利用定向進(jìn)化提高基因工程大腸桿菌的甲醇利用能力

王曉璐王鈺劉嬌鄭平路福平

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308；3. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

利用定向進(jìn)化提高基因工程大腸桿菌的甲醇利用能力

王曉璐1，2，3王鈺2，3劉嬌2，3鄭平2，3路福平1

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308；3. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

甲醇是一種重要的有機(jī)化工原料，價(jià)格低廉，碳還原度高，在生物化工中是糖質(zhì)原料的理想替代原料。但是常用的工業(yè)微生物宿主如大腸桿菌不能利用甲醇作為碳源，這限制了甲醇在生物化工領(lǐng)域的應(yīng)用。通過(guò)表達(dá)甲醇脫氫酶、3-己酮糖-6-磷酸合成酶和6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中構(gòu)建可同化甲醇的核酮糖單磷酸途徑。以基因工程菌作為出發(fā)菌株，通過(guò)連續(xù)傳代和定向進(jìn)化引入隨機(jī)突變，突變株進(jìn)行以甲醇為碳源的壓力篩選，得到了2株可以利用甲醇生長(zhǎng)的突變株。在以甲醇為輔助碳源的培養(yǎng)基中，25113ΔfrmA/pZWM1-13號(hào)突變株較原始菌株25113ΔfrmA/pZWM1菌體生長(zhǎng)量增加27.6%。對(duì)25113ΔfrmA/ pZWM1-13號(hào)突變株進(jìn)行13C示蹤分析檢測(cè)蛋白質(zhì)合成氨基酸，結(jié)果表明氨基酸中13C比例有明顯提高。其中，甲硫氨酸13C標(biāo)記含量增加7.236%。因此，定向進(jìn)化有效地提高了基因工程大腸桿菌的甲醇利用效率。

甲醇；核酮糖單磷酸途徑；大腸桿菌；定向進(jìn)化

大腸桿菌（Escherichia coli）是常用的工業(yè)平臺(tái)菌株，其遺傳改造工具成熟、遺傳背景清楚，具有操作簡(jiǎn)單、繁殖迅速和易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，在生產(chǎn)過(guò)程中主要以葡萄糖、蔗糖和果糖為碳源，生產(chǎn)效益受季節(jié)變化、天氣狀況以及農(nóng)產(chǎn)品限制的影響。甲醇是一種重要的有機(jī)化工原料，價(jià)格低廉，來(lái)源廣泛，碳還原程度高，是生物化工中糖質(zhì)原料的理想替代品［1］。但E. coli等工業(yè)菌株不能利用甲醇作為碳源［2］，這限制了甲醇在生物化工領(lǐng)域的應(yīng)用。近年來(lái)，隨著甲醇工業(yè)產(chǎn)能過(guò)剩的情況日益嚴(yán)重，以及微生物利用甲醇機(jī)制研究的不斷深入，將甲醇利用途徑導(dǎo)入E. coli等工業(yè)菌株并賦予其甲醇利用能力成為可能［3］。

核酮糖單磷酸（Ribulose monophosphate，RuMP）途徑是目前研究較多的甲醇同化途徑之一，也是構(gòu)建人工甲醇利用菌最常用的途徑。RuMP途徑廣泛存在于甲基營(yíng)養(yǎng)菌［4］中，在甲醛濃度極低的情況下仍可高效捕獲游離的甲醛［5］。在RuMP途徑（圖1）中，甲醇首先被甲醇脫氫酶（Methanol dehydrogenase，MDH）氧化生成甲醛，甲醛和核酮糖-5-磷酸（Ribulose-5-phosphate，Ru5P）在3-己酮糖-6-磷酸合成酶（Hexulose-6-phosphate synthase，HPS）作用下縮合產(chǎn)生己酮糖-6-磷酸（Hexose-6-phosphate，H6P）；H6P在6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶（6-phospho-3-Hexuloisomerase，PHI）作用下異構(gòu)化生成果糖-6-磷酸（Fructose-6-phosphate，F(xiàn)6P）。F6P在磷酸果糖激酶（Phosphate fructose kinase，PFK）催化下生成果糖-1，6-二磷酸（Fructose-1，6-diphosphate，F(xiàn)16dP），F(xiàn)16dP隨后斷裂形成甘油醛-3-磷酸（Glyceraldehyde-3-phosphate，G3P）和二羥基丙酮磷酸（Dihydroxyacetone phosphate，DHAP），從而進(jìn)入糖酵解［6］。同時(shí)，一部分F6P通過(guò)一系列反應(yīng)再生甲醛同化的受體Ru5P［7］。由于RuMP途徑的所有反應(yīng)均是放能的，所以具有較高的甲醛同化效率［8］。

圖1 甲基芽孢桿菌（Bacillus methanolicus）代謝甲醇的RuMP途徑

為了賦予常用工業(yè)菌株利用甲醇的能力，多項(xiàng)研究試圖利用RuMP途徑改造平臺(tái)菌株，Müller［2］和Witthoff［9］等分別在E. coli和谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）中測(cè)試不同來(lái)源的MDH、HPS和PHI，擇優(yōu)組裝甲醇利用途徑，利用戊糖磷酸途徑再生甲醛受體Ru5P。兩組研究均使用了13C標(biāo)記的甲醇作為底物，通過(guò)胞內(nèi)代謝物質(zhì)譜分析，證明了基因工程菌株在休止細(xì)胞狀態(tài)下或利用葡萄糖生長(zhǎng)時(shí)，可同化少量的甲醇。Whitaker等［10］在E. coli中開(kāi)展了利用甲醇合成柚皮素的研究，通過(guò)使用酶活更高的MDH提高菌株利用甲醇的能力，但是仍需添加其他碳源，且13C標(biāo)記的代謝物分析表明柚皮素中僅有3.5%的碳來(lái)自甲醇，甲醇利用效率仍非常低。目前研究表明，僅將RuMP途徑導(dǎo)入工業(yè)菌株所構(gòu)建的基因工程菌不能利用甲醇作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。這可能是由于甲醇利用途徑關(guān)鍵酶的活性較低［11，12］，也可能是異源途徑與宿主內(nèi)生代謝途徑不匹配造成的［7，13］。目前對(duì)甲醇利用限制因素的解析仍不清晰，研究者難以開(kāi)展針對(duì)性的遺傳改造從而提高甲醇利用效率。

因此，采用定向進(jìn)化的方法，對(duì)人工甲醇利用菌株進(jìn)行進(jìn)化，可能是提高其甲醇利用效率的有效手段?；蚪M復(fù)制工程輔助的連續(xù)進(jìn)化（Genome replication engineering assisted continuous evolution，GREACE）［14］技術(shù)是一種利用基因組復(fù)制協(xié)助連續(xù)進(jìn)化來(lái)針對(duì)性提高微生物某種表型的手段。GREACE技術(shù)采用突變伴隨篩選的方法，利用修復(fù)矯正功能缺失的DNA聚合酶復(fù)合體（dnaQ基因突變體編碼），降低基因組復(fù)制過(guò)程中錯(cuò)配修復(fù)率，加大突變率，并有針對(duì)性的進(jìn)行突變株篩選。GREACE技術(shù)已成功將E. coli對(duì)丁醇耐受性提高100倍，對(duì)醋酸耐受性提高8倍［14］，是針對(duì)微生物耐受性進(jìn)化的有效方法。

本研究在E. coli中組合MDH、HPS與PHI構(gòu)建RuMP途徑，結(jié)合GREACE技術(shù)針對(duì)工程菌株外源導(dǎo)入基因與基因組進(jìn)行定向進(jìn)化，通過(guò)甲醇為唯一碳源的壓力篩選得到可以利用甲醇生長(zhǎng)的突變株，將突變株與原始菌株進(jìn)行生長(zhǎng)驗(yàn)證與13C標(biāo)記示蹤分析，確定甲醇進(jìn)入突變株代謝流并合成細(xì)胞碳骨架，旨在為工業(yè)微生物提高甲醇利用能力提供有效的解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 研究工作中所使用的E. coli質(zhì)粒提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司、基因合成由金唯智公司完成；酵母粉和胰蛋白胨購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；瓊脂粉、甘氨酸、異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl-β-dthiogalactopyranoside，IPTG）、卡那霉素（Kanamycin，Kan）、氨芐霉素（Ampicillin，Amp）、氯霉素（Chloroamphenicol，Cm）購(gòu)自Solarbio公司；其他生化試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨、10 g/L NaCl、5 g/L酵母粉，pH7.0；M9液體培養(yǎng)基：17.1 g/L Na2HPO4·12H2O、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、1.0 g/L NH4Cl、0.24 g/L MgSO4與0.011 g/L CaCl2，pH7.0；M9輔助培養(yǎng)基：17.1 g/L Na2HPO4· 12H2O、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、1.0 g/L NH4Cl、0.24 g/L MgSO4與0.011 g/L CaCl2、1 g/L酵母粉，pH 7.0。

1.1.3 質(zhì)粒與菌株 本研究所用的質(zhì)粒與菌株由表1所示。

1.2 方法

1.2.1 基因mdh3、hps和phi的表達(dá) 將pZWM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E. coli BW25113ΔfrmA中，將轉(zhuǎn)化菌株株過(guò)夜活化后，以1%的接種量將含有pZWM1質(zhì)粒的E. coli BW25113ΔfrmA接種于30 mL LB液體培養(yǎng)基（100 mg/L Amp、50 mg/L Kan）中，37℃ 220 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6，加入1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)mdh3、hps和phi基因表達(dá)，37℃ 220 r/min培養(yǎng)5 h進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將30 mL菌液高速離心棄上清，菌體用3 mL磷酸鹽緩沖液重懸，冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎細(xì)胞，破碎條件為：功率40%，工作1 s停3s，破碎時(shí)間15 min。破碎后溶液于4℃ 12 000 r/min離心10 min，上清液即為可溶性的重組酶液，加入4×NuPAGE?LDS Sample Buffer（Thermo Fisher公司）充分混合，沸水浴15 min，利用NuPAGE 4%-12% Bis-Tris預(yù)制膠（Thermo Fisher公司）進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測(cè)。

表1 本研究所用的質(zhì)粒與菌株

1.2.2 酶活測(cè)定

1.2.2.1 MDH酶活測(cè)定 MDH活性檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)［2］，MDH催化甲醇的氧化反應(yīng)伴隨著煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）的生成，因此可以通過(guò)檢測(cè)NADH的生成檢測(cè)MDH酶活。酶活測(cè)定方法為：將100 μL反應(yīng)體系（含有0.5 mmol/L NAD+、1 mol/L甲醇、5 mmol/L MgSO4和50 mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液）在37℃下孵育10 min，加入37℃預(yù)熱的100 μL粗酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，340 nm分光光度計(jì)下測(cè)定催化反應(yīng)引起的NADH的增加。一個(gè)MDH酶活力（U）定義為：在37℃反應(yīng)條件下，每分鐘將1 μmol NAD+還原為NADH所需的酶量。每個(gè)反應(yīng)3個(gè)平行樣，取平均值作為最終酶活值，對(duì)照反應(yīng)為在相同條件下加入等量空質(zhì)粒菌株的酶液。MDH比酶活力按照公式1計(jì)算，蛋白濃度根據(jù)PierceTMBCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher公司）測(cè)定。

1.2.2.2 HPS和PHI酶活測(cè)定 HPS與PHI活性檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)［9］，HPS催化甲醛與Ru5P生成H6P，后者被PHI催化生成F6P，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化F6P生成葡萄糖-6-磷酸（Glucose 6-phosphate，G6P），G6P被磷酸葡萄糖脫氫酶催化生成葡萄糖酸-6-磷酸同時(shí)生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH），通過(guò)檢測(cè)NADPH的生成檢測(cè)HPS與PHI的酶活力［9］。酶活測(cè)定方法為：將100 μL反應(yīng)體系（5 mmol/L甲醛、5 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L NADP+、5 mmol/L R5P、2 U磷酸核糖異構(gòu)酶、5 U磷酸葡萄糖脫氫酶、5 U磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、50 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液）在37℃下孵育15 min，使R5P與磷酸核糖異構(gòu)酶充分反應(yīng)生成底物Ru5P，加入37℃預(yù)熱的100 μL粗酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，340 nm分光光度計(jì)下測(cè)定催化反應(yīng)引起的NADPH的增加。一個(gè)HPS-PHI（U）定義為：在37℃反應(yīng)條件下，每分鐘將1 μmol NADP+還原為NADPH所需的酶量。每個(gè)反應(yīng)均3個(gè)平行樣，取平均值作為最終酶活值，對(duì)照反應(yīng)為在相同條件下加入等量空質(zhì)粒菌株的酶液。HPS-PHI偶聯(lián)比酶活力按照公式2計(jì)算，蛋白濃度根據(jù)PierceTMBCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher公司）測(cè)定。

1.2.3 定向進(jìn)化及突變株篩選 菌株25113ΔfrmA/ pZWM1&pKD46-Cm-dnaQ接入5 mL LB培養(yǎng)基中，30℃ 220 r/min培養(yǎng)12 h，將培養(yǎng)物作為種子接入20 mL LB傳代培養(yǎng)基（100 mg/L Amp、50 mg/L Kan、10 mg/L Cm、1 g/L阿拉伯糖）中，阿拉伯糖誘導(dǎo)dnaQ基因表達(dá)進(jìn)行第一輪突變，初始OD6000.05，30℃ 220 r/min培養(yǎng)12 h。取2 mL培養(yǎng)好的菌液接入20 mL LB傳代培養(yǎng)基中進(jìn)行第2輪突變，30℃220 r/min培養(yǎng)12 h，將剩余菌液用新鮮的M9培養(yǎng)基洗滌后轉(zhuǎn)接到20 mL M9誘導(dǎo)培養(yǎng)基（5 g/L葡萄糖、50 mg/L Amp、0.5 mmol/L IPTG、20 mmol/L核糖）中，其中IPTG誘導(dǎo)RuMP途徑關(guān)鍵酶表達(dá)，核糖為RuMP途徑底物Ru5P提供前體，初始OD6000.6，37℃ 220 r/min培養(yǎng)5 h。培養(yǎng)后菌液用新鮮M9洗滌后轉(zhuǎn)接到100 mL M9篩選培養(yǎng)基（0.1 mmol/L IPTG、10 g/L甲醇）中篩選有益突變株，檢測(cè)初始OD600，每24 h檢測(cè)OD600。后續(xù)傳代步驟篩選步驟與第二輪相同，篩選到有明顯生長(zhǎng)的菌株進(jìn)行分純培養(yǎng)，步驟與第二輪菌株篩選步驟相同。

1.2.4 甲醇為輔助碳源生長(zhǎng)驗(yàn)證 將菌株25113ΔfrmA/pTrc99A、25113ΔfrmA/pZWM1、25113ΔfrmA/pZWM1-13、25113ΔfrmA/pZWM1-14接入5 mL LB培養(yǎng)基中，30℃ 220 r/min培養(yǎng)12 h，將培養(yǎng)物作為種子接入M9輔助培養(yǎng)基（10 g/L甲醇、50 mg/L Amp、1 mmol/L IPTG）中，初始OD6000.05，37℃ 220 r/min培養(yǎng)，每3 h檢測(cè)OD600。

1.2.513C標(biāo)記代謝物培養(yǎng) 菌株25113ΔfrmA/ pZWM1-13按照定向進(jìn)化第二輪誘導(dǎo)篩選步驟進(jìn)行培養(yǎng)2 d，第3天將菌體倒入50 mL離心管中，8 000 r/min離心10 min。去上清液，菌體用1.5 mL 6 mol/L HCl重懸并轉(zhuǎn)移到有膠圈的氣相瓶中，100℃水解蛋白質(zhì)24 h，反應(yīng)結(jié)束后20 000 r/min離心8 min，上清液利用真空離心濃縮儀（Eppendorf公司）在60℃下干燥6-8 h。干燥樣品溶于20 μL 50%乙腈，快速震蕩混勻后12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行液相質(zhì)譜檢測(cè)檢測(cè)。

1.2.613C標(biāo)記代謝物分析 檢測(cè)系統(tǒng)由液相色譜（Shimdzu LC-30A）和質(zhì)譜儀（Triple TOF 5600）串聯(lián)組成，液相系統(tǒng)條件如下：色譜柱為SeQuant ZIC-HILIC（100 mm×2.1 mm，3.5 μm粒徑，德國(guó)默克），A相：10 mmol/L醋酸銨、10 mmol/L氫氧化銨、5%乙腈；B相：100%乙腈，液相色譜程序：0 min 3 min，95% B；3 min 6 min，95%-60% B；6 min 25 min，60%-50% B；25 min-30 min，50% B；30 min 30.5 min；50%-95% B；30.5 min 38 min，95% B；色譜柱重新平衡10 min。流速為0.3 mL/min，柱溫為常溫（25℃），進(jìn)樣量為5 μL。本法使用Triple TOF 5600串聯(lián)質(zhì)譜儀，采用電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子檢測(cè)模式。質(zhì)譜主要參數(shù)如下：霧化氣（GS）55，氣簾氣（CUR）35，噴霧電壓（ISVF）-4 500 V，離子源溫度（TEM）600℃。液相質(zhì)譜結(jié)果利用軟件PeakView進(jìn)行分析，根據(jù)氨基酸同位素峰面積進(jìn)行積分，13C標(biāo)記比例按照公式3進(jìn)行計(jì)算，其中mi-1為氨基酸中（i-1）個(gè)碳被13C標(biāo)記占全部碳原子的比例，i為氨基酸碳原子總數(shù)。計(jì)算得到比例參照文獻(xiàn)［17］進(jìn)行除噪分析。

2 結(jié)果

2.1 基因mdh、hps和phi的表達(dá)

菌株25113ΔfrmA/pZWM1攜帶甲醇利用途徑的相關(guān)基因mdh、hps和phi，3個(gè)基因都受IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Ptrc的控制?；騧dh全長(zhǎng)1 158 bp，MDH分子量約為42 kD；基因hps全長(zhǎng)636 bp，HPS分子量約為23 kD；基因phi全長(zhǎng)564 bp，PHI分子量約為20 kD。重組菌株經(jīng)IPTG在37℃誘導(dǎo)5 h后粗酶液SDS-PAGE，結(jié)果如圖2所示，與攜帶空質(zhì)粒的對(duì)照菌株25113ΔfrmA/pTrc99A相比，菌株25113ΔfrmA/pZWM1的粗酶液在40-50 kD和25 kD處有明顯蛋白條帶，表明MDH、HPS和PHI均為可溶性蛋白，但可能由于HPS與PHI分子量較為接近，SDS-PAGE無(wú)法區(qū)分兩個(gè)蛋白。

圖2 SDS-PAGE檢測(cè)MDH、HPS和PHI表達(dá)水平

2.2 MDH、HPS和PHI酶活測(cè)定

為檢測(cè)外源表達(dá)的MDH、HPS和PHI的酶活，對(duì)菌株25113ΔfrmA/pZWM1粗酶液的MDH、HPS和PHI酶活進(jìn)行測(cè)定。重組菌株25113ΔfrmA/pZWM1粗酶液中MDH比酶活為0.64±0.038 mU/mg，HPSPHI偶聯(lián)比酶活為38.99±2.77 mU/mg。

2.3 重組菌株定向進(jìn)化及篩選

為獲得有效利用甲醇進(jìn)行生長(zhǎng)的菌株，利用GREACE技術(shù)對(duì)菌株25113ΔfrmA/pZWM1進(jìn)行定向進(jìn)化，將攜帶dnaQ突變體的pKD46-Cm-dnaQ質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到25113ΔfrmA/pZWM1中，獲得菌株25113ΔfrmA/pZWM1&pKD46-Cm-dnaQ。進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的有益突變株，會(huì)使培養(yǎng)物中菌體量有所提高。5到13輪傳代培養(yǎng)結(jié)果如圖3所示，ΔOD600為在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后培養(yǎng)物OD600與初始OD600之差，第5輪與第6輪傳代培養(yǎng)物培養(yǎng)2 d后菌體OD600均呈現(xiàn)不同程度的下降，第6輪傳代培養(yǎng)物培養(yǎng)2 d后菌體量下降5.3%，表明初期工程菌不能在篩選培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；從第7輪傳代培養(yǎng)后菌體OD600均呈現(xiàn)不同程度的上升，第10輪傳代培養(yǎng)物利用甲醇生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)明顯，菌體量增加78.2%。繼續(xù)傳代，細(xì)胞利用甲醇的生長(zhǎng)減弱。因此從第10輪培養(yǎng)物中篩選利用甲醇生長(zhǎng)的突變株。

圖3 25113ΔfrmA/pZWM1連續(xù)傳代獲得的培養(yǎng)物利用甲醇生長(zhǎng)情況

2.4 突變株二次篩選及生長(zhǎng)測(cè)試

菌株25113ΔfrmA/pZWM1第10輪培養(yǎng)物利用甲醇時(shí)有微弱生長(zhǎng)現(xiàn)象，對(duì)第10代培養(yǎng)物進(jìn)行三區(qū)劃線，挑取15個(gè)單克隆進(jìn)行利用甲醇的生長(zhǎng)測(cè)試。如圖4所示，15個(gè)突變株中，13號(hào)突變株培養(yǎng)2 d后菌株OD600與原始接菌OD600之差為0.124，菌體量增加55.3%；14號(hào)突變株培養(yǎng)2 d后菌株OD600與原始接菌OD600之差為0.14，菌體量增加82.4%。結(jié)果表明，13號(hào)和14號(hào)突變株較其它突變株有明顯生長(zhǎng)，將這兩株突變株分別命名為25113ΔfrmA/pZWM1-13和25113ΔfrmA/pZWM1-14。

2.5 突變株利用甲醇作為輔助碳源生長(zhǎng)驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證突變株利用甲醇的生長(zhǎng)情況，使用1 g/L酵母粉作為碳源，并加入10 g/L甲醇作為輔助碳源培養(yǎng)突變株25113ΔfrmA/pZWM1-13和25113ΔfrmA/pZWM1-14，將進(jìn)化出發(fā)菌株25113ΔfrmA/pZWM1與攜帶空載質(zhì)粒的菌株25113ΔfrmA/pTrc99A作為對(duì)照。如圖5所示，重組菌株25113ΔfrmA/pZWM1生長(zhǎng)到OD600為0.58后停滯生長(zhǎng)，對(duì)照菌株25113ΔfrmA/pTrc99A生長(zhǎng)到OD600到0.64后停滯生長(zhǎng)，菌株25113ΔfrmA/pZWM1生長(zhǎng)減弱的現(xiàn)象可能是由于大量表達(dá)外源基因造成的。突變株25113ΔfrmA/pZWM1-13生長(zhǎng)到OD600為0.75后停滯生長(zhǎng)，較出發(fā)菌株OD600增加27.6%；突變株25113ΔfrmA/pZWM1-14生長(zhǎng)到OD600為0.70后停滯生長(zhǎng)，較出發(fā)菌株OD600增加21.2%。通過(guò)生長(zhǎng)曲線驗(yàn)證結(jié)果表明，相較于攜帶空質(zhì)粒的對(duì)照菌株25113ΔfrmA/pTrc99A和進(jìn)化的出發(fā)菌株25113ΔfrmA/pZWM1，突變株25113ΔfrmA/pZWM1-13和25113ΔfrmA/pZWM1-14在利用甲醇作為輔助碳源時(shí)可以生產(chǎn)更多的生物量，說(shuō)明進(jìn)化獲得的突變株利用甲醇的細(xì)胞生長(zhǎng)得到提高。

圖5 25113ΔfrmA/pZWM1原始菌株與突變株利用甲醇作為輔助碳源的生長(zhǎng)曲線

2.613C標(biāo)記代謝物分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證突變株的甲醇利用情況，我們使用13C 標(biāo)記甲醇培養(yǎng)突變株25113ΔfrmA/pZWM1-13，之后將菌體進(jìn)行酸水解［18］，對(duì)所得到的氨基酸進(jìn)行液相質(zhì)譜分析。質(zhì)譜結(jié)果除噪后分析同位素含量的差異，結(jié)果如圖6所示。12C甲醇培養(yǎng)的菌株（圖6-A）與13C基礎(chǔ)培養(yǎng)的菌株（圖6-B）氨基酸同位素分布有明顯差異，與12C甲醇培養(yǎng)菌株相比，13C甲醇培養(yǎng)菌株丙氨酸（Alanine，Ala）13C標(biāo)記含量增加0.702%，天冬氨酸（Aspartic acid，Asp）13C標(biāo)記含量增加1.132%，谷氨酸（Glutamic acid，Glu）13C標(biāo)記含量增加0.211%，苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）13C標(biāo)記含量增加0.379%，組氨酸（Histidine，His）13C標(biāo)記含量增加1.163%，甘氨酸（Glycine，Gly）13C標(biāo)記含量增加0.667%，賴氨酸（Lysine，Lys）13C標(biāo)記含量增加1.029%，絲氨酸（Serine，Ser）13C標(biāo)記含量增加1.743%，酪氨酸（Tyrosine，Tyr）13C標(biāo)記含量增加1.435%，甲硫氨酸（Methionine，Met）13C標(biāo)記含量增加7.236%，纈氨酸（Valine，Val）13C標(biāo)記含量增加1.359%。結(jié)果表明，13C培養(yǎng)菌株氨基酸同位素比例與12C培養(yǎng)菌株相比有明顯增加，表明甲醇進(jìn)入細(xì)胞代謝并參與細(xì)胞骨架合成。

圖6 突變株25113ΔfrmA/pZWM1-13代謝12C標(biāo)記甲醇（A）與13C標(biāo)記甲醇（B）時(shí)生物量中同位素含量分析

3 討論

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者認(rèn)識(shí)到甲醇生物轉(zhuǎn)化利用的重大意義，對(duì)甲醇利用途徑的研究也越來(lái)越深入［7，19］。借助于已解析的甲醇利用途徑和先進(jìn)的代謝工程技術(shù)手段，多個(gè)課題組采用RuMP途徑對(duì)常用工業(yè)平臺(tái)菌株進(jìn)行了改造，試圖賦予其甲醇利用能力。通過(guò)異源表達(dá)mdh、hps和phi基因，基因工程菌株可以利用少量的甲醇，但距離利用甲醇作為主要碳源甚至唯一碳源生長(zhǎng)還有很大距離［2，9，10，20］。本研究以E. coli為底盤菌，結(jié)合代謝工程與定向進(jìn)化的技術(shù)手段，在E. coli胞內(nèi)構(gòu)建RuMP途徑的基礎(chǔ)上開(kāi)展GREACE進(jìn)化，獲得了利用甲醇生長(zhǎng)更優(yōu)的突變株，為下一步限制因素解析和菌種優(yōu)化提供了新的研究對(duì)象和思路。

打通甲醇利用途徑是構(gòu)建高效人工甲醇利用菌株的第一步，要提高工程菌株的甲醇利用效率，需要有明確的靶點(diǎn)，但是目前對(duì)甲醇利用限制因素的了解還非常少［7］。在這種情況下，采用定向進(jìn)化的方式，優(yōu)先獲得甲醇利用能力得到提高的菌株，可以為解析甲醇利用的限制因素提供良好的模型，指導(dǎo)人工甲醇利用菌株的改造和優(yōu)化。GREACE進(jìn)化通過(guò)引入dnaQ基因突變體，使菌株DNA復(fù)制過(guò)程中的矯正功能缺陷，通過(guò)連續(xù)傳代不斷在菌株外源基因與基因組上積累隨機(jī)突變［14］，在此過(guò)程中，每一代培養(yǎng)物均可能出現(xiàn)針對(duì)甲醇生長(zhǎng)的有益突變和有害突變。針對(duì)導(dǎo)入RuMP途徑的E. coli不能在甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行生長(zhǎng)這一特點(diǎn)，將傳代培養(yǎng)物進(jìn)行以甲醇為唯一碳源的壓力篩選，進(jìn)一步對(duì)有益突變進(jìn)行富集。在對(duì)菌株25113ΔfrmA/pZWM1進(jìn)行GREACE進(jìn)化過(guò)程中，每一代培養(yǎng)物在利用甲醇時(shí)具有不同的細(xì)胞生長(zhǎng)情況，這可能是由于GREACE引入突變的隨機(jī)性導(dǎo)致的。一些對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)或甲醇代謝有害的突變，可能會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。第10代培養(yǎng)物利用甲醇時(shí)體現(xiàn)出最優(yōu)的細(xì)胞生長(zhǎng)，在進(jìn)行純化時(shí)，兩株突變株（25113ΔfrmA/pZWM1-13和25113ΔfrmA/pZWM1-14）具有明顯的生長(zhǎng)現(xiàn)象，菌體量最高增加82.4%，篩選得到的突變株能夠更好的利用甲醇并合成細(xì)胞碳骨架，因此GREACE進(jìn)化并配合壓力篩選的方法適用于工業(yè)菌株甲醇利用效率的提高。

利用甲醇作為輔助碳源時(shí)，突變株25113ΔfrmA/ pZWM1-13具有最好的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。為了對(duì)該突變株的甲醇利用情況進(jìn)行表征，使用13C標(biāo)記甲醇作為底物培養(yǎng)突變株25113ΔfrmA/pZWM1-13，收集菌體后進(jìn)行酸水解，并通過(guò)液相質(zhì)譜分析酸水解產(chǎn)生的氨基酸中13C分布情況。Ala、Leu和Val以丙酮酸為前體，Asp和Lys以草酰乙酸為前體，Glu和Pro以α-酮戊二酸為前體，Phe、Tyr和Try以磷酸烯醇式丙酮酸為前體，Gly以3-磷酸甘油醛為前體，因此菌體蛋白氨基酸的水平可以在一定程度上反映胞內(nèi)代謝物的水平［18］。檢測(cè)結(jié)果顯示Ala、Asp、Glu、Phe、His、Gly、Lys、Ser、Tyr、Met和Val在突變株代謝13C標(biāo)記甲醇時(shí)具有明顯的同位素比例差異，說(shuō)明甲醇通過(guò)RuMP途徑進(jìn)入了中心代謝，并經(jīng)過(guò)EMP途徑和TCA循環(huán)等途徑生成了相應(yīng)的胞內(nèi)代謝物與氨基酸，參與了菌體蛋白合成。對(duì)突變株進(jìn)行深入的分析，可能由此獲得改造靶點(diǎn)，為進(jìn)一步提高菌株的甲醇利用能力奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在E. coli中異源表達(dá)RuMP途徑關(guān)鍵酶MDH、HPS和PHI，構(gòu)建了甲醇同化途徑。并采用GREACE進(jìn)化的方法，在細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中引入隨機(jī)突變，結(jié)合以甲醇為碳源的壓力篩選，獲得了利用甲醇生長(zhǎng)較優(yōu)的突變株，13C標(biāo)記的質(zhì)譜分析表明突變株可以利用甲醇合成細(xì)胞碳骨架。為解析甲醇利用限制因素和甲醇利用菌株的優(yōu)化提供了新的研究對(duì)象和思路。

致謝：

衷心感謝李慶剛老師和張志丹老師在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中提供的幫助，特別感謝鄭小梅老師對(duì)文章的修改提供寶貴意見(jiàn)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Enhanced Methanol Utilization in Genetically Engineered Escherichia coli by Directed Evolution

WANG Xiao-lu1，2，3WANG Yu2，3LIU Jiao2，3ZHENG Ping2，3LU Fu-ping1
（1. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308；3. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

Methanol is an important organic chemical raw material as well as an attractive alternative of sugar for biochemical industry because of its cost advantage and higher degree of carbon reduction. However，commonly used industrial microorganisms such as Escherichia coli cannot utilize methanol as a carbon source，which has become a bottleneck for the application of methanol in bio-production processes. In this study，a methanol utilization pathway（ribulose monophosphate pathway）was constructed in E. coli using an engineering genetically engineered E. coli as a starting strain，the random mutation occurred by continuous passage and direct evolution. Then the mutants were screened using methanol as the carbon source，and 2 mutants that grew well on methanol were obtained. When methanol used as an accessory carbon source，biomass of the mutant 25113ΔfrmA/pZWM1-13 increased by 27.6% compared to the starting strain 25113ΔfrmA/pZWM1.13C labeling of proteinogenic amino acids detection showed that13C labeled amino acids increased obviously in the mutant 25113ΔfrmA/pZWM1-13. Among them，13C labeled methionine increased by 7.236%. Therefore，directed evolution improved methanol utilization efficiency of the genetically engineered E. coli.

methanol；ribulose monophosphate pathway；Escherichia coli；directed evolution

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0369

2017-05-08

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（31700044），中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)部署研究項(xiàng)目（ZDRW-ZS-2016-2）

王曉璐，女，碩士研究生，研究方向：輕工技術(shù)與工程；E-mail：616300688@qq.com

鄭平，女，博士，研究方向：細(xì)菌的代謝工程改造和系統(tǒng)生物學(xué)；E-mail：zheng_p@tib.cas.cn路福平，男，博士，研究方向：工業(yè)生物催化工程；E-mail：lfp@tust.edu.cn