新型抗真菌活性物質農(nóng)抗N2粗提物對水稻種子萌發(fā)的影響

吳志明鐘敏鹿承建朱曼寧杜起風李昆太

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院，南昌 330045；2. 江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，南昌 330045）

新型抗真菌活性物質農(nóng)抗N2粗提物對水稻種子萌發(fā)的影響

吳志明1，2鐘敏1，2鹿承建1朱曼寧1杜起風1李昆太1，2

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院，南昌 330045；2. 江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，南昌 330045）

為探究不同濃度新型廣譜農(nóng)抗N2粗提物對水稻種子萌發(fā)的影響及作用機制，采用紫外-可見分光光度法考察了農(nóng)抗N2粗提物浸種對水稻種子多項萌發(fā)指標、淀粉酶活力、可溶性總糖、可溶性蛋白及丙二醛含量的影響。結果表明：農(nóng)抗N2粗提物對水稻種子萌發(fā)的作用主要表現(xiàn)為低濃度促進，高濃度抑制。0.23-1.15 μg/mL農(nóng)抗N2粗提物浸種均能有效增強種子活力，促進胚芽和胚根的生長，尤以0.58 μg/mL處理組效果最佳；此外，淀粉酶總活力、可溶性總糖和蛋白質含量相較CK分別提高了28.27%、7.73%與6.49%，且差異顯著；同時，相比CK處理組，農(nóng)抗N2粗提物浸種能顯著降低種子中丙二醛的含量。因此，適宜濃度農(nóng)抗N2粗提物浸種有利于促進水稻種子萌發(fā)，提高物質代謝能力，增強水稻種子的滲透調節(jié)與組織保護能力。

鏈霉菌N2；水稻；種子萌發(fā)；生理特性

水稻（Orysa sativa L.）是全球最重要的糧食作物，養(yǎng)活了全球一半以上的人口［1］。種子健康是世界農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和糧食安全生產(chǎn)的重要基礎［2］。種子萌發(fā)和幼苗建成是植物生活史中兩個最關鍵的階段，它們直接決定著植物種群的延續(xù)，較高的發(fā)芽勢和發(fā)芽率是培育壯秧的基礎［3，4］。然而，水稻惡苗病、細菌性條斑病、稻曲病、根尖線蟲病、紋枯病和稻瘟病等種（土）傳病害的滋生與蔓延常引起稻谷變色、抑制稻種萌發(fā)和幼苗建成，嚴重威脅著水稻生產(chǎn)安全［5-7］。有研究表明［8-11］，種子帶菌會造成種子萌發(fā)率和幼苗活力下降，并使植物形態(tài)發(fā)生變異。種子處理是作物病蟲害綜合治理（IPM）中具有重要意義的首要環(huán)節(jié)，不僅能促進作物生育安全、使作物健康茁壯成長，而且能有效防治部分種（土）傳病害；相比作用于葉面的植保產(chǎn)品，種子處理劑因其經(jīng)濟、高效的特點，被廣泛應用于水稻生產(chǎn)中［12，13］。迄今為止，化學與生物藥劑已被廣泛用于緩解和控制種（土）傳病害，但噴淋化學殺菌劑容易使病害產(chǎn)生抗藥性，造成毒性殘留，并引起生態(tài)環(huán)境失衡［14］。鑒于生物農(nóng)藥良好的環(huán)境兼容性和人們對綠色食品的需求，利用廣譜、高效、低毒、環(huán)保的微生物生防制劑來替代化學藥劑愈發(fā)成為全球研究的重點［15，16］。眾所周知，放線菌是許多胞外酶和抗生素的知名生產(chǎn)者，尤其是鏈霉菌屬憑借易分離培養(yǎng)、產(chǎn)多種次級代謝物等特點，被廣泛用于農(nóng)業(yè)病害的生物防治［17］。魏賽金等［18］發(fā)現(xiàn)鏈霉菌702不僅能顯著抑制水稻紋枯病菌、稻瘟病菌、稻曲病菌等14種植物病原真菌的生長，且低濃度的農(nóng)抗702能有效促進水稻種子胚根和芽的生長，提高根系活力。

課題組先期以水稻紋枯病菌為靶目標，分離篩選到一株能產(chǎn)新型抗真菌活性物質（1-甲基-3-氧代-6-氮雜二環(huán)［3.1.1］-5（7）-庚烯-2-酮，分子式為C6H7O2N，暫命名為農(nóng)抗N2）的鏈霉菌新種Streptomyces sp. N2，此活性物質具備的廣譜拮抗植物病原真菌特性為其在不同類型植物病害上的生防應用奠定了基礎［19］。本研究用不同濃度農(nóng)抗N2粗提物浸種處理水稻種子，通過考察幼苗株高、發(fā)芽率、活力指數(shù)、儲藏物質運轉率等多項萌發(fā)指標，及其對淀粉酶活力、滲透調節(jié)物質含量和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量的影響，旨在探明新型農(nóng)抗N2粗提物浸種對水稻種子中不同生理生化特性之間的內在聯(lián)系，為新型微生物浸種劑——農(nóng)抗N2的應用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鏈霉菌 N2（Streptomyces sp. N2），分離自云南省昆明市西山國際森林公園。水稻種子：淮兩優(yōu)608，保存于江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室。

1.1.2 試劑 三氯乙酸、無水乙醇、硝酸等均購自西隴化工股份有限公司；濃硫酸、蒽酮、3，5-二硝基水楊酸等均購自國藥集團化學試劑有限公司；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、3，5-二硝基水楊酸等均購自上海藍季科技發(fā)展有限公司；其他試劑均為分析純。儀器：JW-3022HR型高速冷凍離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-250A生化培養(yǎng)箱，韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；L6-紫外可見光光度計、UV765-紫外可見光光度計，上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)抗N2粗提物制備 農(nóng)抗N2粗提物原液：將培養(yǎng)7 d的鏈霉菌N2孢子刮入30 mL帶玻璃珠的無菌蒸餾水中，震蕩20 min后移取1 mL孢子懸液于裝有50 mL種子培養(yǎng)液（蔗糖20 g，玉米淀粉10 g，玉米漿10 g，（NH4）2SO41 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，MnSO40.01 g，ZnSO40.01 g，H2O 1 L，pH7.2-7.4，121℃滅菌30 min）的250 mL三角瓶中，160 r/min、30℃振蕩培養(yǎng)72 h即得鏈霉菌N2種子液。種子液按10%的接種量轉接至含500 mL發(fā)酵培養(yǎng)液（蔗糖40 g，玉米淀粉20 g，玉米漿20 g，黃豆餅粉10 g，（NH4）2SO42 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，MnSO40.01 g，ZnSO40.01 g，H2O 1 L，pH7.2-7.4，121℃滅菌30 min）的2 L三角瓶中，160 r/min、30℃培養(yǎng)一周即為鏈霉菌N2發(fā)酵液；鏈霉菌N2發(fā)酵液經(jīng)兩倍體積乙醇（純度≥90%）浸提至少24 h后4 000 r/min離心棄除菌體，上清液經(jīng)旋轉蒸發(fā)器濃縮后于10 000 r/min離心10 min，保留上清液，最后用0.22 μm濾膜過濾除菌即得無菌農(nóng)抗N2粗提物原液。用無菌蒸餾水稀釋農(nóng)抗N2粗提物原液制成不同濃度藥液，浸種備用。

1.2.2 水稻種子處理及其萌發(fā)指標測定［4，20，21］水稻種子催芽：75%酒精表面消毒3 min，流水沖洗2 min；28℃避光浸泡12 h后分別用50 mL濃度為0.23、0.58、1.15、2.88、5.77、11.53和23.06 μg/mL的農(nóng)抗N2粗提物繼續(xù)浸種24 h，以蒸餾水為空白CK對照。每皿15粒種子，設7個重復。置于光照培養(yǎng)箱（光周期12 h，溫度28℃）中催芽，每天觀察并記錄萌發(fā)情況，第3天記錄發(fā)芽勢，連續(xù)觀察7 d，以連續(xù)2 d無種子萌發(fā)為催芽終期（以幼芽達到種子長度一半，幼根與種子等長為萌發(fā)標準）。催芽終止后測量株高、根長，記錄幼根、幼苗、籽粒干重并計算發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、貯藏物質運轉率等種子萌發(fā)指標。另取8份等量水稻種子按以上消毒、浸種、催芽方式7 d后取胚乳用于可溶性蛋白、可溶性總糖含量和淀粉酶活性的測定。

萌發(fā)指標的測定：幼苗株高、根長用毫米刻度尺進行測量；

發(fā)芽勢（GE）=（3 d內正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%；

發(fā)芽率（GP）=（7 d內正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%；

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑Gt/Dt（Gt表示在第7天的發(fā)芽數(shù)；Dt代表相應的發(fā)芽天數(shù)）；

活力指數(shù)（VI）=GI×S（GI是發(fā)芽指數(shù)；S是一定時期內幼苗質量或幼苗長度）；

貯藏物質運轉率（TR）=［（胚芽+胚根）干質量/（胚芽+胚根+籽粒）干質量］×100%。

1.2.3 淀粉酶活性、可溶性蛋白含量及可溶性總糖含量的測定 胚乳粗提物制備：稱取1.0 g催芽終止后的水稻種子，去根芽與穎殼后加入0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH5.6），于冰浴中研磨成勻漿，倒入10 mL離心管中并用緩沖液定容至刻度，混勻后于25℃下靜置15-20 min（每隔3 min振蕩一次），經(jīng)4 000 r/min離心15 min后取上清液即為胚乳粗提物，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

測定相關酶活性及物質含量：采用3，5-二硝基水楊酸比色法［22］測定淀粉酶活力，考馬斯亮藍法［23］測定可溶性蛋白含量，蒽酮法［24］測定可溶性總糖含量。

1.2.4 丙二醛含量測定 幼苗粗提液制備：挑選長勢相同、催芽終止后的水稻種子幼苗1.0 g，置于預冷研缽中加入10 mL 10%三氯乙酸和少量石英砂冰浴中研磨成勻漿。置于4℃，4 000 r/ min離心10 min后取上清液即為MDA粗提液，4℃?zhèn)溆谩?/p>

丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法［25］測定，按公式：MDA（mmoL/g·FW）=［6.452×（D532-D600）-0.559×D450］×Vt/Vs×FW計算丙二醛含量；式中：Vt為提取液總體積（mL）；Vs為測定用提取液總體積（mL）；FW為樣品鮮重（g）。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Excel 2010、DPS 7.05、Origin 9.0和Adobe Photoshop CS5進行數(shù)據(jù)處理、繪圖及顯著性分析。

2 結果

2.1 農(nóng)抗N2粗提物對水稻種子萌發(fā)指標的影響

將不同濃度農(nóng)抗N2粗提物浸種對水稻種子萌發(fā)指標進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。由表1可知，水稻種子經(jīng)濃度為0.23 μg/mL至1.15 μg/mL農(nóng)抗N2粗提物處理后，活力指數(shù)VI顯著提高，其余各項萌發(fā)指標也均高于對照組，但差異不顯著；且于0.58 μg/mL時效果最佳，幼苗株高、根長、GE、GP、GI、VI和TR 7項萌發(fā)指標較對照組分別提高了5.25%、14.31%、26.08%、15.62%、16.97%、31.46%和8.25%。隨著處理濃度的升高，各項指標呈下降趨勢；當處理濃度高于2.88 μg/mL后除幼苗株高略高于對照組，其他指標均受抑制，尤以GP和TR差異顯著，相比對照組分別降低了25.00%和50.19%。當處理濃度高于或等于11.53 μg/mL時表現(xiàn)出顯著的抑制效果。綜上可知，農(nóng)抗N2粗提物對水稻種子萌發(fā)的作用主要表現(xiàn)為低促高抑（圖1），活力指數(shù)相比對照組，差異顯著，說明活力指數(shù)較其他指標對農(nóng)抗N2粗提物更為敏感，適宜濃度農(nóng)抗N2粗提物浸種有利于增強種子活力，促進種子萌發(fā)。

2.2 農(nóng)抗N2粗提物對水稻種子胚乳中淀粉酶活性的影響

不同濃度農(nóng)抗N2粗提物對水稻種子淀粉酶活性的影響結果（圖2）表明，α、β-淀粉酶活力與農(nóng)抗N2粗提物浸種濃度呈負相關，在0.23-1.15 μg/mL時，淀粉酶總活力相比對照組依次增強了65.23%、28.27%和27.35%，差異顯著；但浸種濃度高于2.88 μg/mL后顯著抑制了α-淀粉酶和β-淀粉酶的活力，

表1 不同濃度農(nóng)抗N2粗提物處理對水稻種子萌發(fā)指標的影響

圖1 農(nóng)抗N2粗提物浸種對水稻幼苗形態(tài)的影響

圖2 農(nóng)抗N2粗提物對水稻種子淀粉酶活性的影響

因此我們可以推測，一定濃度農(nóng)抗N2粗提物浸種有利于增強水稻種子中的淀粉酶活力，保證萌發(fā)過程中淀粉的轉化，促進水稻種子萌發(fā)。

2.3 農(nóng)抗N2粗提物對種子胚乳中可溶性蛋白和總糖的影響

農(nóng)抗N2粗提物對水稻種子催芽終止后胚乳中可溶性蛋白和總糖含量的影響，結果（圖3）表明，低濃度農(nóng)抗N2粗提物處理組中可溶性蛋白和總糖含量隨著農(nóng)抗N2粗提物濃度的增加先升高后降低，且可溶性蛋白和總糖含量分別在處理濃度為0.58 μg/mL與1.15 μg/mL時達到最高，相比對照組分別提高了6.49%和30.70%，差異顯著，隨后開始降低。在處理濃度分別高于2.88 μg/mL和5.77 μg/mL后胚乳中的可溶性蛋白和總糖均顯著低于對照組，同樣表現(xiàn)為低促高抑。由此可以說明，適宜濃度農(nóng)抗N2粗提物浸種催芽有利于種子增強物質代謝能力，為水稻種子的萌發(fā)奠定物質和能量基礎。

圖3 農(nóng)抗N2粗提物對水稻種子可溶性總糖和蛋白質含量的影響

2.4 農(nóng)抗N2粗提物對水稻種子催芽終止后丙二醛含量的影響

農(nóng)抗N2粗提物對水稻種子丙二醛MDA含量的影響，結果（圖4）顯示，農(nóng)抗N2粗提物浸種處理水稻種子均能顯著降低種子中MDA的含量，相較對照組分別降低了21.58%、21.97%、23.94%、13.32%、10.51%和17.76%，差異顯著。當處理濃度為0.23-5.77 μg/mL時，MDA含量先降低（0.23-1.15 μg/mL）后升高（≥2.88 μg/mL），且在1.15 μg/mL時期含量最低1.12 mmoL/g·FW，差異顯著。由此說明，農(nóng)抗N2浸種處理能有效緩解水稻種子膜質過氧化，有利于提高水稻種子的組織保護能力。

圖4 農(nóng)抗N2粗提物對水稻種子MDA含量的影響

3 討論

水稻種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)是評價和反映水稻種子萌發(fā)速度、整齊度和幼苗生長狀況的重要指標，指數(shù)越大表明種子發(fā)芽速度快、整齊度高、長勢好［26］。實驗結果表明，0.23 μg/mL至1.15 μg/mL范圍內的農(nóng)抗N2粗提物浸種能有效提高種子發(fā)芽率，促進種子快速發(fā)芽，顯著增強種子活力，幼苗長勢良好；當處理濃度達到5.77 μg/mL后幼苗發(fā)芽勢弱，根、芽均受抑制，且發(fā)芽率、活力指數(shù)和貯藏物質運轉率顯著低于對照組。此外，貯藏物質運轉率TR可以反映種子對貯藏物質的運轉效率［27］。由此可以推測，農(nóng)抗N2粗提物的濃度高于5.77 μg/mL后貯藏物質轉運效率顯著降低是造成種子發(fā)芽率、活力指數(shù)等顯著下降的主要原因，與陳燕妮等［21］的研究結果一致。綜上可知，適宜濃度農(nóng)抗N2粗提物浸種可促進種子萌發(fā)和提高幼苗素質，高濃度對種子活力有抑制作用。

水稻等禾本類作物種子胚乳中的貯藏物質主要是淀粉，胚乳中的淀粉酶是種子萌發(fā)初期物質和能量代謝快速啟動的重要保障，為ATP與蛋白質的合成分別提供底物和碳骨架，是幼苗形態(tài)建成與生長發(fā)育的重要生理基礎［28］。除淀粉外，種子中可溶性總糖也是常見的碳水化合物，主要有葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖等，是萌發(fā)過程的直接呼吸底物和重要養(yǎng)分來源，對幼胚的初期生長具有重要作用；貯藏蛋白質是種子萌發(fā)過程中用于胚部新細胞建立的主要物質基礎［29，30］，同時，植物可利用自身可溶性糖與可溶性蛋白等滲透調節(jié)物質，有效維持或降低植物體內細胞滲透勢，在保護蛋白質分子、抵御氧化脅迫等方面具有重要作用［31，32］。試驗結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)濃度0.23-1.15 μg/mL的農(nóng)抗N2粗提物浸種處理后種子胚乳中可溶性蛋白與總糖均有提高，且分別在0.58和1.15 μg/mL時達到最大，相比對照差異顯著；同時各類淀粉酶活性也得到顯著提高，胚乳中的淀粉酶活性與可溶性蛋白、總糖的含量變化趨勢基本一致，一定程度上呈正相關，與劉晶等［33］的研究結果相似。因此可以說明，0.23-1.15 μg/mL的農(nóng)抗N2粗提物浸種能顯著激活淀粉酶活性，促進淀粉水解，增強種子萌發(fā)過程的物質能量代謝能力，進而顯著提高可溶性總糖與蛋白質的含量；有助于可溶性糖和可溶性蛋白通過維持種子體內細胞滲透勢，增強幼苗的抗逆性。

丙二醛（MDA）是植物器官脂質過氧作用產(chǎn)生的一種細胞毒素，不僅會加劇脂質膜的損傷，也會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，其含量直接反映了機體脂質的過氧化程度，間接地反映了細胞的損傷程度［34，35］。實驗結果表明，0.23-5.77 μg/mL濃度范圍農(nóng)抗N2粗提物浸種處理能顯著降低丙二醛含量，且其含量先降后升，因此可以推斷，適宜濃度的農(nóng)抗N2粗提物浸種能有效保護種子細胞免遭質膜損傷，提高幼苗的逆境生存能力。綜上可知，鏈霉菌新種Streptomyces sp. N2作為一株生防放線菌，可借助微生物發(fā)酵手段制備出高效、廣譜的抗真菌活性物質，實現(xiàn)其在生物防治種（土）傳病害中生防應用，為開發(fā)新型種子處理劑奠定堅實的基礎。

4 結論

適宜濃度（0.23-1.15 μg/mL）農(nóng)抗N2粗提物浸種有利于增強水稻細胞代謝強度、促進根芽生長、加快物質轉運效率，提高種子發(fā)芽率，提高幼苗抗逆性。高濃度（≥2.88 μg/mL）浸種雖有利于緩解膜質過氧化，但淀粉酶活力受到顯著抑制，因無法滿足種子萌發(fā)所需的物質和能量，而抑制種子萌發(fā)。綜上，適宜濃度的農(nóng)抗N2粗提物浸種有利于水稻種子萌發(fā)，但是否其中的抗真菌活性物質起主導作用，有待進一步深入研究。

參 考 文 獻

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（責任編輯 朱琳峰）

Effects of Novel Antifungalmycin N2 Crude Extract from Streptomyces sp. N2 on Germination of Rice Seed

WU Zhi-ming1，2ZHONG Min1，2LU Cheng-jian1ZHU Man-ning1DU Qi-feng1LI Kun-tai1，2
（1. College of Biological Sciences and Engineering，Jiangxi Agriculture University，Nanchang 330045；2. Jiangxi Engineering Laboratory for the Development and Utilization of Agricultural Microbial Resources，Nanchang 330045）

To investigate the effects of a novel antifungalmycin N2（AN2）crude extract from Streptomyces sp. N2 on germination of rice seed，the multi-index of germination，amylase activity，soluble sugar contents，soluble protein contents and the contents of malondialdehyde（MDA）in rice seeds were measured using ultraviolet-visible spectrophotometry. The results showed that the influence of AN2 on each index was correlated with the treated AN2 concentration. It was found that AN2 at low concentration promoted rice seed germination，while it at high concentrations had an inhibitory effect. When treated with 0.23-1.15 μg/mL of AN2，the characteristics of seed germination was effectively improved，and the growth of seedlings was significantly promoted，especially under the treatment with the concentration of 0.58 μg/mL. In addition，the content of soluble sugar，soluble proteins and amylase activity of optimal concentration treated groups was increased significantly than control group by 28.27%，7.73% and 6.49%，respectively. In the 0.23-1.15 μg/mL of AN2 treatment group，the MDA content decreased significantly. Therefore，proper concentration treatments promote germination capacity，improve enhance material metabolism and enhance ability of osmotic regulation.

Streptomyces sp. N2；rice；seed germination；physiological characteristics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0337

2017-04-26

國家自然科學基金項目（31760546），江西省研究生創(chuàng)新專項資金資助項目（YC2016-S198），江西農(nóng)業(yè)大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃項目（201610410022），江西省青年科學家培養(yǎng)對象計劃項目（20142BCB23025），江西省教育廳科技項目（GJJ160389）

吳志明，男，碩士研究生，研究方向：植物真菌病害的生物防治；E-mail：982894651@qq.com

李昆太，男，博士，教授，研究方向：微生物代謝調控；E-mail：atai78@sina.com