小桐子轉(zhuǎn)化酶基因家族的生物信息學(xué)分析及表達特性

王海波 辛胡 劉潮 唐利洲

（曲靖師范學(xué)院 云南高原生物資源保護與利用研究中心 云南省高校云貴高原動植物遺傳多樣性及生態(tài)適應(yīng)性重點實驗室，曲靖 655011）

小桐子轉(zhuǎn)化酶基因家族的生物信息學(xué)分析及表達特性

王海波 辛胡 劉潮 唐利洲

（曲靖師范學(xué)院 云南高原生物資源保護與利用研究中心 云南省高校云貴高原動植物遺傳多樣性及生態(tài)適應(yīng)性重點實驗室，曲靖 655011）

轉(zhuǎn)化酶是植物蔗糖代謝與抗逆性形成的關(guān)鍵酶?；谛⊥┳踊蚪M數(shù)據(jù)，鑒定到16個小桐子轉(zhuǎn)化酶基因，并對其系統(tǒng)進化、基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、保守基序及表達特性進行了分析。結(jié)果表明，小桐子轉(zhuǎn)化酶基因家族聚類為3個亞家族，中性/堿性轉(zhuǎn)化酶α亞組與酸性轉(zhuǎn)化酶基因包含6或7個外顯子，β亞組包含4或5個外顯子。同時，酸性轉(zhuǎn)化酶N端都包含信號肽序列，且都鑒定到GH32家族保守的-NDPNG/A-與-MWECV/P-基序。qRT-PCR表達分析顯示，JcC-INVD基因在小桐子子葉中表達量最高，而在根中表達量較低，且在葉中屬于低溫誘導(dǎo)基因。

小桐子；轉(zhuǎn)化酶；基因家族；表達分析

蔗糖是植物體內(nèi)光合產(chǎn)物由源器官如葉片向庫器官如果實、塊莖、種子等運輸?shù)闹饕问?，在源庫關(guān)系調(diào)節(jié)、糖分組成調(diào)控、脅迫響應(yīng)及己糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。在植物體內(nèi)，蔗糖通過蔗糖酶/β-呋喃果糖苷酶（Sucrase/βfructofuranosidase，即轉(zhuǎn)化酶Invertase，INV，EC3.2. 1.26）與蔗糖合成酶（Sucrose synthase，SS，EC2.4. 1.13）催化分解生成葡萄糖與果糖，被庫器官直接利用，另外還可以通過濃度效應(yīng)［1］或己糖激酶（Hexokinase）磷酸化產(chǎn)生信號［2，3］進而調(diào)控一系列基因的表達。按照亞細胞定位，轉(zhuǎn)化酶可分為細胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶（Cytoplasm invertase，C-INV/CINV/SNAI）、細胞壁轉(zhuǎn)化酶（Cell wall invertase，CW-INV/cwINV/ CWI）及液泡轉(zhuǎn)化酶（Vacuole invertase，V-INV/VI-NV/SAI）［4］。又根據(jù)低離子強度緩沖液中的溶解性，分為酸性轉(zhuǎn)化酶（Acidic invertase，EC3.2.1.26）與中性/堿性轉(zhuǎn)化酶（Neutral/alkaline invertase，EC3. 2.1.27），前者包括細胞壁轉(zhuǎn)化酶（不溶或可溶性的，最適pH值3.5-5.0之間）與液泡轉(zhuǎn)化酶（可溶性的，最適pH值5.0-5.5之間），且都屬于糖基化蛋白，不僅可以催化蔗糖的水解，還可以催化寡聚糖如棉子糖、水蘇糖等的水解［5］，同時活性受到重金屬離子如Cu2+、Ag+、Hg2+、Co2+等的抑制作用；后者主要指細胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶（可溶性的，最適pH值6.8-8.0之間），屬于單純蛋白，具有蔗糖水解特異性［6，7］，其活性不受重金屬離子的抑制。另外研究發(fā)現(xiàn)中性/堿性轉(zhuǎn)化酶還存在于葉綠體、線粒體、淀粉體及細胞核中［8-11］。

第一個被克隆的植物轉(zhuǎn)化酶基因是胡蘿卜（Daucus carota）細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因［4］。隨著多種植物基因組測序的完成，更有利于從全基因組范圍內(nèi)對轉(zhuǎn)化酶基因家族進行分子結(jié)構(gòu)、進化特性及表達調(diào)控等的深入研究。酸性轉(zhuǎn)化酶（GH32家族，Glycoside hydrolase family 32）與堿性/中性轉(zhuǎn)化酶（GH100家族）由不同的基因家族編碼［12］，且不同的植物其基因數(shù)量也不同，如擬南芥細胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶基因、細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因、液泡轉(zhuǎn)化酶基因分別有9、6、2個，而水稻對應(yīng)分別有8、9、2個。小桐子屬大戟科（Euphorbiaceae）能源植物，可生產(chǎn)清潔生物質(zhì)柴油，兼具良好的經(jīng)濟與生態(tài)效益。對于小桐子轉(zhuǎn)化酶基因家族的鑒定及分析還未見報道。本研究基于小桐子基因組數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)方法鑒定到16個小桐子轉(zhuǎn)化酶基因，并對其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化及差異表達進行了分析，以期為研究小桐子轉(zhuǎn)化酶基因的生物學(xué)特性、克隆轉(zhuǎn)化、及功能驗證提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料及處理 選取飽滿的小桐子種子（云南省楚雄州元謀縣），按照李忠光的方法［13］進行發(fā)芽處理，將發(fā)芽的種子播于消毒的培養(yǎng)土中并于恒溫培養(yǎng)箱（溫度26℃、相對濕度75%、光周期16/8 h）中生長15 d至第二片真葉展開，每天用無菌水潤濕培養(yǎng)土。將生長15 d的小桐子幼苗置于12℃、相對濕度75%、16/8 h光周期的低溫培養(yǎng)箱中進行低溫脅迫處理，分別取低溫脅迫0.5、3、12、24 h與對照（正常培養(yǎng)）的第二片真葉、子葉、莖及根，用鋁箔紙包好，液氮速凍后保存于-80℃冰箱中用于RNA的提取。

1.1.2 實驗試劑與儀器 RNA提取試劑盒TransZol Up、反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix、實時熒光定量PCR試劑盒TransStart Top Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNase I購自天根生化科技有限公司；其余試劑為進口或國產(chǎn)分析純。引物合成由深圳華大基因有限公司完成。實時熒光定量PCR儀型號為Roche Lightcycler 96。

1.2 方法

1.2.1 小桐子轉(zhuǎn)化酶基因家族的鑒定 從GenBank下載小桐子最新注釋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/genome/915/），根據(jù)模式植物擬南芥數(shù)據(jù)庫（http://www.arabidopsis.org/）中已經(jīng)鑒定出的17個轉(zhuǎn)化酶基因的蛋白質(zhì)序列（細胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶At1g56560、At4g34860、At3g06500、At1g22650、At5g22510、At1g7200、At1g35580、At3g05820、At4g09510；細胞壁轉(zhuǎn)化酶At3g13790、At3g52600、At1g55120、At2g36190、At3g13784、At5g11920；液泡轉(zhuǎn)化酶At1g62660、At1g12240），利用NCBI Blast程序?qū)π⊥┳拥鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫進行本地BlastP相似性比對（閾值E<1e-10，序列相似性>50%），得到候選的小桐子轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)序列，并手工去除重復(fù)序列。將非冗余的候選序列利用Pfam與CCD在線工具分析轉(zhuǎn)化酶結(jié)構(gòu)域，得到小桐子轉(zhuǎn)化酶家族蛋白序列。

1.2.2 小桐子轉(zhuǎn)化酶基因家族序列分析 利用ExPaSy提供的在線工具ProtParam（http://web.expasy. org/protparam/）對得到的小桐子轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)序列進行基本性質(zhì)的分析。利用獲得的小桐子轉(zhuǎn)化酶家族蛋白序列對GenBank小桐子基因組數(shù)據(jù)庫（Annotation release 100，JatCur_1.0）進行tblastn相似性檢索得到其基因與CDS（Coding sequence）序列，并利用GSDS（Gene Structure Display Server，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制基因結(jié)構(gòu)圖。根據(jù)CDS序列得到小桐子各轉(zhuǎn)化酶基因起始密碼子ATG上游1 500 bp的調(diào)控序列，并通過PlantCARE工具對其順式作用元件進行鑒定。將鑒定的小桐子轉(zhuǎn)化酶蛋白序列利用ClustalX（Version2.0）進行序列相似性比對，然后用MEGA6.0軟件通過鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并采用自展法（Bootstrap）進行檢驗。

1.2.3 小桐子JcC-INVD轉(zhuǎn)化酶基因的表達分析 利用TransZol Up提取各材料的總RNA，并利用DNase I消化RNA中的殘余基因組DNA，得到純化的總RNA。分別取3 μg總RNA，利用TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix合成第一鏈cDNA，以18S rRNA為內(nèi)參（GenBank登錄號：AY823528），利用TransStart Top Green qPCR SuperMix進行小桐子轉(zhuǎn)化酶C-INVD基因的qRT-PCR擴增，20 μL反應(yīng)體系，每個樣品重復(fù)3次。JcC-INVD基因擴增引物序列JcC-INVD_F（5'-CGGATTGGGTATTTG-3'），JcC-INVD_R（5'-TCTGGTATTCTTGGGAT-3'）；內(nèi)參基因18S rRNA擴增引物序列18S rRNA_F（5'-AGAAACGGCTACCACATC-3'），18S rRNA_R（5'-CCAAGGTCCAACTACGAG-3'）。擴增條件為：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，45個循環(huán)，之后增加溶解曲線程序：95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s，連續(xù)檢測信號。采用2-ΔΔCt法進行相對表達量分析。

2 結(jié)果

2.1 小桐子轉(zhuǎn)化酶基因家族的鑒定及系統(tǒng)進化分析

以擬南芥17個轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)序列為種子序列對小桐子蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行BlastP相似性檢索，結(jié)合結(jié)構(gòu)域分析共鑒定到16個小桐子轉(zhuǎn)化酶，其中包括細胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶8個、細胞壁轉(zhuǎn)化酶6個及液泡轉(zhuǎn)化酶2個（表1）。進化樹分析（圖1）顯示，16個小桐子轉(zhuǎn)化酶聚類為兩大家族，即酸性轉(zhuǎn)化酶家族（GH32家族，8個）與中性/堿性轉(zhuǎn)化酶家族（GH100家族，8個），酸性轉(zhuǎn)化酶家族又聚類為細胞壁轉(zhuǎn)化酶（Jccw-INV1-Jccw-INV6）與液泡轉(zhuǎn)化酶（JcV-INV1與JcV-INV2）兩個分支，而中性/堿性轉(zhuǎn)化酶（細胞質(zhì)型轉(zhuǎn)化酶）家族也分支為2個亞組（α亞組與β亞組），而且與細胞質(zhì)型轉(zhuǎn)化酶的亞細胞定位一致，其中，α1亞組包括JcC-INVA與JcC-INVC，定位線粒體；α2亞組包括JcC-INVE與JcC-INVH，定位葉綠體；β亞組包括JcC-INVB、JcC-INVD、JcC-INVF及JcC-INVG，定位細胞質(zhì)。

同時，利用基因組數(shù)據(jù)庫得到小桐子轉(zhuǎn)化酶蛋白序列對應(yīng)的CDS序列與基因序列，并利用GSDS繪制其基因結(jié)構(gòu)（圖1）。與進化樹對比分析表明，6個小桐子細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因包含6（Jccw-INV2、Jccw-INV3、Jccw-INV4、Jccw-INV5，除Jccw-INV5都不包含5'-UTR與3'-UTR區(qū)）或7（Jccw-INV1與Jccw-INV6，都包含5'-UTR與3'-UTR區(qū)）個外顯子，與進化樹中細胞壁轉(zhuǎn)化酶聚類為2個分支一致，2個液泡轉(zhuǎn)化酶都包含7個外顯子，且都包含5'-UTR與3'-UTR區(qū)。另外，8個酸性轉(zhuǎn)化酶基因都包含該家族中典型的9 bp外顯子（第2個外顯子），編碼3個氨基酸殘基-DPN-，參與構(gòu)成植物酸性轉(zhuǎn)化酶保守基序Motif1（-NDPNG/A-）。在細胞質(zhì)型轉(zhuǎn)化酶家族中，α1亞組都包含6個外顯子，而α2亞組都包含7個外顯子，且都包含5'-UTR與3'-UTR區(qū)；β亞組中，JcC-INVB與JcC-INVD都包含5個外顯子且都包含5'-UTR與3'-UTR區(qū)，而JcC-INVF與JcCINVG都包含4個外顯子，但都不包含5'-UTR與3'-UTR區(qū)（表1）。

2.2 小桐子轉(zhuǎn)化酶的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征分析

小桐子16個轉(zhuǎn)化酶蛋白單體序列長度分布在560-735 aa之間，其中酸性轉(zhuǎn)化酶氨基酸長度變化較小，而中性/堿性轉(zhuǎn)化酶氨基酸長度差異較大。等電點分布在4.85-9.40之間，其中細胞壁轉(zhuǎn)化酶除Jccw-INV6外都偏堿性，液泡轉(zhuǎn)化酶都偏酸性，而中性/堿性轉(zhuǎn)化酶變化差異較大（表1）。通過SignalP分析顯示，小桐子中性/堿性轉(zhuǎn)化酶都不含信號肽，而細胞壁轉(zhuǎn)化酶在N端都含有一段約21-25 aa的信號肽，液泡轉(zhuǎn)化酶則在N端含有一段101 aa（JcVINV1）與129 aa（JcV-INV2）的長信號肽，具有輔助轉(zhuǎn)化酶前體蛋白運輸及靶標識別的作用。

圖1 小桐子轉(zhuǎn)化酶基因家族的進化與基因結(jié)構(gòu)分析

表1 小桐子轉(zhuǎn)化酶蛋白的理化性質(zhì)分析

通過GenBank結(jié)構(gòu)域分析顯示，在小桐子8個酸性轉(zhuǎn)化酶中都鑒定到GH32家族結(jié)構(gòu)域（以Jccw-INV4為例見圖2）。同時，對小桐子酸性轉(zhuǎn)化酶進行多序列比對發(fā)現(xiàn)，細胞壁轉(zhuǎn)化酶與液泡轉(zhuǎn)化酶在N端都包含信號肽，但序列相似性較低。另外，小桐子酸性轉(zhuǎn)化酶活性中心主要由保守基序Motif1（-NDPNG/A-）與Motif2（-MWECV/P-）及催化必需氨基酸殘基（Asp）組成，催化中心則由核心氨基酸殘基-DPN/D-組成，而在Motif2中的V/P殘基則決定了小桐子酸性轉(zhuǎn)化酶的最適pH值及催化底物的特異性（圖2）。2.3 小桐子轉(zhuǎn)化酶JcC-INVD基因的表達分析

圖2 小桐子酸性轉(zhuǎn)化酶多重序列比對及保守結(jié)構(gòu)域

文獻報道，轉(zhuǎn)化酶是與植物抗逆性密切相關(guān)的基因家族，多種非生物脅迫可以誘導(dǎo)不同類型轉(zhuǎn)化酶基因的表達。利用PlantCARE工具對小桐子定位細胞質(zhì)的中性/堿性轉(zhuǎn)化酶JcC-INVD基因上游調(diào)控序列進行了順式作用元件的鑒定，結(jié)果表明，其啟動子中存在脫落酸、茉莉酸甲酯、水楊酸、生長素、高溫及干旱等調(diào)控元件，說明轉(zhuǎn)化酶在調(diào)節(jié)小桐子蔗糖運輸與代謝、抵抗非生物環(huán)境脅迫等方面起重要的作用。以18S rRNA為內(nèi)參基因，對小桐子JcCINVD基因在不同組織與12℃低溫脅迫下的表達情況進行了qRT-PCR分析，結(jié)果（圖3）表明，JcCINVD基因在小桐子各組織中都有表達，其中在子葉中表達量最高，其次是葉片，而在根中表達量較低。另外，隨著低溫處理時間的延長，JcC-INVD在葉片中的表達量顯著增加，并在3 h時達到最大表達量，較對照提高19.03倍，之后逐漸降低。說明小桐子JcC-INVD基因也是低溫誘導(dǎo)基因，與小桐子的抗冷性形成直接相關(guān)。

3 討論

圖3 小桐子JcC-INVD轉(zhuǎn)化酶基因的差異表達分析

根據(jù)高等植物酸性轉(zhuǎn)化酶基因的結(jié)構(gòu)分析表明，大部分都屬于6/7外顯子基因構(gòu)型［5］，其中第2個外顯子僅9 bp，編碼3個氨基酸（DPN），屬呋喃果糖苷酶及酸性轉(zhuǎn)化酶的保守區(qū)-NDPNG/A-［14，15］，與第3個外顯子編碼的催化位點-MWECV/P-（液泡轉(zhuǎn)化酶為V、細胞壁轉(zhuǎn)化酶為P）共同穩(wěn)定并維持酸性轉(zhuǎn)化酶的催化活性［5，7，16，17］，而小桐子液泡轉(zhuǎn)化酶JcV-INV1的第2個外顯子卻編碼DPD，根據(jù)GenBank結(jié)構(gòu)域分析顯示該氨基酸殘基并不屬于催化必需氨基酸，因而推測JcV-INV1中N（天冬酰胺）由D（天冬氨酸）取代并不影響其催化活性。

植物轉(zhuǎn)化酶基因家族的進化歷程可以通過內(nèi)共生學(xué)說解釋［18］，Sturm等［4］推測植物酸性轉(zhuǎn)化酶來自于呼吸真菌與好氧細菌，細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因首先通過內(nèi)吞好氧細菌進入植物細胞，之后發(fā)生突變在N端增加了一段信號肽序列使其定位于液泡形成液泡轉(zhuǎn)化酶［16，19］，而中性/堿性轉(zhuǎn)化酶則來源于20-35億年前藍藻中形成的一個原始基因，且在內(nèi)共生事件發(fā)生之前，藍藻中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因就已經(jīng)進化形成α與β組［20，21］。Bocock等［14］、Ji等［18］、Fridman等［22］根據(jù)轉(zhuǎn)化酶的基因結(jié)構(gòu)、保守區(qū)位置、染色體的定位及轉(zhuǎn)化酶基因上下游基因的類型等特征對毛果楊、水稻、番茄、馬鈴薯及擬南芥的轉(zhuǎn)化酶基因家族進化歷程進行分析也證明轉(zhuǎn)化酶基因是由一個共同的原始基因通過多次的基因丟失與復(fù)制進化而來的。同樣規(guī)律，小桐子細胞壁轉(zhuǎn)化酶中Jccw-INV2-Jccw-INV4-Jccw-INV5-Jccw-INV3按順序串聯(lián)在一起，而兩個液泡轉(zhuǎn)化酶的上游均含有Trehalose-phosphate phosphatase的ORF，下游均含有Monocopper oxidase的ORF，與Bocock等［14］對毛果楊轉(zhuǎn)化酶基因結(jié)構(gòu)分析相似。

Liao等［23］對竹子轉(zhuǎn)化酶基因啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)包含大量生物與非生物響應(yīng)元件，顯示轉(zhuǎn)化酶廣泛參與植物多種抗逆性過程，如赤霉素處理降低甜菜液泡轉(zhuǎn)化酶BVInv-V3基因的表達［24］；番茄受到真菌浸染細胞壁轉(zhuǎn)化酶IncW1表達量上調(diào)［25］；低溫脅迫降低水稻OsINV4的表達從而導(dǎo)致花粉敗育［26］。本研究中小桐子中性/堿性轉(zhuǎn)化酶JcC-INVD基因在其調(diào)控序列中并沒有鑒定到低溫調(diào)控元件，但通過qRT-PCR分析顯示該基因受低溫誘導(dǎo)顯著，說明其參與小桐子抗冷性的形成過程或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

4 結(jié)論

本研究基于小桐子基因組數(shù)據(jù)庫鑒定到16個小桐子轉(zhuǎn)化酶基因家族成員，聚類為3個亞家族，其中，細胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶、細胞壁轉(zhuǎn)化酶及液泡轉(zhuǎn)化酶分別為8、6、2個。實時熒光定量PCR表達分析顯示，JcC-INVD基因在小桐子各組織中存在表達特異性，在葉中屬于低溫誘導(dǎo)基因，可以作為抗冷小桐子新品種選育的候選基因。

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［26］Oliver SN, Van Dongen JT, Alfred SC, et al. Cold-induced repression of the rice anther-specific cell wall invertase gene OsINV4 is correlated with sucrose accumulation and pollen sterility［J］. Plant, 2005, 28（12）：1534-1551.

（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Genome-wide Identification and Expression Characteristics of Invertase Gene Family in Jatropha curcas

WANG Hai-bo XIN Hu LIU Chao TANG Li-zhou
（Center for Yunnan Plateau Biological Resources Protection and Utilization，Key Laboratory of Yunnan Province Universities of the Diversity and Ecological Adaptive Evolution for Animals and Plants on Yungui Plateau，Qujing Normal University，Qujing 655011）

Plant invertase is one of critical enzymes in sucrose metabolism and stress resistance formation. The 16 invertase genes were identified based on complete genome data of Jatropha curcas，then the evolutionary relationship，gene structure，physical and chemical characteristics，conserved motif，and expression feature were analyzed. The results showed that invertase gene family in J. curcas was clustered to three subfamilies according to phylogenetic analysis. The α subgroup of neutral/alkaline invertases and acidic invertase gene owned 6-7 exons，and β subgroup owned 4-5 exons in gene structure. Signal peptides in N-terminal and conserved motifs of -NDPNG/A- and -MWECV/P-belonging to GH32 family were identified in acidic invertase protein sequences. qRT-PCR analysis revealed that JcC-INVD expressed differently in different tissues，with abundantly in cotyledon，but scarcely in root，and remarkably cold-induced expression in leaf.

Jatropha curcas；invertase；gene family；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0303

2017-04-14

國家自然科學(xué)基金項目（31460179）

王海波，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：植物逆境分子生物學(xué)；E-mail：bocai0406@163.com