番茄環(huán)紋斑點病毒Gn蛋白的原核表達及多抗血清制備

鄭寬瑜尚衛(wèi)娜張潔鄭雪董家紅

（1. 云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術與種質(zhì)資源研究所 云南省農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室 農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，昆明650223；2. 浙江大學生命科學研究院，杭州 310058）

番茄環(huán)紋斑點病毒Gn蛋白的原核表達及多抗血清制備

鄭寬瑜1尚衛(wèi)娜2張潔1鄭雪1董家紅1

（1. 云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術與種質(zhì)資源研究所 云南省農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室 農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，昆明650223；2. 浙江大學生命科學研究院，杭州 310058）

通過生物信息學預測，番茄環(huán)紋斑點病毒（Tomato zonate spot virus，TZSV）Gn蛋白為跨膜蛋白，有3個跨膜結構域，抗原表位預測發(fā)現(xiàn)非跨膜區(qū)包含有較高的抗原指數(shù)區(qū)域，因此選擇Gn蛋白的非跨膜區(qū)進行原核表達及多抗血清制備。用特異性引物，通過RT-PCR從感染TZSV的番茄中擴增出部分Gn基因片段，將獲得的片段構建到原核表達載體pET-30a中，獲得原核表達載體pET-30a-Gn，轉化大腸桿菌BL21（DE3），用IPTG誘導表達。SDS-PAGE電泳分析顯示，高效誘導表達了40 kD融合蛋白。用回收純化的融合蛋白免疫家兔，獲得多抗血清。間接ELISA測定多抗血清的效價為1/16 384。利用制備好的抗血清對感染TZSV的病樣進行Western blotting 檢測，能檢測到特異性條帶。結果表明該抗血清特異性良好，可用于TZSV Gn相關的免疫反應實驗。

番茄環(huán)紋斑點病毒；Gn蛋白；原核表達；抗血清

番茄環(huán)紋斑點病毒（Tomato zonate spot virus，TZSV）屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae），番茄斑萎病毒屬（Tospovirus），自2005年發(fā)現(xiàn)以來，一直是云南番茄、辣椒、煙草等經(jīng)濟作物的重要病原［1］，由薊馬傳毒為害［2］。TZSV與其它番茄斑萎病毒屬病毒類似，基因組為單鏈線狀三分體RNA：S RNA、M RNA、L RNA。S RNA正鏈編碼非結構蛋白NSs，負鏈編碼核殼體蛋白N；M RNA正鏈編碼移動蛋白NSm，負鏈編碼糖蛋白Gn/Gc；L RNA負鏈編碼病毒的復制酶RdRp。

TZSV為球形病毒，直徑約80-120 nm，具有雙層脂膜組成的包膜，包膜表面有 Gn/Gc 糖蛋白構成的突起。相關證據(jù)表明Gn/Gc糖蛋白是Tospovirus病毒與薊馬識別的關鍵蛋白［3］。Gn/Gc 蛋白是由前體蛋白G經(jīng)剪切而形成的，TZSV的前體蛋白G大小為3 369 bp，編碼1 122 aa，其中，氨基酸1-25位為信號肽，經(jīng)剪切后，進一步在高爾基內(nèi)進行N-糖基化修飾形成成熟的Gn蛋白和Gc蛋白。對同為布尼亞病毒科的漢坦病毒（Hantavirus）研究顯示：Gn和 Gc 結構相似，均由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及C末端胞質(zhì)尾區(qū)（GP-CT）3部分組成［4］。由于Gn是膜蛋白，具有跨膜結構域，用全長Gn不能順利表達出目的蛋白。本研究通過生物信息學的方法，預測Gn蛋白的抗原表位和跨膜結構域，通過選擇Gn蛋白的非跨膜區(qū)進行Gn的原核表達，并通過免疫家兔得到了專一性的Gn蛋白多抗血清，旨為研究TZSV與薊馬互作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

TZSV感染的番茄由本實驗室保存。Marker DL2000、pMD Simple18-T 載體、rTaq酶、限制性內(nèi)切酶Nco I及Xho I為TaKaRa公司產(chǎn)品。M-MLV為Promega公司產(chǎn)品。DNA回收試劑盒購自Sangon公司。IPTG、NBT及BCIP購自Sigma公司。硝酸纖維素酶購自BioRad公司。Ni+親和純化柱購自GE公司。1.2 方法

1.2.1 Gn蛋白結構及Protean預測 從NCBI下載TZSV Gn/Gc蛋白的基因序列（序列號：NC_010490），用SignalP-4.0預測Gn/Gc蛋白的剪切位點；TMHMM預測Gn跨膜結構。利用DNAstar軟件提供的Protean模塊，用Kyte-Doolittle方法預測Gn蛋白親水性；Eisenberg方法預測Gn蛋白二級結構；Karplas-Schulz方法預測蛋白質(zhì)骨架區(qū)的柔韌性；Jameson-wolf方法預測蛋白潛在的抗原表位；用Emini方法預測蛋白的表面可及性［5］。

1.2.2 Gn基因的RT-PCR擴增及原核表達載體構建 采用LiCI沉淀法提取RNA［1］，兩步法RT-PCR擴增Gn序列。上游引物Gn-F：CATGCCATGGCATCGAAGACGGAGCATGAA（下劃線為限制性內(nèi)切酶Nco I）；下游引物Gn-R：CCGCTCGAGTCATGAGAAGTTCGTGCAGA（下劃線為限制性內(nèi)切酶Xho I）。cDNA合成體系為20 μL，用12 μL總RNA為模板，1 μL 100 nmol/L引物混合，70℃ 預變性10 min后，迅速插入冰上5 min，加入5×RT Buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，5 U/μL M-MLV 1 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 1 μL，42℃延伸60 min。以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系為：94℃下預變性4 min；然后94℃下變性1 min，55℃退火1 min，72℃下延伸1 min 30 s，循環(huán)擴增30次；最后72℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后，克隆到pMD simple 18-T載體上。菌落PCR鑒定陽性克隆并送華大基因測序。將Gn基因用Nco I及Xho I雙酶切后，與表達載體pET-30a相連接，轉化大腸桿菌BL21（DE3），菌落PCR鑒定陽性克隆并進一步測序驗證編碼框是否正確。

1.2.3 Gn融合蛋白的誘導表達、SDS-PAGE分析和純化 陽性克隆接菌于含100 mg/L卡那霉素（Kanamycin）的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，OD600=0.6時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG 37℃誘導表達6 h，以不加IPTG誘導的培養(yǎng)物為陰性對照。離心收集菌體，在8 mol/L尿素變性條件下破碎細胞，用Ni+親和純化柱回收帶有His標簽的融合蛋白。純化后的蛋白在復性緩沖液（50 mmol/L Tris，0.5 mM EDTA，50 mmol/L NaCl，1%甘氨酸）中透析48 h，作為抗原免疫家兔。同時取樣加2×SDS-PAGE上樣緩沖液（0.1 mol/L Tris-HCl，1% β-巰基乙醇，4% SDS，0.2%溴酚藍，20%甘油，pH 6.8）充分懸浮。沸水中處理10 min，12 000 r/min離心2 min后取上清進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 多抗血清的制備及效價測定 用紫外分光光度計測定Gn蛋白濃度，稀釋至1 mg/mL，參照歐陽元龍等［6］的方法免疫家兔?？寡灏?/512、1/1 024、1/2 048、1/4 096、1/8 192、1/16 384倍比進行梯度稀釋，間接ELISA進行抗血清效價測定［7］。

1.2.5 Gn蛋白的Western blotting檢測 取0.1 g感病葉片液氮研磨后，加入200 μL 2×SDS蛋白上樣緩沖液，進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后電轉移至硝酸纖維素膜上，TZSV Gn多抗血清孵育1 h（1∶4 000倍比稀釋），TBST洗膜后，加入堿性磷酸酯酶標記羊抗兔二抗（1∶8 000倍比稀釋），加入NBT/BCIP顯色至條帶清晰。

2 結果

2.1 TZSV Gn蛋白結構及Protean預測

SignalP-4.0 預測前體蛋白G氨基酸序列第25位為信號肽剪接位點，Gn和Gc的剪切位點位于前體蛋白G氨基酸序列第436位，由此推算Gn蛋白核苷酸序列長1 233 bp，編碼411 aa，分子量為47.5 kD。TMHMM預測前體蛋白G氨基酸第295位后有連續(xù)3個跨膜結構（圖1）。在原核表達中，信號肽及跨膜結構會影響到目的蛋白的定位及表達量；此外綜合Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplas-Schulz、Jameson-wolf方法、Emini方法，Gn蛋白氨基酸殘基1-260區(qū)段內(nèi)有較好的親水性、可及性和較高的抗原性指數(shù)（圖2），因此在本研究中選擇前體蛋白G氨基酸序列26-295之間的區(qū)域，基因片段長度810 bp用于Gn蛋白的原核表達及多抗血清制備。

圖1 TMHMM預測前體G蛋白跨膜結構域

2.2 TZSV Gn原核表達載體構建、誘導表達及純化

用RT-PCR從感病番茄中擴增得到長度為810 bp的Gn基因，經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析與目的片段大小相吻合，PCR產(chǎn)物純化后與pMD simple 18-T連接，并測序。證實擴增片段即為Gn基因片段，且ORF正確。用Nco I及Xho I雙酶切原核表達載體pET-30a-Gn，結果顯示從載體上能特異性切下一段約810 bp左右的片段。同時測序結果也說明該片段即為TZSV的Gn基因，證明所構建的原核表達載體是正確的。轉化有原核表達載體pET-30a-Gn陽性克隆的大腸桿菌BL21菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后加入1 mmol/L IPTG誘導表達6 h，而不加IPTG誘導的陽性克隆菌株則作為對照。經(jīng)12.5%的SDSPAGE分析顯示，IPTG誘導的菌株特異性表達約40 kD融合蛋白（圖3）。該融合蛋白在N端和C端都表達有His-tag標簽。用GE公司的Ni+親和純化柱純化回收帶有His標簽的Gn蛋白。

2.3 TZSV Gn蛋白的抗血清制備及效價測定

以純化后的Gn蛋白作為抗原免疫家兔，每周注射一次，注射4次后取血收集血清，用間接ELISA測定抗血清的效價。結果顯示1 mg/mL的抗原能和多抗血清反應的最高稀釋倍數(shù)為1/16 384倍。2.4 TZSV Gn蛋白的Western blot檢測

圖2 Protean預測Gn蛋白抗原表位

用制備好的抗血清對TZSV感病病樣及原核表達的Gn蛋白進行Western blot檢測（圖4），在約40 kD處檢測到原核表達的Gn蛋白，在約47 kD附近檢測到TZSV感病病樣的Gn蛋白條帶，與預期相符合。

圖3 Gn蛋白的誘導表達及純化

圖4 Gn蛋白的Western blot檢測

3 討論

Gn/Gc糖蛋白為布尼亞病毒科病毒的重要結構蛋白，它鑲嵌在成熟病毒顆粒的包膜上，在感染人或動物的布尼亞病毒中，因其具有中和抗原決定簇和各型的特異性抗原位點，能夠刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，而成為基因工程疫苗研究的靶點［8，9］。本研究在對感染植物Tospovirus病毒TZSV Gn蛋白結構及Protean預測發(fā)現(xiàn)，TZSV Gn蛋白氨基酸殘基1-260區(qū)段內(nèi)有較好的親水性、可及性和較高的抗原性指數(shù)，制備的抗血清具有良好的特異性。用本實驗室制備的Gn抗血清做TZSV Gn蛋白免疫膠體金標記，Gn蛋白抗體能很好的定位到病毒粒子表面，具有非常好的電鏡形態(tài)學診斷特征［10］。

Gn蛋白一個重要的功能是介導病毒與細胞受體的識別。對感染人的漢坦病毒（Hantavirus）研究顯示Gn蛋白可以介導病毒與細胞蛋白β3整合素（β3 integrins）、衰變加速因子（DAF/CD55）、補體分子球形結構域受體（gC1qR/p32）識別而使病毒進入細胞［11-12］。對感染植物的Tospovirus病毒代表種番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）的Gn定位研究表明，Gn能特異性定位到西花薊馬（Frankliniella occidentalis）中腸部位，表明與TSWV Gn識別的受體蛋白可能為薊馬中腸受體蛋白［13］，也發(fā)現(xiàn)了可能為Gn受體的薊馬蛋白［14-15］。在所有已知的5 500多種薊馬中，僅發(fā)現(xiàn)薊馬科（Thripidae）的花薊馬屬（Frankliniella）、薊馬屬（Thrips）、硬薊馬屬（Scirtothrips）及緣薊馬屬（Ceratothripoides）4個屬的12種薊馬能夠傳播Tospoviruses［16］。推測Tospovirus病毒與薊馬的特異性很可能是Gn/Gc蛋白與薊馬中腸受體蛋白特異性密切相關。本研究所制備的TZSV Gn蛋白多抗血清不僅可以應用于病毒快速檢測及病毒發(fā)生流行監(jiān)測，還可進一步利用免疫標記、far-western blotting、免疫共沉淀及酵母雙雜等技術應用于Gn蛋白與相關傳毒介體薊馬的互作功能研究。

4 結論

本研究通過生物信息學方法對Gn蛋白結構及B細胞的潛在抗原表位預測，選擇了Gn的非跨膜區(qū)進行原核表達及多抗血清制備，所制備的抗血清具有較高的效價，1 mg/mL的抗原能和多抗血清反應的最高稀釋倍數(shù)為1/16 384倍。Western blot表明多抗血清特異性好，不僅能檢測到原核表達的Gn蛋白（40 kD），也能檢測到感染TZSV病樣中的Gn蛋白（49 kD）。該多抗血清不僅能應用于TZSV檢測，還能進一步應用于Gn的功能研究。

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（責任編輯 朱琳峰）

Prokaryotic Expression and Polyclonal Antiserum Preparation of Gn Protein in Tomato Zonate Spot Virus（TZSV）

ZHENG Kuan-yu1SHANG Wei-na2ZHANG Jie1ZHENG Xue1DONG Jia-hong1
（1. Institute of Biotechnology and Germplasm Resources，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yunnan Province Key Laboratory of Agricultural Biotechnology，Key Lab of the Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm Innovation，Ministry of Agriculture，Kunming 650223；2. Life Sciences Institute，Zhejiang University，Hangzhou 310058）

Bioinformatics prediction showed that Gn protein in tomato zonate spot virus（TZSV）is a transmembrane protein consisting of 3 transmembrane domains. Antigen epitope prediction showed that there was a high antigen index region，thus non-transmembrane region of Gn was selected to conduct the prokaryotic expression and to prepare polyclonal antiserum. The Gn gene fragment of TZSV was amplified from TZSV-infected tomato sample by RT-PCR，and then cloned into prokaryotic expression vector pET-30a. The recombinant plasmids pET-30a-Gn were transformed into Escherichia coli BL21（DE3），and then induced to express with IPTG. The result of SDS-PAGE analysis showed the specific fusion protein with molecular weight of 40 kD was highly expressed. Using the purified fusion protein，rabbit was immunized to obtain polyclonal antiserum against TZSV Gn protein. The titer of antiserum was 1/16384 determined by ID-ELISA. The specific band was detected by Western blot while applying the prepared antiserum to the TZSV-infected samples. These results reveal that the specificity of the antiserum is fine，and it is applicable for immune-reaction test related to TZSV Gn.

tomato zonate spot virus；Gn protein；prokaryotic expression；antiserum

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0242

2017-03-28

國家自然科學基金項目（31660508，31371919，31060237）

鄭寬瑜，女，副研究員，研究方向：植物病理學；E-mail：zhengkuanyu@126.com尚衛(wèi)娜，女，實驗師，研究方向：植物病理學；E-mail：wnshang@zju.edu.cn。尚衛(wèi)娜與鄭寬瑜為共同第一作者

董家紅，男，研究員，研究方向：植物病理學；E-mail：dongjhn@126.com