紅色熒光蛋白的研究進(jìn)展

王飛 楊海濤 王澤方

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300000）

紅色熒光蛋白的研究進(jìn)展

王飛 楊海濤 王澤方

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300000）

從熒光蛋白的首次發(fā)現(xiàn)至今，其不斷豐富的熒光光譜以及日益增多的光化學(xué)特性促使其在生物學(xué)研究中的地位不斷提升。1999年出現(xiàn)的紅色熒光蛋白以其卓越的優(yōu)勢(shì)在生物學(xué)研究中占領(lǐng)了重要地位。主要介紹了從紅色熒光蛋白發(fā)現(xiàn)至今日趨重要的原因，以及它的顯著優(yōu)勢(shì)。另外，重討論了目前幾種常見的紅色熒光蛋白的特性及其在生物學(xué)研究中存在的優(yōu)勢(shì)和不足之處，為今后紅色熒光蛋白的研究提供一個(gè)選擇。

紅色熒光蛋白；遠(yuǎn)紅外熒光蛋白；熒光計(jì)時(shí)器；大斯托克斯熒光蛋白；光活化熒光蛋白

Abstract:Since the first discovery of fluorescent proteins，its ever-increasing fluorescence spectra and the increasing number of photochemical properties have led to an increasing position in biological research. The red fluorescent protein emerged in 1999 dominated the biology study with its superiority. This paper focuses on the growing importance of fluorescent protein discovery from now on，as well as the significant advantages of red fluorescent protein. In addition，we discuss the characteristics of several common red fluorescent proteins and their advantages and disadvantages in biology research，providing an alternative for the future research of red fluorescent protein.

Key words:red fluorescent protein；far-red fluorescent protein；fluorescent timers；LSSFP；PAFP

從1962年下村修等在名為Aequorea victoria的水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離得到最早的熒光蛋白綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）開始［1］，人們對(duì)于熒光蛋白的進(jìn)一步研究和應(yīng)用都沒有停止過。研究者通過一系列突變得到各種不同波長(zhǎng)的突變體，大大豐富了熒光蛋白的家族成員。如此大量的熒光蛋白使得其在蛋白質(zhì)分子標(biāo)記和細(xì)胞內(nèi)示蹤等方面得到了大量的應(yīng)用。

在紅色熒光蛋白發(fā)現(xiàn)以前，GFP雖然能幫助生物科學(xué)家解決一些問題，但由于其發(fā)射光譜僅僅局限在440-529 nm，細(xì)胞內(nèi)成像時(shí)背景較高，不能夠解決活體生物皮下更深的熒光標(biāo)記問題。1999年紅色熒光蛋白首次被報(bào)道［2］，紅色熒光蛋白能夠與GFP共用，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng)，最重要的是其在細(xì)胞內(nèi)成像時(shí)背景低。這些優(yōu)點(diǎn)促使科學(xué)家們對(duì)紅色熒光蛋白進(jìn)行了系列研究，極大的完善了其多樣性。

研究者在應(yīng)用紅色熒光蛋白的時(shí)候也發(fā)現(xiàn)了一些問題，如野生型的紅色熒光蛋白成熟速度慢且多以四聚體或二聚體形式出現(xiàn)，對(duì)細(xì)胞有一定的毒性作用［3-4］。紅色熒光蛋白的這些問題影響了被標(biāo)記物的功能和性質(zhì)，因此對(duì)野生型紅色熒光蛋白進(jìn)行改造就成了必不可少的步驟，而改造的目的主要針對(duì)紅色熒光蛋白的成熟慢，易聚合等缺點(diǎn)。此外，還要進(jìn)一步研究熒光強(qiáng)度更高，能夠進(jìn)一步豐富熒光蛋白發(fā)射光譜的更適用于生物熒光標(biāo)記的熒光蛋白。對(duì)以上內(nèi)容進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，旨為以后紅色熒光蛋白的進(jìn)一步改造提供參考與幫助。

1 紅色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)及其發(fā)展

1962年，下村修等在一種名為維多利亞多管水母（Aequorea victoria）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP），這是熒光蛋白首次被發(fā)現(xiàn)。從水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的GFP由238個(gè)氨基酸構(gòu)成，其中65-67位氨基酸為發(fā)光團(tuán)，可以被光激發(fā)產(chǎn)生熒光［5-6］。錢永健先生［7］在GFP的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一系列的體外突變產(chǎn)生了熒光強(qiáng)度更強(qiáng)以及發(fā)射波長(zhǎng)不同的多種突變體，如藍(lán)色、青色、黃色熒光蛋白都是體外突變的產(chǎn)物。也因此在2008年，錢永健等三位科學(xué)家因發(fā)現(xiàn)并發(fā)展了GFP而獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

GFP作為能夠在細(xì)胞內(nèi)精確定位的遺傳標(biāo)簽，結(jié)合如今飛速發(fā)展的成像技術(shù)和數(shù)據(jù)分析技術(shù)使得其在生物科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用飛速發(fā)展。GFP蛋白沒有毒性，在目標(biāo)生物體內(nèi)能夠高效表達(dá)的同時(shí)不影響生物體的功能，作為標(biāo)記蛋白時(shí)GFP在不影響目標(biāo)蛋白的活性的同時(shí)還能保持其熒光［8］，這也是GFP能夠被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的重要原因之一。GFP各種突變體的出現(xiàn)又能夠不同程度的滿足科學(xué)家對(duì)于熒光蛋白的要求，目前應(yīng)用最廣的就是其中一個(gè)突變體EGFP。然而，這系列熒光蛋白的發(fā)射光譜局限在440-529 nm之間，在細(xì)胞內(nèi)成像時(shí)能夠激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的某些物質(zhì)成像，造成細(xì)胞內(nèi)成像時(shí)的背景較高。使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果不夠可靠。

1999年紅色熒光蛋白首次被報(bào)道，與綠色熒光蛋白相比其優(yōu)點(diǎn)顯而易見。首先紅色熒光蛋白可以和GFP共同使用解決一些GFP單獨(dú)解決不了的科學(xué)問題；其次作為紅色熒光蛋白其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng)可以覆蓋GFP所不能涉及的波長(zhǎng)段；最重要的是紅色熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)成像時(shí)背景低更適用于進(jìn)行生物科學(xué)的研究。正因?yàn)榧t色熒光蛋白的這些優(yōu)勢(shì)，它在生物學(xué)研究中迅速得到了大量應(yīng)用［9-10］。紅色熒光蛋白分子與水母綠色熒光蛋白有中等的序列相似性，具有相似的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［11］，都是在由11個(gè)β-折疊形成的桶狀結(jié)構(gòu)中心的螺旋形成固有發(fā)色團(tuán)。

最早用于研究的紅色熒光蛋白是DsRed，它是一種從珊瑚中分離出來的紅色熒光蛋白，具有熒光強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)。但其本身也存在許多問題。例如，DsRed寡聚狀態(tài)是四聚體，在進(jìn)行蛋白融合時(shí)容易形成多聚體影響目標(biāo)蛋白；DsRed在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)會(huì)產(chǎn)生毒性。這就促使科學(xué)家不得不對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，目前，至少6種不同的紅色熒光蛋白類型，包括常規(guī)熒光蛋白、遠(yuǎn)紅外熒光蛋白、具有斯托克斯位移的紅色熒光蛋白、熒光定時(shí)器、可光活化紅色熒光蛋白和可逆光開關(guān)紅色熒光蛋白。這些類型中的每一種都能應(yīng)用于不同的成像技術(shù)，但是每種紅色熒光蛋白又都有局限性使其不能廣泛應(yīng)用。

2 紅色熒光蛋白的種類及其相關(guān)應(yīng)用的介紹

目前已知的紅色熒光蛋白類型就有6種之多，其中不少是由最初的紅色熒光蛋白突變而來的，這里簡(jiǎn)要介紹了有關(guān)紅色熒光蛋白突變體的結(jié)構(gòu)研究，以及一些具有特殊性質(zhì)的紅色熒光蛋白的應(yīng)用，相信以后對(duì)于這兩方面的進(jìn)一步研究能夠使紅色熒光蛋白的家族更加壯大。

2.1 常規(guī)紅色熒光蛋白

常規(guī)紅色熒光蛋白也叫做永久熒光蛋白，可以分為橙色熒光蛋白（550-570 nm）紅色熒光蛋白（570-620 nm）和遠(yuǎn)紅外熒光蛋白（>620 nm）3種。其中遠(yuǎn)紅外熒光蛋白我們將分開討論，以突顯其在熒光成像中的重要性。

熒光蛋白在細(xì)胞標(biāo)記中的適用性主要取決于其細(xì)胞毒性。只有降低熒光蛋白的細(xì)胞毒性保證高的細(xì)胞存活率，才能保證熒光蛋白穩(wěn)定高效的表達(dá)。而目前熒光蛋白的細(xì)胞毒性主要是由于其在細(xì)胞內(nèi)的非特異性聚合引起的，野生型的紅色熒光蛋白就具有明顯的寡聚現(xiàn)象。所以細(xì)胞毒性較小的突變體可以通過優(yōu)化蛋白質(zhì)的溶解性獲得，這種方式對(duì)于四聚體的紅色熒光蛋白同樣適用，如DsRed、E2-Orange和DsRed-Express2已經(jīng)通過這種方式得到了優(yōu)化［12］。一般情況下紅色熒光蛋白的寡聚確實(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，但是這種特性也是可以開發(fā)和預(yù)測(cè)并加以利用的，Dash等［13］就利用這種性質(zhì)優(yōu)先將未配體的核受體從核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)隔室然后再由其配體轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，這種能夠?qū)⑷秉c(diǎn)進(jìn)行開發(fā)和利用的做法就更加豐富了紅色熒光蛋白的應(yīng)用范圍。

現(xiàn)代紅色熒光蛋白與第一代常規(guī)紅色熒光蛋白相比有增強(qiáng)的熒光特性。例如，mOrange2和TagRFP-T［14］與它們的祖先mOrange和TagRFP［15］相比其光穩(wěn)定性更強(qiáng)。其他橙色熒光蛋白，如mKO2［16］和mKOk［17］與其祖先相比更明亮，具有更快的成熟時(shí)間，然而，它們的光穩(wěn)定性較低。最近Bindels等［18］研究產(chǎn)生的mScarlet為單體紅色熒光蛋白，與其他紅色熒光蛋白相比更適合作為融合標(biāo)簽。2016年，Pandelieva等［19］在mRojoA的發(fā)色團(tuán)之上引入芳香殘基降低發(fā)色團(tuán)的構(gòu)象靈活性，這種突變使得其比前體的熒光蛋白量子產(chǎn)率提高了3倍以上。而且通過對(duì)突變體的晶體結(jié)構(gòu)研究表明，發(fā)色團(tuán)夾在芳環(huán)三層基序中的兩個(gè)Tyr殘基之間，這種基序的存在增加了發(fā)色團(tuán)的 剛性。Pandelieva提出的方法為具有較高量子產(chǎn)率和總體亮度的熒光蛋白的發(fā)展提供了一個(gè)選擇。盡管現(xiàn)代紅色熒光蛋白在某些特定應(yīng)用方面有一定的優(yōu)勢(shì)，但一些早期的紅色熒光蛋白是仍然存在競(jìng)爭(zhēng)力的。2016年，F(xiàn)an［20］報(bào)道的rxRFP1對(duì)于氧化還原反應(yīng)敏感，能夠用于研究各亞細(xì)胞域的氧化還原動(dòng)力學(xué)。通常mCherry是作為標(biāo)簽的好選擇，因其光穩(wěn)定性更強(qiáng)，且其具備良好的單體特性，細(xì)胞毒性低［21］。2015年，Wannier等［22］通過計(jì)算設(shè)計(jì)的手段結(jié)合表面突變，創(chuàng)建了一種DsRed和mCherry的混合RFP不僅保持了單體性而且熒光不受損，相信這種方法對(duì)于以后的熒光蛋白改造有很大的意義。

從結(jié)構(gòu)上看突變體mCherry能夠具有如此強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力有兩個(gè)原因。第一個(gè)原因是，mCherry中的第163位Lys已經(jīng)突變成了Gln，這個(gè)突變的氨基酸所在的側(cè)鏈位于發(fā)色團(tuán)苯環(huán)下方，在結(jié)構(gòu)中能夠清楚的看到163位的Lys與發(fā)色團(tuán)的苯環(huán)之間由氫鍵相互作用。熒光蛋白中的發(fā)色團(tuán)是去質(zhì)子化的，主要原因在于發(fā)色團(tuán)在蛋白質(zhì)內(nèi)部與蛋白所處環(huán)境的吸光度有所不同，據(jù)此我們相信163位的Lys是被質(zhì)子化的，也因此通過氫鍵與發(fā)色團(tuán)相互聯(lián)系。這種相互作用能夠穩(wěn)定DsRed的電子密度，降低了發(fā)色團(tuán)苯環(huán)的活躍性。而突變體中用中性的Glu替代酸性的Lys，這將導(dǎo)致這個(gè)位點(diǎn)與發(fā)色團(tuán)的距離增加，從而維持一個(gè)相對(duì)較弱的氫鍵。這就引起發(fā)色團(tuán)處于一個(gè)相對(duì)活躍的狀態(tài)，從而能夠產(chǎn)生更亮的熒光。第二個(gè)原因是83位的Lys突變?yōu)長(zhǎng)eu。有一個(gè)熒光亮度增強(qiáng)的突變體，在這個(gè)位點(diǎn)上也發(fā)生了突變不過將Lys突變?yōu)镸et，在后者突變體的結(jié)構(gòu)中能夠看出79位Lys向著Met的方向移動(dòng)，這個(gè)方向剛好是遠(yuǎn)離發(fā)色團(tuán)的方向。在mCherry中也觀察到70位Lys有類似的變化，因此可以認(rèn)為70位的Lys能夠幫助發(fā)色團(tuán)處于穩(wěn)定狀態(tài)，而Lys的遠(yuǎn)離能夠使其處于一個(gè)活躍的狀態(tài)，在激發(fā)熒光時(shí)產(chǎn)生更亮的熒光［23-24］。如圖1所示顯示了突變體mCherry發(fā)色團(tuán)與其周圍環(huán)境的相互關(guān)系。

2.2 遠(yuǎn)紅外熒光蛋白

研究具有600 nm以上發(fā)射波長(zhǎng)的熒光蛋白主要有兩個(gè)目的：首先，在生物成像技術(shù)中很需要能夠在近紅外（Near infrared，NIR）窗口（650-900 nm）內(nèi)具有發(fā)射光的熒光蛋白，因?yàn)楣庹丈浯┩附M織時(shí)，其中的生物分子如黑色素、血紅蛋白和水，在近紅外窗口的光具有最小的吸收；其次，這種熒光蛋白能為多波長(zhǎng)成像技術(shù)提供更多的選擇，其應(yīng)用于生物體內(nèi)的成像技術(shù)能產(chǎn)生更少的光毒性。熒光蛋白本身不能夠在近紅外窗口產(chǎn)生激發(fā)光，目前為止報(bào)道的天然紅色熒光蛋白最長(zhǎng)發(fā)射光波長(zhǎng)為613 nm，是來自Nematostella vectensis體內(nèi)的NvFP-7R［25］。

圖1 突變后的mCherry發(fā)色團(tuán)與其環(huán)境相互關(guān)系

經(jīng)過設(shè)計(jì)和突變得到了許多能夠在近紅外窗口產(chǎn)生激發(fā)光的熒光蛋白突變體，但都具有低產(chǎn)量或者低亮度等缺點(diǎn)［26-28］。這其中包括2005年從來自Actinia equine的aeCP597突變產(chǎn)生的AQ143，具有在595-655 nm的激發(fā)和發(fā)射最大值［29，30］。2014年，由Archaerhodopsin-3突變產(chǎn)生的突變體具有迄今為止最遠(yuǎn)的紅移發(fā)射［31］。2013年，經(jīng)mKate突變產(chǎn)生的穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)的突變體TagRFP675［32］。經(jīng)mRuby突變產(chǎn)生的mGarnet在670 nm處產(chǎn)生激發(fā)光［33］。2015年，Yu等［34］通過對(duì)新近的單體紅色熒光蛋白mIFP進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)突變使其產(chǎn)生新的突變體iBlueberry，這是一種藍(lán)移突變體，其激發(fā)和發(fā)射光譜，約40 nm的光譜移動(dòng)。iBlueberry除保持單體狀態(tài)外，還具有比其母體穩(wěn)定性高4倍的特性。2016年，Bajar等［35］經(jīng)過26個(gè)突變最終得到mMaroon1，細(xì)胞毒性小，且具有紅移吸光度，用于研究細(xì)胞周期的4個(gè)階段取得了很好的效果。同年Li等［36］通過對(duì)mNeptune進(jìn)行突變以開發(fā)新的熒光蛋白，在眾多突變體中mNeptune681和mNeptune684相對(duì)于其母體顯示出超過30 nm的紅移發(fā)射，并且這兩種突變體還保持著單體狀態(tài)。Ren等［37］經(jīng)過在mKate2的發(fā)色團(tuán)附近引入半胱氨酸得到新的遠(yuǎn)紅外紅色熒光蛋白mStable，該突變體比其前體穩(wěn)定性增強(qiáng)12倍，他們還對(duì)mPlum進(jìn)行了同樣的改變得到了穩(wěn)定性增強(qiáng)23倍的突變體，這種突變代表了一種生產(chǎn)更好穩(wěn)定性熒光蛋白的一種機(jī)制。表1給出了目前常見的幾種遠(yuǎn)紅外紅色熒光蛋白及其特征參數(shù)。

從結(jié)構(gòu)方面分析這些突變體發(fā)生紅移的原因主要有兩方面。第一，發(fā)色團(tuán)的平面化增強(qiáng)。從Neptune的結(jié)構(gòu)來看其中的發(fā)色團(tuán)平面性有明顯的增強(qiáng)。在Neptune中，197位Arg的側(cè)鏈與其上面的發(fā)色團(tuán)中的兩個(gè)環(huán)相互平行。這個(gè)變化可能是由于其中158位Cys突變成Ser引起的，突變后的氨基酸殘基側(cè)鏈占領(lǐng)了本來由197位Arg占有的空間。順著Arg的延伸方向發(fā)色團(tuán)中的兩個(gè)環(huán)更接近共平面（圖2左側(cè)），這種變化能夠使電子位移容易發(fā)生，降低激發(fā)所需能量，從而使突變體的熒光范圍發(fā)生紅移。這種變化也能夠在其他突變體中發(fā)現(xiàn)，比如eqFP650和eqFP670。第二，氫與?；鶃啺费醯慕Y(jié)合。從Neptune的結(jié)構(gòu)中可以看出，由于41位Met突變?yōu)镚ly形成了一個(gè)含有水分子的空穴（圖2右側(cè)），水分子與發(fā)色團(tuán)中的酰基亞胺氧形成氫鍵，氫鍵的形成能夠富集電子降低激發(fā)熒光所需能量。這種情況在eqFP650和eqFP670中同樣也有發(fā)現(xiàn)，這說明41位Met突變?yōu)樾?cè)鏈有助于紅移的發(fā)生。

此外，已經(jīng)開發(fā)了幾種近紅外熒光蛋白，如最近在細(xì)菌植物色素的基礎(chǔ)上突變得到的IFP1.4［41］和iRFP［42］。這些蛋白的熒光是依賴于外源四吡咯發(fā)色團(tuán)的，稱為膽綠素，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中含量比較多。2013年產(chǎn)生的融合蛋白mPlum-IFP 1.4能夠用于體內(nèi)和體外的檢測(cè)［43］。來自水母或珊瑚的熒光蛋白在產(chǎn)生激發(fā)光的同時(shí)需要氧氣，并且在發(fā)色團(tuán)形成時(shí)產(chǎn)生過氧化氫，因此需要對(duì)有氧環(huán)境具有耐受性［44］。發(fā)色團(tuán)形成可能需要數(shù)小時(shí)，并且在其產(chǎn)物中綠色和紅色熒光的混合物是常見的［45］，在此過程中產(chǎn)生的過氧化氫是細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、分化和介導(dǎo)疾病的誘因［46］，這些有可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可信。因此，使用熒光蛋白內(nèi)源發(fā)色團(tuán)以消除需氧性和過氧化氫［47］的產(chǎn)生是有必要的。2016年，Rodriguez等［48］用TeAPCα經(jīng)過突變產(chǎn)生了符合要求的突變體smURFP，smURFP在生物物理上是最亮的熒光蛋白，并能夠激發(fā)近紅外窗口內(nèi)的激發(fā)光，且具有最小的毒性不產(chǎn)生過氧化氫。此外，不像其前體TeAPCα smURFP不需要裂解酶共價(jià)附著其發(fā)色團(tuán)。經(jīng)過一系列的體內(nèi)或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，可以看出，與mCherry相比，smURFP沒有出現(xiàn)聚合的情況，與目前常用的一些熒光蛋白相比，smURFP在細(xì)胞內(nèi)能夠更穩(wěn)定的表達(dá)。目前smURFP能夠有這些特性的原因還有待發(fā)現(xiàn)，希望能夠通過解析smURFP的結(jié)構(gòu)來解釋這一變化。并且目前smURFP產(chǎn)生熒光依賴于其發(fā)色團(tuán)膽綠素的結(jié)合，考慮到在原核生物（厭氧型）中smURFP不能方便的使用，對(duì)此進(jìn)行研究和改進(jìn)也是日后的一個(gè)目標(biāo)。

表1 常見遠(yuǎn)紅外紅色熒光蛋白特性參數(shù)［38-40］

圖2 Neptine與mKate相比較發(fā)生紅移的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

2.3 具有大斯托克斯頻移的紅色熒光蛋白

大斯托克斯頻移（Large stokes shift，LSS），是指激發(fā)和發(fā)射最大值之間的差大于100 nm（圖3），是熒光蛋白中具有獨(dú)特特征的亞類，稱為具有大色托克斯位移的熒光蛋白（Large stokes shift fluorescent protein，LSSFP）。LSSFP為多色成像應(yīng)用提供光譜可分辨的顏色。除了綠色和黃色LSSFP［49］之外，還有橙色LSSFP-LSSmOrange［50］和3種紅色LSSFP：mKeima、LSSmKate1和LSSmKate2［51-52］。2013年發(fā)現(xiàn)的青色熒光蛋白psamFP488也具有顯著擴(kuò)展的斯托克斯位移［53］。所有紅移LSSFP光吸收值在440-460 nm并且激發(fā)熒光范圍在光譜中紅色部分。LSSmOrange在紅色LSSFP中具有最高強(qiáng)度和最亮熒光［54］。LSSmKate2在pH穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性和亮度方面勝過mKeima，它缺乏黃色光譜區(qū)的額外激發(fā)峰［55］。2015年，的突變體hmKeima8.5［56］具有更高的細(xì)胞內(nèi)亮度，且其斯托克斯位移增加至約180 nm，這些性質(zhì)使其更適用于生物科學(xué)研究。LSSmKate2具有較低的細(xì)胞毒性，能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的表達(dá)。2014年，LSSmKate的一個(gè)突變體PSLSSmKate具有可光活化的特性［57］，相信通過對(duì)其結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究能夠指導(dǎo)我們進(jìn)一步改善使其能夠用于光活化成像。2013年，由mKate突變獲得了一種新的LSSFP：mBeRFP，其中包括5個(gè)氨基酸突變。原始的mKate發(fā)色團(tuán)中的68位Tyr比較靠近發(fā)生突變的147位Ser和162位Glu，假定發(fā)色團(tuán)與162位Glu能夠形成氫鍵從而使發(fā)色團(tuán)處于相對(duì)穩(wěn)定的中性環(huán)境，而突變可能改變了這種穩(wěn)態(tài)，使得其性質(zhì)發(fā)生變化，具體的原理還有待進(jìn)一步研究［58］。2014年，Pletnev等［59］研究了LSSmOrange的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，其中唯一的突變Ile161Asp對(duì)于其性質(zhì)的改進(jìn)以及超大的斯托克斯位移有重要的意義。

圖3 斯托克斯位移示意圖

LSSFP的光譜特性對(duì)于使用單一的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)的多色應(yīng)用是有利的。熒光互相關(guān)光譜（Fluorescence cross-correlation spectroscopy，F(xiàn)CCS）是一種可變的熒光相關(guān)光譜（Fluorescence Correlation Spectroscopy，F(xiàn)CS），其被優(yōu)化用來研究相對(duì)分子量相似的蛋白質(zhì)之間的相互作用。在雙色FCCS中，兩個(gè)信號(hào)之間的互相關(guān)程度與相互作用對(duì)的百分比相關(guān)。與FRET相反，F(xiàn)CCS不依賴于接近度和熒光蛋白之間的有利取向［60］。單激光雙色FCCS比雙激光器設(shè)置更有優(yōu)勢(shì)因?yàn)樗恍枰獌蓚€(gè)激光器精確對(duì)準(zhǔn)共同共焦點(diǎn)。紅色LSSFP，mKeima與青色熒光蛋白（Cyan fluorescent protein，CFP）一起能夠被同一激光有效地激發(fā)產(chǎn)生雙色FCCS。這一戰(zhàn)略已經(jīng)擴(kuò)大到實(shí)現(xiàn)四色FCCS。對(duì)于FRET紅色LSSFP是很好的探針。LSSFP是遠(yuǎn)紅外熒光蛋白的假定供體和藍(lán)色熒光蛋白的潛在受體。紅色LSSFP供體激發(fā)光譜和紅色LSSFP受體發(fā)射光譜的較大差異在相應(yīng)的FRET組合中能夠產(chǎn)生低背景和高靈敏度FRET測(cè)定［61］?；贚SSFP的FRET對(duì)也可以與其他FRET對(duì)結(jié)合使用，如LSSmOrange-mKate2 FRET對(duì)與CFPYFP（Yellow fluorescent protein）FRET生物傳感器一起使用在單個(gè)細(xì)胞中同時(shí)成像兩個(gè)過程。2016年，Laviv等［62］對(duì)應(yīng)用于FRET的熒光蛋白對(duì)進(jìn)行了優(yōu)化新開發(fā)的熒光蛋白對(duì)中采用能夠激發(fā)紅色熒光的LSSFP的mCyRFP1。LSSFP在生物學(xué)研究中的應(yīng)用尤為重要，但是目前的LSSFP亮度普遍較低，而且在使用過程中只能與CFP聯(lián)合使用，所以尋找能夠與亮度最大的GFP聯(lián)合使用的LSSFP成為了急需解決的問題。表2給出了幾種LSSFP及其特征參數(shù)。

2.4 熒光計(jì)時(shí)器蛋白

熒光計(jì)時(shí)器（Fluorescent timers，F(xiàn)T）蛋白可以隨著時(shí)間改變其熒光顏色。這個(gè)現(xiàn)象是基于其較慢的發(fā)色團(tuán)形成過程，中間發(fā)色團(tuán)和最終發(fā)色團(tuán)在不同的光譜范圍內(nèi)形成熒光?？深A(yù)測(cè)的顏色變化時(shí)間過程使得體內(nèi)的時(shí)間和空間變化能夠定量分析［63］。關(guān)于其顏色變化的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。與下節(jié)描述的適用于研究快速細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)研究的可光活化熒光蛋白相反，熒光計(jì)時(shí)器通常用于研究相對(duì)較慢的變化。

表2 常見LSSFP的特征參數(shù)

目前有兩種類型的熒光計(jì)時(shí)器，第一種是mCherry衍生的單體快速（Fast-FT）、中等（Medium-FT）和慢速（Slow-FT）熒光計(jì)時(shí)器，隨著時(shí)間的變化它們的熒光從藍(lán)色變化到紅色。藍(lán)色和紅色FT亮度較高，具有pH穩(wěn)定性，并且能夠完成藍(lán)色到紅色熒光的轉(zhuǎn)換，但是這種FT需要在強(qiáng)紫外光下使用，這導(dǎo)致其在生物學(xué)研究中的使用變得復(fù)雜。2015年，Takamura等［64］，通過體外重組FT碎片研究其顏色變化以及速率的方式對(duì)活細(xì)胞中的α-突觸核蛋白的聚集過程進(jìn)行了可視化研究。另一種類型的FT是單體Kusabira Green Orange（mK-GO）其顏色隨時(shí)間從綠色變?yōu)槌壬?。與mCherry衍生的FT相反，兩種形式的mK-GO獨(dú)立成熟。綠色形式的mK-GO在橙色形式的mK-GO成熟后不消失。完全成熟后橙-綠兩種形式的比例從約0.1變?yōu)?.7。圖4表示了這兩種FT的基本原理。這種類型的FT在熒光的敏感程度不如第一種類型的FT。單體FT可以用于估計(jì)它所標(biāo)記的目的蛋白的年齡。能用Medium-FT和mKGO［65］確定參與自噬和內(nèi)吞作用的組分的年齡。目前這兩種類型的FT都存某些缺點(diǎn)，限制了其在生物科學(xué)研究領(lǐng)域中的順利應(yīng)用，因此接下來的研究任務(wù)是改進(jìn)其應(yīng)用的方便性及增加其熒光敏感性。

圖4 傳統(tǒng)熒光計(jì)時(shí)器示意圖

2012年，Khmelinskii等［66］通過串聯(lián)熒光蛋白定時(shí)器（Tandem fluorescent protein timers，tFT）來測(cè)量細(xì)胞過程中的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。其原理是根據(jù)兩個(gè)串聯(lián)的熒光蛋白在發(fā)色團(tuán)成熟過程中存在的時(shí)間差，整個(gè)檢測(cè)過程中不同時(shí)間被檢測(cè)細(xì)胞顯示的顏色有所差異，也因此可以判定被檢測(cè)蛋白的年齡及狀態(tài)。圖5表示了這種串聯(lián)熒光定時(shí)器的基本原理。tFT與定量雙色熒光顯微鏡成像結(jié)合使用時(shí)能夠提供從亞細(xì)胞到有機(jī)體的信號(hào)傳導(dǎo)活動(dòng)的詳細(xì)“快照”讀數(shù)，對(duì)于研究胚胎發(fā)育的研究具有重要的意義［67］。而在之后許多科學(xué)家也對(duì)此進(jìn)行了研究［68-69］，其中使用最多是成熟較慢的紅色熒光蛋白mCherry與成熟較快的綠色熒光蛋白（Superfolder green fluorescent protein，sfGFP）串聯(lián)形成的tFT。在2016年，Khmelinskii等［70］又通過不同的綠色熒光蛋白與mCherry串聯(lián)研究了綠色熒光蛋白成熟動(dòng)力學(xué)對(duì)tFT時(shí)間范圍的影響，研究表明，實(shí)驗(yàn)過程中的不完全蛋白酶降解會(huì)影響到tFT的時(shí)間檢測(cè)范圍，所以在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)有必要通過研究蛋白酶體降解來進(jìn)一步精確tFT的檢測(cè)范圍。

2.5 可活化紅色熒光蛋白

圖5 串聯(lián)熒光定時(shí)器示意圖

圖6 PAFP原理示意圖

能夠由光調(diào)節(jié)其熒光性質(zhì)的熒光蛋白適合用于各種選擇性成像標(biāo)記技術(shù)，從粒子跟蹤到超分辨率成像都適用，具有這種性質(zhì)的熒光蛋白稱為可光活化熒光蛋白（Photoactivatable FP，PAFP）。PAFP的重要特性主要包括兩方面，首先是光活化對(duì)比度；其次是熒光蛋白在初始狀態(tài)和光活化狀態(tài)的亮度。光活化對(duì)比度是光活化后的熒光強(qiáng)度和光活化前的熒光強(qiáng)度的比率。較高的對(duì)比度能夠產(chǎn)生更大的信號(hào)與背景比；另一個(gè)要考慮的參數(shù)是光活化時(shí)所需的光強(qiáng)度：不應(yīng)該高到對(duì)細(xì)胞有害，同樣也不能低到可以自發(fā)發(fā)生光活化。目前有3種類型的不可逆紅色PAFP（圖6）：從暗到紅可光活化PAmCherry樣紅色熒光蛋白，如PAmCherry和PATagRFP，其中的PATagRFP在亮度和光穩(wěn)定性方面比PAmCherry更好［71］；從綠到紅可光活化Kaede樣紅色熒光蛋白，如Dendra2［72］、mEos3［73］和mKikGR是目前比較常用的PAFP，在2010年的一個(gè)突變體mClavGR2 PSFP是一個(gè)亮度和光轉(zhuǎn)化對(duì)比度更加優(yōu)秀的PAFP［74］；以及最近發(fā)現(xiàn)的從橙到遠(yuǎn)紅可活化熒光蛋白PSmOrange［75］，目前為止其具有最遠(yuǎn)的紅色激發(fā)峰。2013年產(chǎn)生的PAiRFP1和PAiRFP2能夠在近紅外窗口產(chǎn)生激發(fā)光應(yīng)用于組織內(nèi)部檢測(cè)［76］。

PAFP可以用來標(biāo)記目標(biāo)蛋白、特定細(xì)胞器或細(xì)胞。用PAFP標(biāo)記蛋白一般用于研究蛋白動(dòng)力學(xué)和轉(zhuǎn)運(yùn)。細(xì)胞器光標(biāo)記能夠監(jiān)測(cè)裂變和融合。細(xì)胞追蹤適用于研究發(fā)育、癌變和炎癥反應(yīng)［77］。PAFP的特性使其適合于在體內(nèi)的長(zhǎng)期跟蹤檢測(cè)。在FRET成像中也可以使用PAFP，可以基于一個(gè)簡(jiǎn)單的方法在一個(gè)細(xì)胞區(qū)室中特定PAFP的光活化然后監(jiān)測(cè)PAFP供體和常規(guī)紅色熒光蛋白受體之間不同的細(xì)胞區(qū)域FRET。PAFP表型對(duì)光活化定位顯微鏡（Photoactivated localization microscopy，PALM）［78-79］和熒光PALM（Fluorescent photo-activated localization mic-roscopy，F(xiàn)PALM）超分辨率方法至關(guān)重要。PALM依賴于單分子成像，單分子亮度以及背景和光活化后光子輸出之間的對(duì)比度在這項(xiàng)技術(shù)中是關(guān)鍵的熒光蛋白特性。在PALM方法中，較高的對(duì)比度引起較高的空間分辨率，因此其成像伴隨較低的自發(fā)熒光背景的紅色熒光蛋白是優(yōu)選PALM探針［80］，這些蛋白不產(chǎn)生綠色熒光因此能夠與綠色PAFP相結(jié)合使用達(dá)到更高的分辨率。值得一提的是，2014年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)就表彰了Eric Bctzig等3位科學(xué)家在超高分辨率熒光顯微鏡上的貢獻(xiàn)。PAFP的特性影響著PALM圖像質(zhì)量，主要包括每個(gè)周期發(fā)射的光子數(shù)量、蛋白的二聚化現(xiàn)象以及蛋白的信號(hào)效率。目前已知的各種PAFP都有很高程度的二聚化現(xiàn)象這就導(dǎo)致其信號(hào)效率變低影響PALM的圖像質(zhì)量［81］，生產(chǎn)出沒有二聚化現(xiàn)象的PAFP是今后改造工作的首要目標(biāo)。表3列舉了幾種常見的可活化紅色熒光蛋白。2.6 可逆光開關(guān)紅色熒光蛋白

表3 常見可活化紅色熒光蛋白特征參數(shù)［82-84］

圖7 rsFP原理示意圖

可逆光開關(guān)熒光蛋白（Reversibly switchable fluorescent protein，rsFP）可以在兩者之間重復(fù)光開關(guān)熒光和非熒光狀態(tài)。這種屬性能夠促使產(chǎn)生新的成像技術(shù)。2009年發(fā)現(xiàn)的紅色rsFP包括rsCherry［85］、rsCherryRev和rsTagRFP［86］。用550-570 nm光照射rsTagRFP能夠關(guān)閉紅色熒光狀態(tài)使其在567 nm的光吸收特性變成在440 nm有光吸收的暗態(tài)，而照射430-450 nm光將暗態(tài)切換回?zé)晒鈶B(tài)。圖7顯示了rsFP的基本原理。rsFP的這種特性有可能是由于用相應(yīng)波長(zhǎng)的光照射能夠使其發(fā)色團(tuán)發(fā)生順-反光異構(gòu)化，伴隨著質(zhì)子化與去質(zhì)子化產(chǎn)生亮暗的轉(zhuǎn)化?？赡娴?zé)晒廪D(zhuǎn)化表型可以為超分辨率技術(shù)提供優(yōu)勢(shì)。然而，在實(shí)踐中使用rsFP的超分辨率成像受到熒光蛋白缺乏“耐疲勞”的限制。此外，即使亮度和對(duì)比度最好的可用紅色rsFPs都不如那些紅色PAFP和PSFP效果好［87］。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道了5種基于rsFP的超辨率技術(shù)，可逆飽和光學(xué)（熒光）轉(zhuǎn)換（Reversible saturable optical fluorescence transitions，RESOLFT）、PALM運(yùn)行采集（PALM independently running acquisition，PALMIRA）、活細(xì)胞納米鏡（Live-cell fluorescence nanoscopy）［88］和PALM與雙色頻閃照明（Two-color troboscopic illumination PALM，S-PALM）顯微鏡，以及2015年出現(xiàn)的光致變色隨機(jī)光波動(dòng)成像（Photochromic stochastic optical fluctuation imaging，pcSOFI）［89］。2016年，Wang等［90］報(bào)道了GMars-Q，這是一種具有低殘留強(qiáng)度和較強(qiáng)的抗疲勞特性，這種抗疲勞特性歸因于雙相光漂白過程。這種rsFP的性質(zhì)對(duì)于RESOLFT是非常有利的。紅色rsFP已應(yīng)用于RESOLFT對(duì)細(xì)菌成像，使用的是四聚體asFP595rsFP。2014年，Lavoie-Cardinal等［91］將一種新的紅色熒光蛋白rsCherryRev1.4用于RESOLFT成像，獲得了高出衍射屏障4倍的空間分辨率。表4給出了幾種常見的可逆光開關(guān)紅色熒光蛋白及其特征參數(shù)。

表4 常見可逆光開關(guān)紅色熒光蛋白特征參數(shù)

目前紅色rsFPs仍然具有限制其廣泛應(yīng)用的不足，包括其較低的耐疲勞性，較慢的光轉(zhuǎn)化效率以及其較差的穩(wěn)定性，但是科學(xué)家們已經(jīng)通過改造得到了相對(duì)優(yōu)秀的綠色rsFPs突變體［92］。例如，2016年出現(xiàn)的rsFolder和rsFolder2是由rsFolder是通過Superfolder-GFP與rsEGFP2的雜交設(shè)計(jì)的，能夠用于有效的研究細(xì)胞室內(nèi)的研究［93］。同樣，由Smyrnova等［94］改進(jìn)的突變體rsFastLime（Dronpa V157G）和rsKame（Dronpa V157L）在轉(zhuǎn)化速度方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，這兩種突變體都通過異構(gòu)化進(jìn)行轉(zhuǎn)化。并且通過功能模式分析得出其中的Val / Leu 157和α-螺旋中的氨基酸在異構(gòu)化過程中有很重要的作用。而2015年出現(xiàn)的Skylan-S具有很高的光穩(wěn)定性［95］。Morozov等［96］通過對(duì)Dronpa快速切換Met159Thr突變體的分子動(dòng)力學(xué)模擬的研究指出，以后在進(jìn)行新的rsFP的研究時(shí)除了關(guān)注結(jié)構(gòu)方面的還要關(guān)注異構(gòu)化方面的研究。有這些優(yōu)秀的突變體以及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)方面的研究作為參考，相信性質(zhì)更加完善的紅色rsFPs的改造能夠很快的出現(xiàn)輔助于改善RESOLFT和PALMIRA性能，并使這些技術(shù)廣泛應(yīng)用于研究具有超分辨率精確度的細(xì)胞內(nèi)過程。

3 發(fā)色團(tuán)研究

熒光蛋白顏色的多樣性是因其發(fā)色團(tuán)多樣性以及蛋白所處化學(xué)環(huán)境的多樣性導(dǎo)致的必然結(jié)果。由于科學(xué)家對(duì)于熒光蛋白的研究和改進(jìn)，科學(xué)家們?cè)谘芯肯冗M(jìn)熒光蛋白的同時(shí)也對(duì)其發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)和形成過程進(jìn)行了研究，而發(fā)色團(tuán)自催化和光誘導(dǎo)化學(xué)的基本原理已經(jīng)為人們所知［97］。這無疑為操縱發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)之間的躍遷提供了可能性，相信日后我們會(huì)獲得新的熒光蛋白表型。這里主要介紹紅色熒光蛋白的發(fā)光團(tuán)。迅速發(fā)展的成像應(yīng)用促進(jìn)了紅色熒光蛋白探針的改進(jìn)?；趯?duì)紅色熒光蛋白發(fā)色團(tuán)的發(fā)色原理的了解，科學(xué)家們對(duì)紅色熒光蛋白進(jìn)行了有效的改進(jìn)。用于紅色熒光蛋白改造的方法有很多種包括有晶體學(xué)方法［98］、突變、同位素研究、質(zhì)譜［99-101］等方法都應(yīng)用于熒光蛋白的改進(jìn)。我們完全可以應(yīng)用這些手段制定合理的改進(jìn)策略。

紅色熒光蛋白的發(fā)色團(tuán)中的三肽由固定的66位Tyr和67位Gly以及可變的65位氨基酸殘基構(gòu)成。其中核心4-對(duì)羥基亞芐基-5-咪唑啉酮結(jié)構(gòu)在紅色熒光蛋白是共有的發(fā)色團(tuán)組成部分，而65位氨基酸殘基的變化是導(dǎo)致其光譜范圍變化的原因。在多種多樣的發(fā)色團(tuán)中還有一種稱為光敏劑的發(fā)色團(tuán)，這種發(fā)色團(tuán)在被光照射時(shí)能夠產(chǎn)生活性氧，可以用于靶蛋白的精確光誘導(dǎo)失活、DNA損傷和細(xì)胞殺傷。經(jīng)過晶體結(jié)構(gòu)的研究表明GFP樣光敏劑中的獨(dú)特結(jié)構(gòu)特征是沿著β-桶軸從發(fā)色團(tuán)延伸到筒體末端的充水通道［102］。2015年，Pletneva等［103］通過對(duì)二聚KillerOrange和單體mKillerOrange的晶體學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在兩種蛋白質(zhì)中，發(fā)色團(tuán)的Trp66通過與其附近的Gln159形成氫鍵來穩(wěn)定一種不尋常的反式-順式構(gòu)象。這種反式-順式構(gòu)象和水通道是這兩種橙色光敏劑產(chǎn)生明亮的橙色熒光和光毒性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征。目前已知有兩種類型的紅色發(fā)光團(tuán)：DsRed樣和Kaede樣發(fā)光團(tuán)。有自催化或者三肽的光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化，Kaede樣發(fā)光團(tuán)三肽只能產(chǎn)生光化學(xué)，而紅色熒光蛋白的不同色調(diào)由DsRed樣發(fā)色團(tuán)的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。

目前，包含有DsRed樣發(fā)色團(tuán)的紅色熒光蛋白家族主要有3個(gè)：DsRed的衍生物、eqFP611和eqFP578。研究顯示，DsRed樣發(fā)色團(tuán)的成熟過程，首先包含有mTagBFP［104］發(fā)色團(tuán)的N-?；鶃啺稢 = N的形成，然后Tyr66側(cè)鏈的Cα-Cβ雙鍵形成。只有一個(gè)DsRed樣紅色熒光蛋白通過GFP樣生色團(tuán)中間體成熟。關(guān)于幾個(gè)具有不同的表型熒光蛋白的研究表明其具有mTagBFP樣藍(lán)色中間體的結(jié)構(gòu)。

第二種類型的紅色發(fā)色團(tuán)，Kaede樣發(fā)色團(tuán)，發(fā)現(xiàn)于紅色狀態(tài)的PSFP（Photoswitchable fluorescent proteins）。在綠色態(tài)下，這些熒光蛋白具有GFP樣發(fā)色團(tuán)。用紫光照射后，β消除反應(yīng)引起綠色至紅色的光轉(zhuǎn)化反應(yīng)。這個(gè)過程中65位的His N- Cα鍵被切斷，側(cè)鏈的Cα-Cβ雙鍵形成，導(dǎo)致π-共軛系統(tǒng)延伸并得到Kaede樣紅色發(fā)色團(tuán)。

對(duì)于光可控的熒光蛋白發(fā)色團(tuán)的研究目前有一些進(jìn)展，光控的熒光蛋白分為可逆和不可逆的光活化，在可逆光轉(zhuǎn)化中其發(fā)色團(tuán)的原理包括順反式異構(gòu)化，質(zhì)子化-去質(zhì)子化和脫水縮合。而不可逆的光轉(zhuǎn)化包括發(fā)色團(tuán)內(nèi)的共軛π系統(tǒng)，相鄰Glu的脫羧和多肽主干的斷裂。但是目前依然不清楚可逆光開關(guān)抗疲勞的化學(xué)基礎(chǔ)，而在這方面的改進(jìn)是現(xiàn)在生物科學(xué)研究技術(shù)中急需的。

基于目前已知的紅色發(fā)色團(tuán)、其衍生物以及其中的過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)可以得出以下結(jié)論：首先，發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)之間的化學(xué)轉(zhuǎn)變可以發(fā)生自催化，光誘導(dǎo)或者被阻塞。第二，發(fā)色團(tuán)可以處于熒光狀態(tài)或色原態(tài)。第三，發(fā)色團(tuán)中的氨基酸殘基及其微環(huán)境決定發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)之間的轉(zhuǎn)變以及所產(chǎn)生的熒光蛋白表型。電子結(jié)構(gòu)計(jì)算和模型的化學(xué)合成與結(jié)晶學(xué)共同應(yīng)用、質(zhì)譜、生物化學(xué)和光物理表征等技術(shù)的進(jìn)一步研究，將助力于進(jìn)一步闡明發(fā)色團(tuán)的化學(xué)和光譜行為。

4 展望

人們對(duì)紅色熒光蛋白結(jié)構(gòu)和功能的理解在過去幾年里已經(jīng)大大提高了，但仍有許多爭(zhēng)議和謎團(tuán)需解決。在現(xiàn)有知識(shí)的基礎(chǔ)上，可以設(shè)計(jì)和改進(jìn)以得到具有新的光化學(xué)性質(zhì)的紅色熒光蛋白。目前對(duì)熒光蛋白的激發(fā)態(tài)的理論研究已經(jīng)有許多了，我們?nèi)栽谂﹃U明發(fā)射熒光的調(diào)節(jié)機(jī)制。

對(duì)于紅色熒光蛋白的研究不僅是理性工程，也有可能是將隨機(jī)誘變與高通量篩選技術(shù)相結(jié)合來達(dá)到使紅色熒光蛋白分子有效進(jìn)化的目的。當(dāng)然，不排除新的克隆或者新發(fā)現(xiàn)的紅色熒光蛋白具有前所未有的光化學(xué)性質(zhì)。正如Tsien［105］博士在1999年所說：“這些分子工具的普及使得欣賞陽光和珊瑚蟲動(dòng)物體內(nèi)的熒光蛋白之間的相互作用變得重要，并且促使我們考慮如何使這些獨(dú)特的蛋白在生物學(xué)研究中得到最佳應(yīng)用”。通過一些優(yōu)秀突變體的結(jié)構(gòu)分析我們了解了一些能夠引起熒光蛋白性質(zhì)變化的位點(diǎn)，結(jié)合種類繁多的紅色熒光蛋白，配合紅色熒光蛋白的應(yīng)用相信可以設(shè)計(jì)和生產(chǎn)出令人滿意的突變體。

新出現(xiàn)的紅色熒光蛋白肯定會(huì)刺激許多生物學(xué)家的想象力，反之也激發(fā)了生物學(xué)家們對(duì)于開發(fā)新的突變體和新技術(shù)的需求，使他們有高漲的研究熱情。當(dāng)然與此同時(shí)，熒光顯微鏡將不可避免地不斷配備特殊的硬件和軟件功能來配合這些紅色熒光蛋白的使用。例如，用于深層組織和活體成像的顯微鏡的進(jìn)化，是實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)紅色熒光蛋白充分利用的必要條件［106］。

［1］Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, et al. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein［J］. Gene, 1992, 111（2）：229-233.

［2］Matz MV, Fradkov AF, Labas YA, et al. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species［J］. Nat Biotechnol, 1999, 17（10）：969-973.

［3］Strack RL, Strongin DE, Bhattacharyya D, et al. A non-cytotoxic DsRed variant for whole-cell labeling［J］. Nature Methods, 2008, 5（11）：955-957.

［4］Tao W, Evans B, Yao J, et al. Enhanced green fluorescent protein is a nearly ideal long-term expression tracer for hematopoietic stem cells, whereas DsRed-express fluorescent protein is not［J］. Stem Cells, 2007, 25（3）：670-678.

［5］Yang F, Moss LG, Phillips GN Jr. The molecular structure of green fluorescent protein［J］. Nat Biotechnol, 1996, 14（10）：1246-1251.

［6］Orm? M, Cubitt AB, Kallio K, et al. Crystal structure of the green fluorescent protein［J］. Science, 1996, 273（5280）：1392-1395.

［7］Subach OM, Patterson GH, Ting L, et al. A photoswitchable orangeto-far-red fluorescent protein, PSmOrange［J］. Nature Methods, 2011, 8（9）：771-777.

［8］Ehrenberg M, 羅文新, 夏寧邵. 綠色熒光蛋白——發(fā)現(xiàn)、表達(dá)和發(fā)展［J］. 生物物理學(xué)報(bào), 2008（6）：422-429.

［9］Park N, Song J, Jeong S, et al. Vaccinia-related kinase 3（VRK3）sets the circadian period and amplitude by affecting the subcellular localization of clock proteins in mammalian cells［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2017, 487（2）：320-326.

［10］Zhao D, Xue C, Lin S, et al. Notch signaling pathway regulates angiogenesis via endothelial cell in 3D Co-culture model［J］. Journal of Cellular Physiology, 2017, 232（6）：1548-1558.

［11］Wachter RM, Watkins JL, Kim H. Mechanistic diversity of red fluorescence acquisition by GFP-like proteins［J］. Biochemistry, 2010, 49（35）：7417-7427.

［12］Strack RL, Bhattacharyya D, Glick BS, et al. Noncytotoxic orange and red/green derivatives of DsRed-Express2 for whole-cell labeling［J］. BMC Biotechnology, 2009, 9：32.

［13］Dash AK, Yende AS, Tyagi RK. Novel Application of red fluorescent protein（DsRed-Express）for the study of functional dynamics of nuclear receptors［J］. Journal of Fluorescence, 2017：1-7.

［14］Shaner NC, Lin MZ, Mckeown MR, et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins［J］. Nature Methods, 2008, 5（6）：545-551.

［15］Merzlyak EM, Goedhart J, Shcherbo D, et al. Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime［J］. Nat Methods, 2007, 4（7）：555-557.

［16］Sakaue-Sawano A, Kurokawa H, Morimura T, et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression［J］. Cell, 2008, 132（3）：487-498.

［17］Tsutsui H, Karasawa S, Okamura Y, et al. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins［J］. Nat Methods, 2008, 5（8）：683-685.

［18］Bindels DS, Haarbosch L, van Weeren L, et al. mScarlet：a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging［J］. Nat Methods, 2017, 14（1）：53-56.

［19］Pandelieva AT, Baran MJ, Calderini GF, et al. Brighter red fluorescent proteins by rational design of triple-decker motif［J］. ACS Chemical Biology, 2016, 11（2）：508-517.

［20］Fan Y, Ai H. Development of redox-sensitive red fluorescent proteins for imaging redox dynamics in cellular compartments［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2016, 408（11）：2901-2911.

［21］Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein［J］. Nat Biotechnol, 2004, 22（12）：1567-1572.

［22］Wannier TM, Moore MM, Mou Y, et al. Computational design of the β-sheet surface of a red fluorescent protein allows control of protein oligomerization［J］. PLoS One, 2015, 10（6）：e130582.

［23］Hasegawa J, Ise T, Fujimoto KJ, et al. Excited States of fluorescent proteins, mKO and DsRed：chromophore-protein electrostaticinteraction behind the color variations［J］. The Journal of Physical Chemistry B, 2010, 114（8）：2971-2979.

［24］Bravaya KB, Grigorenko BL, Nemukhin AV, et al. Quantum chemistry behind bioimaging：insights from Ab initio studies of fluorescent proteins and their chromophores［J］. Accounts of Chemical Research, 2012, 45（2）：265-275.

［25］Ikmi A, Gibson MC. Identification and in vivo characterization of NvFP-7R, a developmentally regulated red fluorescent protein of Nematostella vectensis［J］. PLoS One, 2010, 5（7）：e11807.

［26］Shcherbo D, Murphy CS, Ermakova GV, et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues［J］. The Biochemical Journal, 2009, 418（3）：567-574.

［27］Kredel S, Nienhaus K, Oswald F, et al. Optimized and far-redemitting variants of fluorescent protein eqFP611［J］. Chemistry & Biology, 2008, 15（3）：224-233.

［28］Chica RA, Moore MM, Allen BD, et al. Generation of longer emission wavelength red fluorescent proteins using computationally designed libraries［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107（47）：20257-20262.

［29］Shkrob MA, Yanushevich YG, Chudakov DM, et al. Far-red fluorescent proteins evolved from a blue chromoprotein from Actinia equina［J］. Biochemical Journal, 2005, 392（Pt 3）：649-654.

［30］Wannier TM, Mayo SL. The structure of a far-red fluorescent protein, AQ143, shows evidence in support of reported red-shifting chromophore interactions［J］. Protein Science：A Publication of the Protein Society, 2014, 23（8）：1148-1153.

［31］Mcisaac RS, Engqvist MKM, Wannier T, et al. Directed evolution of a far-red fluorescent rhodopsin［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111（36）：13034-13039.

［32］Konold PE, Yoon E, Lee J, et al. Fluorescence from multiple chromophore hydrogen-bonding states in the far-red protein TagRFP675［J］. The Journal of Physical Chemistry Letters, 2016, 7（15）：3046-3051.

［33］Hense A, Prunsche B, Gao P, et al. Monomeric Garnet, a far-red fluorescent protein for live-cell STED imaging［J］. Scientific Reports, 2015, 5：18006.

［34］Yu D, Dong Z, Gustafson WC, et al. Rational design of a monomeric and photostable far red fluorescent protein for fluorescence imaging in vivo［J］. Protein Science：A Publication of the Protein Society, 2015, 25（2）：308-315.

［35］Bajar BT, Lam AJ, Badiee RK, et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases［J］. Nat Methods, 2016, 13（12）：993-996.

［36］Li Z, Zhang Z, Bi L, et al. Mutagenesis of mNeptune red-shifts emission spectrum to 681-685 nm［J］. PLoS One, 2016, 11（4）：e148749.

［37］Ren H, Yang B, Ma C, et al. Cysteine sulfoxidation increases the photostability of red fluorescent proteins［J］. ACS Chemical Biology, 2016, 11（10）：2679-2684.

［38］Shcherbo D, Merzlyak EM, Chepurnykh TV, et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging［J］. Nat Methods, 2007, 4（9）：741-746.

［39］Shcherbo D, Shemiakina II, Ryabova AV, et al. Near-infrared fluorescent proteins［J］. Nature Methods, 2010, 7（10）：827-829.

［40］Armengol P, Gelabert R, Moreno M, et al. Chromophore interactions leading to different absorption spectra in mNeptune1 and mCardinal red fluorescent proteins［J］. Physical Chemistry Chemical Physics, 2016, 18（25）：16964-16976.

［41］Shu X, Royant A, Lin MZ, et al. Mammalian expression of infrared fluorescent proteins engineered from a bacterial phytochrome［J］. Science（New York, N. Y. ）, 2009, 324（5928）：804-807.

［42］Filonov GS, Piatkevich KD, Ting L, et al. Bright and stable near infra-red fluorescent protein for in vivo imaging［J］. Nature Biotechnology, 2011, 29（8）：757-761.

［43］Lin L, Wang B, Chen J, et al. mPlum-IFP 1. 4 fluorescent fusion protein may display F?rster resonance energy transfer associated properties that can be used for near-infrared based reporter gene imaging［J］. Journal of Biomedical Optics, 2013, 18（12）：126013.

［44］Bajar BT, Wang ES, Zhang S, et al. A guide to fluorescent protein FRET pairs［J］. Sensors（Basel, Switzerland）, 2016, 16（9）：1488.

［45］Moore MM, Oteng-Pabi SK, Pandelieva AT, et al. Recovery of red fluorescent protein chromophore maturation deficiency through rational design［J］. PLoS One, 2012, 7（12）：e52463.

［46］Veal EA, Day AM, Morgan BA. Hydrogen peroxide sensing and signaling［J］. Molecular Cell, 2007, 26（1）：1-14.

［47］Kumagai A, Ando R, Miyatake H, et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle［J］. Cell, 2013, 153（7）：1602-1611.

［48］Rodriguez EA, Tran GN, Gross LA, et al. A far-red fluorescent protein evolved from a cyanobacterial phycobiliprotein［J］. Nature Methods, 2016, 13（9）：763-769.

［49］Ai H, Hazelwood KL, Davidson MW, et al. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors［J］. 2008, 5（5）：401-403.

［50］Shcherbakova DM, Hink MA, Joosen L, et al. An orange fluorescent protein with a large Stokes shift for single-excitation multicolor FCCS and FRET imaging［J］. Journal of the American Chemical Society, 2012, 134（18）：7913-7923.

［51］Kogure T, Karasawa S, Araki T, et al. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy［J］. Nat Biotechnol, 2006, 24（5）：577-581.

［52］Piatkevich KD, Hulit J, Subach OM, et al. Monomeric red fluorescent proteins with a large Stokes shift［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107（12）：5369-5374.

［53］Kennis JTM, van Stokkum IHM, Peterson DS, et al. Ultrafast proton shuttling in psammocora cyan fluorescent protein［J］. The Journal of Physical Chemistry B, 2013, 117（38）：11134-11143.

［54］Fron E, De Keersmaecker H, Rocha S, et al. Mechanism behind the apparent large stokes shift in lssmorange investigated by timeresolved spectroscopy［J］. The Journal of Physical Chemistry B, 2015, 119（47）：14880-14891.

［55］Piatkevich KD, Malashkevich VN, Almo SC, et al. Engineering ESPT pathways based on structural analysis of LSSmKate red fluorescent proteins with large Stokes shift［J］. Journal of the American Chemical Society, 2010, 132（31）：10762-10770.

［56］Guan Y, Meurer M, Raghavan S, et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein［J］. Molecular Biology of the Cell, 2014, 26（11）：2054-2066.

［57］Piatkevich KD, English BP, Malashkevich VN, et al. Photoswitchable red fluorescent protein with a large Stokes shift［J］. Chemistry & Biology, 2014, 21（10）：1402-1414.

［58］Yang J, Wang L, Yang F, et al. mBeRFP, an improved large stokes shift red fluorescent protein［J］. PLoS One, 2013, 8（6）：e64849.

［59］Pletnev S, Shcherbakova DM, Subach OM, et al. Orange fluorescent proteins：structural studies of LSSmOrange, PSmOrange and PSmOrange2［J］. PLoS One, 2014, 9（6）：e99136.

［60］Bacia K, Kim SA, Schwille P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells［J］. Nat Methods, 2006, 3（2）：83-89.

［61］Lindenburg LH, Malisauskas M, Sips T, et al. Quantifying stickiness：thermodynamic characterization of intramolecular domain interactions to guide the design of f?rster resonance energy transfer sensors［J］. Biochemistry, 2014, 53（40）：6370-6381.

［62］Laviv T, Kim BB, Chu J, et al. Simultaneous dual-color fluorescence lifetime imaging with novel red-shifted fluorescent proteins［J］. 2016, 13（12）：989-992.

［63］Zhu X, Zhang L, Kao Y, et al. A tunable fluorescent timer method for imaging spatial-temporal protein dynamics using light-driven photoconvertible protein［J］. Journal of Biophotonics, 2015, 8（3）：226-232.

［64］Takamura A, Hattori M, Yoshimura H, et al. Simultaneous timelamination imaging of protein association using a split fluorescent timer protein［J］. Analytical Chemistry, 2015, 87（6）：3366-3372.

［65］Tsuboi T, Kitaguchi T, Karasawa S, et al. Age-dependent preferential dense-core vesicle exocytosis in neuroendocrine cells revealed by newly developed monomeric fluorescent timer protein［J］. Molecular Biology of the Cell, 2009, 21（1）：87-94.

［66］Khmelinskii A, Keller PJ, Bartosik A, et al. Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics［J］. Nat Biotechnol, 2012, 30（7）：708-714.

［67］Barry JD, Donà E, Gilmour D, et al. TimerQuant：a modelling approach to tandem fluorescent timer design and data interpretation for measuring protein turnover in embryos［J］. Development（Cambridge, England）, 2015, 143（1）：174-179.

［68］Khmelinskii A, Knop M. Analysis of protein dynamics with tandem fluorescent protein timers［M］. Exocytosis and Endocytosis, Ivanov AI, New York：Springer New York, 2014, 195-210.

［69］Dona E, Barry JD, Valentin G, et al. Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient［J］. Nature, 2013,503（7475）：285-289.

［70］Khmelinskii A, Meurer M, Ho C, et al. Incomplete proteasomal degradation of green fluorescent proteins in the context of tandem fluorescent protein timers［J］. Molecular Biology of the Cell, 2015, 27（2）：360-370.

［71］Subach FV, Patterson GH, Renz M, et al. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color superresolution sptPALM of live cells［J］. Journal of the American Chemical Society, 2010, 132（18）：6481-6491.

［72］Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PSCFP2 and Dendra2［J］. 2007, 2（8）：2024-2032.

［73］Zhang M, Chang H, Zhang Y, et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins［J］. 2012, 9（7）：727-729.

［74］Hoi H, Shaner NC, Davidson MW, et al. A monomeric photoconvertible fluorescent protein for imaging of dynamic protein localization［J］. Journal of Molecular Biology, 2010, 401（5）：776-791.

［75］Subach OM, Patterson GH, Ting L, et al. A photoswitchable orangeto-far-red fluorescent protein, PSmOrange［J］. Nature Methods, 2011, 8（9）：771-777.

［76］Piatkevich KD, Subach FV, Verkhusha VV. Far-red light photoactivatable near-infrared fluorescent proteins engineered from a bacterial phytochrome［J］. Nature Communications, 2013, 4：2153.

［77］Griswold SL, Sajja KC, Jang C, et al. Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time lapse imaging during development［J］. Genesis, 2011, 49（7）：591-598.

［78］Nickerson A, Huang T, Lin L, et al. Photoactivated localization microscopy with bimolecular fluorescence complementation（BiFCPALM）［J］. J Vis Exp, 2015（106）：e53154.

［79］Shroff H, White H, Betzig E. Photoactivated localization microscopy（PALM）of adhesion complexes［J］. Current Protocols in Cell Biology, 2013, Chapter 4：t4.t21.

［80］Brown TA, Tkachuk AN, Shtengel G, et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction［J］. Molecular and Cellular Biology, 2011, 31（24）：4994-5010.

［81］Wang S, Moffitt JR, Dempsey GT, et al. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for singlemolecule-based superresolution imaging［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111（23）：8452-8457.

［82］Mckinney SA, Murphy CS, Hazelwood KL, et al. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags［J］. Nature Methods, 2009, 6（2）：131-133.

［83］Fuchs J, Bohme S, Oswald F, et al. A photoactivatable marker protein for pulse-chase imaging with superresolution［J］. 2010, 7（8）：627-630.

［84］Subach OM, Entenberg D, Condeelis JS, et al. A FRET-facilitated photoswitching using an orange fluorescent protein with the fast photoconversion kinetics［J］. Journal of the American Chemical Society, 2012, 134（36）：14789-14799.

［85］Subach FV, Subach OM, Gundorov IS, et al. Monomeric fluorescent timers that change color from blue to red report on cellular trafficking［J］. Nature Chemical Biology, 2009, 5（2）：118-126.

［86］Tsuboi T, Kitaguchi T, Karasawa S, et al. Age-dependent preferential dense-core vesicle exocytosis in neuroendocrine cells revealed by newly developed monomeric fluorescent timer protein［J］. Molecular Biology of the Cell, 2009, 21（1）：87-94.

［87］Griswold SL, Sajja KC, Jang C, et al. Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time lapse imaging during development［J］. Genesis, 2011, 49（7）：591-598.

［88］Jensen NA, Danzl JG, Willig KI, et al. Coordinate-targeted and coordinate-stochastic super-resolution microscopy with the reversibly switchable fluorescent protein dreiklang［J］. Chemphyschem, 2014, 15（4）：756-762.

［89］Duwé S, Moeyaert B, Dedecker P. Diffraction-unlimited fluorescence microscopy of living biological samples using pcSOFI［J］. Curr Protoc Chem Biol, 2015, 7：27-41.

［90］Wang S, Chen X, Chang L, et al. GMars-Q enables long-term livecell parallelized reversible saturable optical fluorescence transitions nanoscopy［J］. ACS Nano, 2016, 10（10）：9136-9144.

［91］Lavoie-Cardinal F, Jensen NA, Westphal V, et al. Two-color RESOLFT nanoscopy with green and red fluorescent photochromicproteins［J］. Chemphyschem, 2014, 15（4）：655-663.

［92］Zhang X, Zhang M, Li D, et al. Highly photostable, reversibly photoswitchable fluorescent protein with high contrast ratio for livecell superresolution microscopy［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113（37）：10364-10369.

［93］El Khatib M, Martins A, Bourgeois D, et al. Rational design of ultrastable and reversibly photoswitchable fluorescent proteins for super-resolution imaging of the bacterial periplasm［J］. Scientific Reports, 2016, 6：18459.

［94］Smyrnova D, Zinovjev K, Tu?ón I, et al. Thermal isomerization mechanism in dronpa and its mutants［J］. The Journal of Physical Chemistry B, 2016, 120（50）：12820-12825.

［95］Zhang X, Chen X, Zeng Z, et al. Development of a reversibly switchable fluorescent protein for super-resolution optical fluctuation imaging（SOFI）［J］. ACS Nano, 2015, 9（3）：2659-2667.

［96］Morozov D, Groenhof G. Hydrogen bond fluctuations control photochromism in a reversibly photo-switchable fluorescent protein［J］. Angewandte Chemie International Edition, 2016, 55（2）：576-578.

［97］Subach OM, Malashkevich VN, Zencheck WD, et al. Structural characterization of acylimine-containing blue and red chromophores in mTagBFP and TagRFP fluorescent proteins［J］. Chemistry & Biology, 2010, 17（4）：333-341.

［98］Armengol P, Gelabert R, Moreno M, et al. New insights into the structure-spectrum relationship in S65T/H148D and E222Q/H148D green fluorescent protein mutants：a theoretical assessment［J］. Organic & Biomolecular Chemistry, 2014, 12（48）：9845-9852.

［99］Pletnev S, Subach FV, Dauter Z, et al. Understanding blue-tored conversion in monomeric fluorescent timers and hydrolytic degradation of their chromophores［J］. Journal of the American Chemical Society, 2010, 132（7）：2243-2253.

［100］Henderson JN, Osborn MF, Koon N, et al. Excited state proton transfer in the red fluorescent protein mKeima［J］. Journal of the American Chemical Society, 2009, 131（37）：13212-13213.

［101］Shu X, Wang L, Colip L, et al. Unique interactions between the chromophore and glutamate 16 lead to far-red emission in a red fluorescent protein［J］. Protein Science：A Publication of the Protein Society, 2009, 18（2）：460-466.

［102］Takemoto K, Matsuda T, Sakai N, et al. SuperNova, a monomeric photosensitizing fluorescent protein for chromophore-assisted light inactivation［J］. Scientific Reports, 2013, 3：2629.

［103］Pletneva NV, Pletnev VZ, Sarkisyan KS, et al. Crystal structure of phototoxic orange fluorescent proteins with a tryptophan-based chromophore［J］. PLoS One, 2015, 10（12）：e145740.

［104］Subach OM, Cranfill PJ, Davidson MW, et al. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore［J］. PLoS One, 2011, 6（12）：e28674.

［105］Tsien RY. Rosy dawn for fluorescent proteins［J］. Nat Biotechnol, 1999, 17（10）：956-957.

［106］Bindels DS, Haarbosch L, van Weeren L, et al. mScarlet：a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging［J］. 2017, 14（1）：53-56.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Red Fluorescent Protein

WANG Fei YANG Hai-tao WANG Ze-fang
（School of Life Science，Tianjin University，Tianjin 300000）

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0401

2017-05-25

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)發(fā)展計(jì)劃（“973計(jì)劃”）

王飛，女，碩士，研究方向：分子生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)；E-mail：wang2010fei46@163.com

王澤方，男，博士，副研究員，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程；E-mail：zefangwang@tju.edu.cn