學化工學院,廣東高校新材料工程技術開發(fā)中心,廣東湛江 524048)

以魷魚抗氧化肽清除DPPH自由基和羥自由基的活性變化為指標,研究了溫度、pH、金屬離子、防腐劑和食品配料對魷魚抗氧化肽的抗氧化穩(wěn)定性的影響,同時對魷魚抗氧化肽的抗疲勞和抗癌活性進行了初步研究。實驗結果表明:魷魚抗氧化肽具有較強的耐熱性,加熱到100 ℃,仍能保持94%以上的活性;在酸性環(huán)境中活性保持較好,在堿性條件下活性喪失較快;蔗糖、NaCl對魷魚抗氧化肽的穩(wěn)定性影響不明顯,而葡萄糖和苯甲酸鈉會明顯降低魷魚抗氧化肽活性(p<0.05);Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+金屬離子對魷魚抗氧化肽穩(wěn)定性均有不同程度的影響,影響順序為:Cu2+>Zn2+>Mg2+>Ca2+。魷魚抗氧化肽有較好的抗疲勞活性,與空白相比,抗氧化肽可以延長小鼠力竭游泳時間達到23%～36%。魷魚抗氧化肽對胃癌細胞SGC-7901的增殖有明顯的抑制作用,半數(shù)抑制率EC50為21.10 mg/mL。所以魷魚抗氧化肽是一種具有抗疲勞和抗癌活性且性質相對穩(wěn)定的活性肽。

魷魚,抗氧化肽,穩(wěn)定性,抗疲勞,抗癌

抗氧化肽是最重要的生物活性肽之一,也是目前研究最為廣泛的生物活性肽,尤其是利用海洋水產(chǎn)資源開發(fā)抗氧化肽[1-2]。目前國內外學者利用酶解技術和發(fā)酵技術從不同的蛋白質來源制備具有抗氧化活性的多肽,同時研究其工藝優(yōu)化、分離純化和活性功能[3-5],而對抗氧化肽的穩(wěn)定性的研究相對較少?？寡趸脑趹眠^程中因加工貯藏條件的影響,可能會發(fā)生水解、氧化、降解等反應,從而導致活性變化[6-8]。因此,研究其活性穩(wěn)定性對于制定科學的生產(chǎn)工藝、應用和貯藏方法具有重要的指導意義。目前有關抗癌和抗疲勞的活性肽的開發(fā)也是熱點,主要集中于大豆抗疲勞和抗癌活性肽[9-10],未見魷魚抗疲勞和抗癌活性肽的研究報道。本實驗室前期通過可控酶解技術對魷魚肉進行酶解,通過響應面優(yōu)化工藝得到了有較強抗氧化能力的多肽混合物[11],并對多肽進行抗氧化活性研究。本文進一步研究溫度、pH、金屬離子、防腐劑、食品配料對魷魚抗氧化肽清除DPPH·和OH·活性的影響,同時對魷魚抗氧化肽的抗疲勞和抗癌活性進行了初步研究,以期為魷魚抗氧化肽作為功能性食品配料的生產(chǎn)和應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

市售新鮮魷魚 洗凈、去掉頭和內臟后,用絞碎機絞成肉糜,置于-18 ℃冰箱中冷藏,備用;小鼠 體重18～20 g,雄性,廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供,實驗動物許可證號:SCXK(粵)2008-0002;胃癌細胞系SGC-7901細胞 武漢博士得試劑公司;RPMI 1640培養(yǎng)液 上海索萊寶生物科技有限公司;木瓜蛋白酶 6000 U/mg,國藥集團化學試劑有限公司;DPPH 購于Sigma公司;鄰二氮菲、磷酸鹽、EDTA、FeSO4、H2O2、無水乙醇 均為國產(chǎn)分析純。

Cintra10紫外可見分光光度計 澳大利亞GBC公司;centrifuge5810R冷凍離心機 德國Eppendorf(艾本德)公司;MP1100B電子天平 上海濟成分析儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;Scientz-N真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;CO2培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司;酶聯(lián)免疫檢測儀 美國BIO-RAD公司。

1.2實驗方法

1.2.1 魷魚抗氧化肽制備工藝流程 魷魚肉→絞成肉糜→冷凍備用→解凍→加入木瓜蛋白酶→在蛋白酶的最適條件下進行酶解(pH5.8,加酶量為0.07 g/10 g魷魚,溫度為55 ℃,酶解時間6 h)→將酶解液在沸水浴中滅酶15 min→冷卻→離心(4800 r/min,20 min)→上清液→濾膜過濾(0.45 μm)→透析處理(3500 u)→透過液→濃縮→冷凍干燥→魷魚抗氧化肽[11]。

1.2.2 魷魚抗氧化肽清除DPPH·活性測定 采用Zhu等的方法[12],分別取2 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液置于6支試管中,分別加入0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL抗氧化肽溶液,使?jié)舛确謩e達到5、10、15、20、25、30 mg/mL,同時補充蒸餾水至4 mL,室溫放置30 min后,在517 nm處測定其吸光度值(Ai),以2 mL 95%乙醇加入2 mL蒸餾水調零,對照為2 mL DPPH·溶液加上2 mL 95%乙醇在517 nm測定吸光度值(Ac),不同濃度的抗氧化肽溶液和2 mL 95%乙醇混合后在517 nm測定吸光度值(Aj)。抗氧化肽對DPPH·的清除率用抑制率(R)計算公式為:

R(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式(1)

1.2.3 魷魚抗氧化肽清除OH·活性測定 采用鄰二氮菲法測定抗氧化肽清除羥自由基活性[13]。測定方法如下:取6支試管,分別加入0.6 mL鄰二氮菲溶液(5 mmol/L)加入0.4 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH7.4)混勻后,分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL抗氧化肽溶液(濃度達到5、10、15、20、25、30 mg/mL)及0.6 mL EDTA(15 mmol/L),再次混勻后加入0.6 mL FeSO4溶液(5 mmol/L),以去離子水補至體積2.8 mL,充分混勻后加入0.8 mL H2O2(0.1%),搖勻后于37 ℃保溫1 h,在536 nm處測吸光度值A樣品。以去離子水代替樣品,其余步驟同樣品管,測得吸光度值為A損傷。以去離子水代替H2O2,其余步驟同損傷管,所測得吸光度值為A未損傷。按照下式計算OH·清除率:

清除率(%)=(A樣品-A損傷)÷(A未損傷-A損傷)×100

式(2)

1.3各因素對魷魚抗氧化肽抗氧化活性的影響

1.3.1 溫度對魷魚抗氧化肽的抗氧化活性的影響 將魷魚抗氧化肽(10 mg/mL)分別在20、40、60、80、100 ℃水浴中保溫1 h后,快速冷卻至室溫,測其清除DPPH·和·OH的活性保持率。

1.3.2 pH對魷魚抗氧化肽的抗氧化活性的影響 將魷魚抗氧化肽(10 mg/mL)的pH分別調至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,在室溫下放置1 h,然后將各溶液的pH調至7.0,測其清除·OH與DPPH·的活性保持率。

1.3.3 金屬離子對魷魚抗氧化肽的抗氧化活性的影響 分別在魷魚抗氧化肽(10 mg/mL)中添加1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+金屬離子溶液,靜置2 h后,測其清除·OH與DPPH·的活性保持率。

1.3.4 防腐劑苯甲酸鈉對魷魚抗氧化肽的抗氧化活性的影響 在魷魚抗氧化肽(10 mg/mL)中分別添加質量分數(shù)為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.010%的苯甲酸鈉溶液,測其清除·OH與DPPH·的活性保持率。

1.3.5 食品配料對魷魚抗氧化肽的抗氧化活性的影響 在魷魚抗氧化肽(10 mg/mL)中分別添加質量分數(shù)為1%、3%、5%、7%、9%的蔗糖、葡萄糖或質量分數(shù)為1%、2%、3%、4%、5%的氯化鈉,在100 ℃的條件下放置20 mim后,測其清除·OH與DPPH·的活性保持率。

1.4魷魚抗氧化肽對小鼠抗疲勞的研究

采用小鼠力竭游泳時間來評價魷魚抗氧化肽對小鼠抗疲勞活性[14]。取60只體重在18～20 g雄性小鼠,采用國家標準飼養(yǎng)一周,隨后將小鼠分為3組,空白組、魷魚抗氧化肽高劑量組(SAP-H)和魷魚抗氧化肽低劑量組(SAP-L),每組20只小鼠。在四周實驗過程中,SAP-H組的小鼠灌胃10 mg/g·d的魷魚抗氧化肽,SAP-L組的小鼠灌胃2 mg/g·d的魷魚抗氧化肽,而空白組則灌胃蒸餾水。灌胃后小鼠休息30 min,然后進行游泳實驗,第一周游泳時間為20 min,以后逐周增加5 min。在末次給藥第一組空白、SAP-H和SAP-L之后,小鼠休息30 min,然后在小游泳池中進行力竭游泳時間的測定,泳池大小為50 cm×50 cm×40 cm,水深30 cm,水溫25 ℃。不斷攪動水池中的水,保證小鼠不停的游動。當小鼠頭部沉入水中7 s仍不能正常地把頭伸出水面,則認為小鼠進入力竭狀態(tài),記錄從開始游泳到力竭狀態(tài)的時間,該時間為力竭游泳時間。

1.5魷魚抗氧化肽的抗癌活性

采用體外對胃癌細胞SGC-7901抑制增殖作用來評價魷魚抗氧化肽的抗癌活性。參考葛錫娟等的方法[15-16],略加修改。SGC-7901胃癌細胞首先經(jīng)過用RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞,待細胞成熟后,把細胞處理成單細胞懸液,以每孔1×105個/mL細胞濃度接種于96孔板上,每孔加0.1 mL,然后在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2及飽和濕度條件下,培養(yǎng)24 h。然后加入濃度分別為0、5、10、15、20、25、30、35、40 mg/mL魷魚抗氧化肽,空白實驗以溶解抗氧化肽的去離子水代替,同時設置5個平行孔。魷魚抗氧化肽添加完畢繼續(xù)孵育48 h后,每孔加入5 mg/mL MTT(噻唑藍)溶液20 μL,37 ℃繼續(xù)孵育4 h,小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液,控干后每孔加入150 μL DMSO(二甲基亞颯),輕輕振蕩15 min,使藍紫色甲瓉結晶物充分溶解。選擇波長490 nm,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光密度值(OD490),記錄結果。計算抗氧化肽對癌細胞生長的增殖率和EC50值,同一實驗重復三次,取平均值。增殖率計算公式如下:

增殖率(%)=(OD加樣-OD空白)÷(OD對照-OD空白)×100

式(3)

1.6數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復3次以上,采用Excel和SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1溫度對魷魚抗氧化肽的抗氧化活性的影響

由圖1可見,魷魚抗氧化肽在20～100 ℃范圍內,抗氧化活性變化不顯著(p>0.05),即使在100 ℃處理0.5 h,其清除DPPH·和·OH的活性保持率仍在94%以上,說明魷魚抗氧化肽的熱穩(wěn)定性較強,在熱加工過程中,活性保持較好。

圖1 溫度對魷魚抗氧化肽抗氧化活性的影響Fig.1 The influence of temperature on the antioxidant activity of squid antioxidant peptide

2.2 pH對魷魚抗氧化肽的抗氧化活性的影響

從圖2可以看出,當pH<7時,魷魚抗氧化肽的抗氧化活性保持較好,其活性保持率都在90%以上;當pH>7時,隨著pH升高,其清除·OH和DPPH·的活性保持率都顯著下降(p<0.05)。魷魚抗氧化肽耐酸不耐堿,可能是因為在堿性條件下抗氧化肽提供的產(chǎn)生清除自由基效果的氫供體上的氫被消耗了,從而導致活性的降低[17]。

圖2 pH對魷魚抗氧化肽抗氧化活性的影響Fig.2 The influence of pH values on the antioxidant activity of squid antioxidant peptide

2.3金屬離子對魷魚抗氧化肽的抗氧化活性的影響

圖3 不同金屬離子對魷魚抗氧化肽抗氧化活性的影響 Fig.3 The influence of metal ions on the antioxidantactivity of squid antioxidant peptide注:A:清除·OH自由基活性穩(wěn)定性;B:清除 DPPH·自由基活性穩(wěn)定性。

不同金屬離子對魷魚抗氧化肽的抗氧化活性的影響見圖3所示,在一定的濃度范圍內,隨著離子濃度的升高,魷魚抗氧化肽的抗氧化活性均有不同程度的降低。隨著Cu2+濃度的增加,魷魚多肽的抗氧化活性顯著降低(p<0.05),當達到5.0 mmol/L時,其清除·OH和DPPH·的活性保持率只有39.25%和23.58%,Zn2+也與之類似。而Ca2+、Mg2+隨著離子濃度的升高,其抗氧化活性雖然也有下降,但是下降并不顯著(p>0.05)。Cu2+和Zn2+對抗氧化化活性影響較大,主要原因可能是Cu2+和Zn2+與抗氧化多肽通過共價鍵和離子鍵形成配合物的緣故[18]。所以魷魚抗氧化肽在加工和貯藏過程中應盡量避免與銅制或者鋅制容器接觸,盡量不要直接與富含Cu2+和Zn2+的原料混合加工。

2.4防腐劑苯甲酸鈉對魷魚抗氧化肽的抗氧化活性的影響

由圖4可以看出,在一定濃度范圍內,隨著苯甲酸鈉濃度的升高,魷魚抗氧化肽的自由基清除活性保持率變化不顯著(p>0.05),這表明苯甲酸鈉對魷魚抗氧化肽的穩(wěn)定性影響不大。與胡曉等[19]的研究結果一致。

圖4 苯甲酸鈉對魷魚抗氧化肽抗氧化活性的影晌Fig.4 The influence of sodium benzoate on the antioxidant activity of squid antioxidant peptide

2.5食品配料對魷魚抗氧化肽的抗氧化活性的影響

從圖5可以看出,隨著糖類濃度的增加,魷魚抗氧化肽的抗氧化活性均有所提高,且葡萄糖對魷魚抗氧化肽的抗氧化活性影響大于蔗糖,可能是因為抗氧化肽與糖類在加熱條件下發(fā)生了美拉德反應,生成的醛、酮等還原性物質在一定程度上增加了魷魚多肽的抗氧化活性[20]。而美拉德反應中,糖類的反應速度大小為:還原糖>非還原糖,單糖>雙糖,因此葡萄糖對魷魚多肽抗氧化活性的影響較大。從圖6可以看出,NaCl對魷魚抗氧化肽的抗氧化活性影響不顯著(p>0.05),當NaCl的添加量達到5.0%時,抗氧化肽清除DPPH·和·OH的活性損失率不到7%。說明NaCl對魷魚抗氧化肽穩(wěn)定性的影響并不顯著(p>0.05)。

圖5 糖類對魷魚抗氧化肽抗氧化活性的影晌Fig.5 The influence of saccharide on the antioxidant activity of squid antioxidant peptide注:A:清除·OH自由基活性穩(wěn)定性;B:清除DPPH·自由基活性穩(wěn)定性。

圖6 NaCl對魷魚抗氧化肽抗氧化活性的影晌Fig.6 The influence of NaCl on the antioxidant activity of squid antioxidant peptide

2.6魷魚抗氧化肽的抗疲勞活性

力竭游泳時間是評價抗運動疲勞的常用指標,從圖7可見,魷魚抗氧化肽高劑量組的小鼠力竭游泳的平均時間為245.4 min,而低劑量組的小鼠力竭游泳的平均時間為221.6 min,兩者并無顯著差異(p>0.05)。但是比空白組的游泳時間延長了23%～36%,差異顯著(p<0.01)。這說明了魷魚抗氧化肽具有延長小鼠力竭游泳時間的作用,具有一定的抗疲勞功效。

圖7 魷魚抗氧化對小鼠力竭游泳時間的影晌Fig.7 Effect of squid antioxidant peptide on the swimming time in mice

2.7魷魚抗氧化肽的抗癌活性

從圖8可以看出,魷魚抗氧化肽對胃癌細胞SGC-7901的增殖有明顯的抑制作用。隨著抗氧化肽濃度的增加,抑制癌細胞增殖的作用增強,當抗氧化肽濃度為40 mg/mL,細胞的增殖率僅為9.5%。通過擬合曲線計算得出,抗氧化肽抑制SGC-7901癌細胞增殖的EC50為21.10 mg/mL,與泥鰍多肽抑制HepG2 的EC5016.69 mg/mL比較接近[21]。所以魷魚抗氧化肽具有一定的抗癌活性。

圖8 魷魚抗氧化肽對SGC-7901癌細胞抑制增殖作用Fig.8 The anti-proliferation effect of squid antioxidant peptide on SGC-7901 cancer cells

3 結論

本文以DPPH·和·OH清除率為指標,研究了魷魚抗氧化肽在不同條件下抗氧化的穩(wěn)定性,結果表明:魷魚抗氧化肽熱穩(wěn)定性較好,100 ℃處理0.5 h抗氧化活性保持率在94%以上。魷魚抗氧化肽在酸性條件下活性保持率較好,在堿性條件下,抗氧化活性顯著下降(p<0.05)。防腐劑苯甲酸鈉對魷魚抗氧化肽活性影響不顯著(p>0.05)。糖類對魷魚抗氧化肽活性有所增加,順序為還原糖>非還原糖,單糖>雙糖。NaCl對魷魚抗氧化肽穩(wěn)定性的影響并不顯著(p>0.05)。Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+金屬離子對魷魚抗氧化肽穩(wěn)定性均有不同程度的影響,影響順序為Cu2+>Zn2+>Mg2+>Ca2+。通過抗疲勞和抗癌活性研究,魷魚抗氧化肽有較好的抗疲勞活性,與空白相比,抗氧化肽可以延長小鼠力竭游泳時間達到23%～36%,差異顯著(p<0.05)。魷魚抗氧化肽對胃癌細胞SGC-7901的增殖有明顯的抑制作用(p<0.05),半數(shù)抑制率EC50為21.10 mg/mL。魷魚抗氧化肽是一種具有抗疲勞和抗癌活性且性質相對穩(wěn)定的活性肽,在實際應用過程注意避免影響其活性的因素。

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Thestabilityofantioxidantpeptidesfromsquidandtheiranti-fatigueandanti-canceractivities

HUXiao-jun,JIANGMin*,WANGBiao-shi,YUBing-sheng,MIAOWan-gen,FENGLing-ling

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Lingnan Normal University,Development Center for New Materials Engineering & Technology in Universities of Guangdong,Zhanjiang 524048,China)

The change of scavenging activity on DPPH and hydroxyl free radicals of antioxidant peptides from squid was used as the index to study the effect of temperature,pH,different metal ions,preservatives and food ingredients on antioxidation stability of the peptides. At the same time,the anti-fatigue and anti-cancer activities of antioxidant peptides from squid were preliminarily studied. The results showed that antioxidant peptides from squid had strong heat-resistance,still maintaining more than 94% of the activity when heated to 100 ℃. The peptides maintained high activity under acidic conditions,but losed their activity under alkaline conditions. Surcrose and NaCl had little effects on their antioxidation stability,but glucose and sodium benzoate lowered the oxidation stability of antioxidant peptides from squid(p<0.05). Metal ions such as Ca2+,Mg2+,Zn2+and Cu2+affected the stability and the order was Cu2+>Zn2+>Mg2+>Ca2+. Antioxidant peptides from squid had better anti-fatigue activity. Compared with the blank,antioxidant peptides could prolong the exhaustive swimming time of mice to 23%～36%. Antioxidant peptides from squid had significant inhibition on proliferation of gastric cancer cell SGC-7901. The inhibition rate of EC50was 21.10 mg/mL. Therefore,the antioxidant peptides from squid were a kind of active peptide with anti-fatigue,anti-cancer activity and stable property.

squid;antioxidant peptide;stability;anti-fatigue;anti-cancer

2017-02-07

胡小軍(1977-),男,碩士,講師,研究方向:食品的深加工與功能成分制備,E-mail:yan2001j@126.com。

*通訊作者:江敏(1977-),女,碩士,實驗師,研究方向:食品加工技術與產(chǎn)品開發(fā),E-mail:jiangmin9715@163.com。

國家級星火計劃項目(2013GA780083);湛江市財政資金科技專項項目(2013C01029);2013年地方高校國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目(2010404139);嶺南師范學院熱帶與南海資源協(xié)同創(chuàng)新中心項目(CIL1503);嶺南師范學院自然科學研究項目(YL1404)。

TS254.1

:A

:1002-0306(2017)16-0060-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.012