氨甲酰化促紅細(xì)胞生成素對慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

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氨甲?；偌t細(xì)胞生成素對慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

黃兆琦1，伍金雷1，許衛(wèi)1，陳永權(quán)1，謝文杰1，陳晞明1，陳盛強(qiáng)2

目的觀察氨甲?；偌t細(xì)胞生成素(CEPO)對慢性心力衰竭(CHF)大鼠心功能、心肌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白活化表達(dá)的影響。方法將30只雄性成年SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組(n=10)、CEPO組(n=10)和對照(Control)組(n=10)，采用腹主動脈縮窄術(shù)制作慢性心力衰竭模型，術(shù)后第8周CEPO組開始經(jīng)腹腔注射50 μg/kg CEPO，3次/周，連續(xù)4周；Sham組、Control組同期經(jīng)腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。術(shù)后第8周、12周行心臟彩超檢測大鼠心功能。術(shù)后第12周末取大鼠心肌組織切片采用HE染色法觀察心肌組織細(xì)胞形態(tài)；采用原味缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測心肌細(xì)胞凋亡及計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)；采用Western blot印跡法檢測心肌活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與假手術(shù)組相比，建模大鼠術(shù)后第8周時(shí)出現(xiàn)心室肥厚及左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)減退；CEPO組干預(yù)4周后左室射血分?jǐn)?shù)較Control組明顯升高(P<0.05)，收縮末期室間隔厚度(IVSs)、收縮末期左心室后壁厚度(LVPWs)、舒張末期室間隔厚度(IVSd)、舒張末期左心室后壁厚度(LVPWd)明顯降低(P<0.05)。與Control組比較，CEPO組AI值顯著降低[(23.87±1.45)% vs(30.15±0.67)%，P<0.05]，cleaved Caspase-3表達(dá)水平(0.489 1±0.029 1)明顯減少(P<0.01)。結(jié)論CEPO可通過抑制凋亡關(guān)鍵酶Caspase-3的活化，顯著減少cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平，減少心肌細(xì)胞凋亡以改善心功能。

心力衰竭；氨甲?；偌t細(xì)胞生成素；心肌凋亡；活化型Caspase-3蛋白

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是一種復(fù)雜的臨床癥候群，發(fā)病率和病死率高，5年生存率與惡性腫瘤相仿，嚴(yán)重威脅著病人的生命[1]。終末期充血性心力衰竭病人心臟中長期的壓力負(fù)荷過重致使心肌細(xì)胞數(shù)目的減少及心肌組織纖維增生，是引起心肌舒縮功能障礙的主要原因之一。而有實(shí)驗(yàn)證明心肌細(xì)胞的減少主要是因?yàn)樾募〖?xì)胞凋亡所致[2]。有研究證實(shí)：促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)具有抗凋亡、抗炎、抗氧化作用，并對心、腦、脊髓等臟器均具有明顯的細(xì)胞保護(hù)作用，是近來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[3]。亦有新近研究指出EPO的衍生物氨甲酰化促紅細(xì)胞生成素(carbamylated erythropoietin，CEPO)具有與EPO近乎同等的組織保護(hù)作用，不會促進(jìn)造血，從而減少了血液淤積、血壓升高、血栓形成等不良反應(yīng)的發(fā)生，具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景[4]。但就目前而言，CEPO治療CHF的相關(guān)研究尚少見報(bào)道。本研究通過建立大鼠CHF模型并予以CEPO干預(yù)，觀察心臟功能指數(shù)、心肌細(xì)胞組織形態(tài)、心肌細(xì)胞凋亡率以及凋亡相關(guān)基因活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白的表達(dá)，探討CEPO調(diào)節(jié)Caspase-3活化表達(dá)對CHF大鼠的心肌保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動物 8周～12周齡SPF級成年雄性SD大鼠共36只，體重(235.26±10.15)g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。所有大鼠均在相同的條件下飼養(yǎng)，自由飲水和取食。飼料購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 藥品及試劑 CEPO由廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)研究室合成，TUNEL試劑盒購自Roche公司，β-actin抗體購自ProteinTech Group，Inc(USA)，cleaved Caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology(USA)。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型建立 36只成年雄性SD大鼠隨機(jī)選取10只為假手術(shù)(Sham)組，其余大鼠行腹主動脈縮窄術(shù)建立CHF模型。手術(shù)前禁食24 h并稱重，10%水合氯醛(3 mL/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉，逐層打開腹腔、暴露左腎靜脈，取左腎靜脈和下腔靜脈交點(diǎn)上方15 mm～20 mm處鈍性分離筋膜后暴露腹主動脈，用4-0絲線穿過分離的腹主動脈，在腹主動脈上平行放置磨鈍后的7號輸液針頭(直徑0.7 mm)，結(jié)扎絲線后馬上拔除針頭，拔針時(shí)以稍有緊箍感為宜，此時(shí)可使腹主動脈縮窄達(dá)60%～70%，收納臟器，逐層關(guān)閉腹腔。待大鼠從麻醉中蘇醒后即經(jīng)腹腔注射阿米卡星(0.2 mL/d)抗感染，連續(xù)3 d。術(shù)后正常飼養(yǎng)并觀察8周，制成CHF模型。Sham組在分離的腹主動脈相同部位穿線但不結(jié)扎，余建模流程同上。

1.2.2 模型分組和干預(yù) 術(shù)后第8周，將造模成功的存活CHF大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法平均分為CEPO組(n=10)和Control組(n=10)，其中CEPO組大鼠經(jīng)腹腔注射CEPO(50 μg/kg)，3次/周，連續(xù)4周[4]。Control組及Sham組大鼠經(jīng)腹腔同期注射等量0.9%氯化鈉溶液。給藥期間各組大鼠無死亡。

1.2.3 心臟彩超檢查 在術(shù)后第8周、12周行心臟彩超觀察大鼠心功能。大鼠禁食24 h后，10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射(3 mL/kg)麻醉、備皮并仰臥位固定，應(yīng)用超聲心動儀(ie33型號，PHILIPS公司)及7.5 MHz高頻線控探頭(PHILIPS公司)進(jìn)行心臟功能檢測。分別檢測左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、舒張末期室間隔厚度(IVSd)、舒張末期左心室后壁厚度(LVPWd)、收縮末期室間隔厚度(IVSs)、收縮末期左心室后壁厚度(LVPWs)。

1.2.4 心肌組織處理 術(shù)后第12周末待全部大鼠完成心臟彩超檢測后，10%水合氯醛(3 mL/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉，暴露胸腔，剔除心外膜，剪取心尖部5 mm×5 mm×5 mm心肌組織，放入預(yù)冷至4 ℃的PBS溶液中沖洗至溶液澄清，置于液氮中速凍后存于-80 ℃超低溫冰箱，待分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)使用；左心室插管至主動脈并固定，剪開右心耳，以預(yù)冷至4 ℃的生理鹽水溶液快速灌流約3 min至右心耳流出無色澄清液體，再以4%多聚甲醛溶液灌注固定20 min～30 min后剪取心臟，置于4%多聚甲醛緩沖液固定24 h，常規(guī)制備石蠟切片，厚度3 μm～4 μm，待用。

1.2.5 病理檢查 從經(jīng)上述步驟制成的石蠟切片中，每組隨機(jī)選擇3張切片，采用蘇木精-伊紅(HE)染色后置于200 倍光鏡下觀察各組心肌組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及炎癥細(xì)胞浸潤情況。

1.2.6 TUNEL原位末端標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡 從石蠟切片中，每組隨機(jī)選擇3張切片，按照TUNEL試劑盒操作說明處理，在鏡下觀察陽性凋亡細(xì)胞并攝取圖像，再進(jìn)行DAB染色，每張切片在高倍鏡(×400)下隨機(jī)讀取6個(gè)不重疊視野，細(xì)胞核染成深棕色者計(jì)為陽性細(xì)胞。計(jì)數(shù)后，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=單視野凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/單視野總細(xì)胞計(jì)數(shù)×100%，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7 Western blot法測定cleaved Caspase-3蛋白表達(dá) 心肌組織經(jīng)研磨、裂解后用酶標(biāo)儀測定蛋白濃度，上樣總蛋白質(zhì)量定為120 μg，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，采用電印跡轉(zhuǎn)移法，將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，再用麗春紅S染色，根據(jù)所需目標(biāo)分子量剪膜，用含5%脫脂奶粉的TBS-T溶液在室溫中封閉2 h后，分別加入兔抗Caspase-3抗體和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，在室溫下用TBS-T溶液洗膜，充分洗膜后加入兔(鼠)二抗孵育2 h，用TBS-T溶液洗膜后與ECL試劑反應(yīng)5 min，膠片曝光并掃描圖像，用Quantity One軟件計(jì)算條帶光密度(OD)值，以cleaved Caspase-3與β-actin條帶的OD積分比值來評定的cleaved Caspase蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 心臟彩超結(jié)果 術(shù)后第4周，Sham組與建模組大鼠LVEF差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；建模組LVPWd、IVSd、LVPWs、IVSs顯著升高(P<0.05)，表明Control組大鼠心臟發(fā)生心肌肥厚。術(shù)后第8周，Control組大鼠LVEF顯著下降(P<0.05)，LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd仍高于Sham組(P<0.05)，表明Control組大鼠經(jīng)結(jié)扎縮窄腹主動脈后發(fā)生心力衰竭，CHF模型建立成功。術(shù)后第12周，相比Sham組(見圖1A)，Control組大鼠LVEF進(jìn)一步下降(P<0.05)，LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd進(jìn)一步增高(P<0.05)，詳見圖1B。側(cè)面反映Control組大鼠心力衰竭進(jìn)一步加重。與Control組比較，EPO組大鼠LVEF明顯增加(P<0.05)，LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd明顯降低(P<0.05)，表明EPO干預(yù)CHF大鼠能夠逆轉(zhuǎn)其心室肥厚、改善心功能。詳見圖1C、表1。

圖1各組大鼠超聲心動圖

組別時(shí)間nLVPWs(cm)IVSs(cm)LVPWd(cm)IVSd(cm)LVEFSham組8周100.285±0.0210.268±0.2620.194±0.1550.163±0.1470.897±0.57312周100.321±0.0150.295±0.0230.207±0.0100.185±0.0950.882±0.451Control組8周100.393±0.0161)0.349±0.4201)0.295±0.2471)0.227±0.2310.731±0.1911)12周100.451±0.0121)0.372±0.0101)0.309±0.0101)0.304±0.0201)0.643±0.2981)CEPO組12周100.367±0.1112)0.326±0.232)0.245±0.0202)0.217±0.0102)0.782±0.3451)2) 與同期Sham組比較,1)P<0.05;與Control組比較,2)P<0.05。

2.2 HE染色結(jié)果 Sham組大鼠心肌細(xì)胞染色清晰、排列整齊而緊密，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核致密、清晰可見，呈橢圓形或長桿形，顯藍(lán)色。Control組心肌細(xì)胞較肥大，細(xì)胞間間隙增寬，排列紊亂，可見間質(zhì)增生、纖維化，細(xì)胞核著色不均，心肌肌節(jié)增多、肌纖維間疏松水腫。相比Control組，CEPO組心肌細(xì)胞排列紊亂、間質(zhì)增生水腫及炎性細(xì)胞浸潤、聚集的表現(xiàn)有所減輕。詳見圖2。

Sham組 Control組 CEPO組

2.3 心肌細(xì)胞凋亡的變化 Sham組細(xì)胞核染為藍(lán)色，清晰可見，邊界清楚。Control組可見大量棕色深染的固縮、聚集呈棒狀的細(xì)胞核(箭頭所示)，為發(fā)生凋亡的細(xì)胞核。EPO組深染棕色細(xì)胞核較Control組明顯減少。詳見圖3。與Sham組比較，Control組AI顯著升高；與Control組比較，CEPO組AI相對下降，但仍高于Sham組(P<0.05)。詳見表2。

圖3 光鏡下心肌細(xì)胞凋亡組織切片(TUNEL，×400)

2.4 Western blot法檢測心肌cleaved Caspase-3蛋白表達(dá) 與Sham組比較，Control組cleaved Caspase-3/β-actin OD值明顯升高；CEPO組cleaved Caspase-3 OD值相比Control組顯著降低，但高于Sham組(P<0.05)。詳見圖4、表2。

圖4 Western blot檢測各組大鼠術(shù)后第12周心肌cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)

組別ncleavedCaspase-3/β-actinAI(%)Sham組100.3042±0.00178.91±0.18Control組100.9021±0.04141)30.15±0.671)CEPO組10 0.4891±0.02911)2) 21.33±2.531)2) 與同期Sham組比較,1)P<0.05;與Control組比較,2)P<0.05。

3 討 論

近年來不斷有研究證實(shí)[5-6]，細(xì)胞凋亡作為一種有別于細(xì)胞壞死的程序性死亡現(xiàn)象，在慢性心力衰竭發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要的角色。心肌細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，在病理過程中心肌細(xì)胞凋亡程序被激活時(shí)，大量心肌細(xì)胞死亡可造成數(shù)量永久減少，當(dāng)數(shù)量減少至某一閾值時(shí)存活的心肌細(xì)胞不足以完全代償維持心臟正常的舒縮功能，引致心室壁變薄、心肌肥大、心腔擴(kuò)大等器質(zhì)性病變，最終發(fā)展為心力衰竭。和非心肌細(xì)胞類似，心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生的信號傳導(dǎo)通路主要有兩條[7]：一條是通過胞外信號激活細(xì)胞內(nèi)的Caspase家族蛋白酶，一條是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子使Caspase家族蛋白酶活化。這些活化的Caspase家族蛋白酶可將細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白降解，最終引起細(xì)胞凋亡。由此可見這兩條凋亡途徑共同的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是Caspase家族蛋白酶的激活。Caspase家族是一組同型半胱氨酸門冬氨酸蛋白酶，通過蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)順序激活，在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行過程中起著關(guān)鍵作用，其中Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行因子，它由28 kD的酶原經(jīng)酶解作用生成由17 kD、12 kD 兩個(gè)亞單位組成的異二聚體，是細(xì)胞凋亡早期階段激活的關(guān)鍵蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起中心環(huán)節(jié)作用，故也被稱為死亡蛋白酶，是目前已知的凋亡最終執(zhí)行因子[8]。以往的研究顯示：Caspase-3通常以無活性的 Caspase-3前體(pro Caspase-3)存在的，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號激活或各種外界有害物質(zhì)刺激時(shí)，Caspase-3轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腃aspase-3，又稱為活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)，活化型Caspase-3具有成熟酶的性質(zhì)，標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段。其主要作用機(jī)制是消化破壞細(xì)胞內(nèi)多種蛋白酶復(fù)合體，激活核內(nèi)核酸酶，造成DNA裂解，形成DNA片段，破壞細(xì)胞鈣泵功能，發(fā)生細(xì)胞內(nèi)鈣超載，導(dǎo)致最終的細(xì)胞凋亡[9]。

從本研究結(jié)果可以看出，CHF建模成功的Control組大鼠在術(shù)后第12周時(shí)行western蛋白印跡檢測觀察到cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平較Sham組顯著升高(P<0.05)，與此同時(shí)TUNEL檢測可觀察到Control組大鼠凋亡細(xì)胞數(shù)量較Sham組明顯增加(P<0.05)。心臟彩超檢測結(jié)果也顯示，相比假手術(shù)組，術(shù)后第12周Control組大鼠的心室肌明顯肥厚，射血分?jǐn)?shù)顯著下降(P<0.05)，提示CHF大鼠心室重塑、心臟舒縮功能下降，發(fā)生心力衰竭。這和以往的相關(guān)研究結(jié)果一致[10]。因此，阻斷心肌細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制Caspase-3活化，減少cleaved Caspase-3表達(dá)水平有助于阻遏凋亡的發(fā)生，這將是今后防治心力衰竭的主要途徑之一。

傳統(tǒng)的CHF治療藥物包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、β受體阻斷劑、利尿劑及強(qiáng)心苷類藥物等。但上述藥物均各自存在藥物不良反應(yīng)和療效不佳的問題，因此，尋找出一種更廣泛適用的抗慢性心力衰竭藥物是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。EPO是一種由腎臟(少量來自于肝臟)合成和分泌的糖蛋白生長因子，主要治療腎性貧血。新近研究證實(shí)，EPO在心血管疾病上發(fā)揮著細(xì)胞保護(hù)作用，這些有利作用的機(jī)制仍尚未可知，但可能和抗凋亡、抗氧化、促進(jìn)新生血管生成有關(guān)[11]。但是，EPO發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)的劑量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于治療貧血時(shí)的劑量，長期大劑量應(yīng)用EPO可能造成對骨髓造血系統(tǒng)的過度刺激，進(jìn)而導(dǎo)致紅細(xì)胞增多癥、高血壓及血栓形成等不良作用。因此，在保留EPO細(xì)胞保護(hù)功能的前提下去除其促紅細(xì)胞生成作用的衍生物研發(fā)是近期研究的熱點(diǎn)之一。Leist[12]通過用KCNO使EPO氨甲?；幕瘜W(xué)方法制成了CEPO。與EPO相比，CEPO并沒有促紅細(xì)胞生成的作用，但具有與EPO相似的藥物代謝動力學(xué)特性，同時(shí)有研究報(bào)道CEPO具有與EPO相同的細(xì)胞保護(hù)作用。

本研究制備了CHF大鼠模型并予以CEPO干預(yù)，探討CEPO對CHF大鼠心肌的保護(hù)作用。結(jié)果顯示：相比對照組，經(jīng)CEPO干預(yù)的CHF大鼠心肌細(xì)胞凋亡的數(shù)量明顯減少，心肌組織cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平下降。提示CEPO能減少關(guān)鍵凋亡酶蛋白Caspase-3的活化，抑制具有生物功能的cleaved Caspase-3產(chǎn)生，從而減少了心肌凋亡的數(shù)量并起心肌細(xì)胞保護(hù)作用，對CHF的治療發(fā)揮著積極的作用。然而，CEPO減輕心肌凋亡的具體機(jī)制及是否存在其他遠(yuǎn)期不良反應(yīng)尚未闡明，有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯郭懷印)

Effects of Carbamylated Erythropoietin on the Apoptosis and Cleaved Caspase-3 Protein in Rat with Chronic Heart Failure

Huang Zhaoqi，Wu Jinlei，Xu Wei，Chen Yongquan，Xie Wenjie，Chen Ximing，Chen Shengqiang

The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510150，China

ObjectiveTo observe the effects of cardiomyocytes carbamylated erythropoietin (CEPO) on the cardiac function,the apoptosis of cardiomyocytes，protein cleaved cysteine-containing aspartate-specific proteases (cleaved Caspase-3) expression in rats with chronic heart failure(CHF).MethodsFirstly，30 male adult SD rats were randomly divided into three groups，sham-operated (Sham) group (n=10)，CEPO group (n=10) and control (Control) group (n=10).CHF model was built by abdominal aortic coarctation.After postoperative eight weeks，rats in CEPO group

50 μg / kg CEPO by intraperitoneal injection 3 times / week for 4 weeks.The rats in Sham group and Control group received equal normal saline.Respectively，after 8 weeks and 12 weeks，cardiac function was observed with echocardiography.After 12 weeks，all rats were sacrificed，cell morphology was observed by HE staining.The myocardial apoptosis and calculated apoptosis index (AI)；was observed Myocardial cleaved Caspase-3 protein expression was observed by western blot.ResultsEchocardiography showed CHF rats had ventricular hypertrophy and heart failure in 8 weeks.CEPO intervention after 4 weeks compared with Control group，left ventricular ejection fraction (LVEF) was significantly higher (P<0.05)，systolic interventricular septum thickness (IVSs)，end-systolic left ventricular posterior wall thickness (LVPWs)，diastolic interventricular septum thickness (IVSd)， left ventricular end-diastolic wall thickness (LVPWd) was significantly lower (P<0.05).AI in CEPO group was significantly lower than that in Control group[(23.87±1.45)% vs(30.15±0.67)%，P<0.05].The cleaved Caspase-3 OD values significantly decreased in CEPO group (0.489 1±0.029 1) with Control group (P<0.01).ConclusionCEPO can improve heart function in rats with CHF the cardiomyocyte apoptosis，by down-ragulating the express of cleaved Caspase-3 protein.

heart failure；carbamylated erythropoietin；cardiac apoptosis；cleaved Caspase-3 protein

廣東省科技廳基金項(xiàng)目(No.2013B022000103)

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院(廣州 510150)，E-mail：huangzhaoqi34@163.com；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院

信息：黃兆琦，伍金雷，許衛(wèi)，等.氨甲?；偌t細(xì)胞生成素對慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(16)：1974-1978.

R541.6 R256.2

：Adoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2017.16.007

：1672-1349(2017)16-1974-05

2017-03-13)