高效液相色譜法測定山茶油中麥角甾醇含量

張志舟，張 飛，李勝男，陳秀敏，蔡群娣

(中國廣州分析測試中心 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510070)

分析與測試

高效液相色譜法測定山茶油中麥角甾醇含量

張志舟，張 飛，李勝男，陳秀敏，蔡群娣

(中國廣州分析測試中心 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510070)

以麥角甾醇為測定目標(biāo)，建立測定山茶油中麥角甾醇的高效液相色譜法。樣品經(jīng)皂化提取后，采用高效液相色譜法進(jìn)行測定。色譜條件為：C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動相為純甲醇；流速1.0 mL/min；紫外檢測器：波長282 nm；進(jìn)樣量20μL；外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：麥角甾醇線性回歸方程為Y=31.173X+0.3008(X為標(biāo)物濃度，mg/L)，R2為0.99999，在0.50～10.0mg/L范圍內(nèi)線性良好，方法回收率為94.5%～102%，RSD為3.56%，檢出限為1.0 mg/kg。本方法測定茶油中麥角甾醇含量準(zhǔn)確、重復(fù)性好、靈敏度高。

麥角甾醇；山茶油；高效液相色譜法

茶油又稱山茶油、茶籽油，是一種從油茶樹種子中獲得的，可以與橄欖油相媲美的高級植物油，經(jīng)過精煉之后的品質(zhì)更佳[1]。茶油主要由油酸、亞油酸和少量的飽和脂肪酸組成[2]，不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%以上[3]，茶油還富含角鯊烯、茶多酚、皂甙、脂溶性的維生素以及甾醇類物質(zhì)[4]，其保健作用以及營養(yǎng)價值也十分突出，古代醫(yī)書《本草綱目》中記載，“茶籽，寒苦香毒，主治喘咳，去疾垢… …” ；據(jù)現(xiàn)代科學(xué)研究，茶油具有改善血液循環(huán)、降血脂、調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化、預(yù)防肥胖、護(hù)肝解毒、消炎鎮(zhèn)痛等作用[5-7]。

麥角甾醇是一種廣泛存在于真菌類植物的植物甾醇類化合物[8]，是甾醇化合物的一種，為脂溶性維生素D2的前體[9]，其具有抗癌、防衰老、減毒等功能[10]。麥角甾醇作為真菌類的特征甾醇[11]，對于在真菌類植物中麥角甾醇的研究已經(jīng)非常深入[12-13]，但在茶油當(dāng)中的研究以及報道還比較少，麥角甾醇通常以兩種形式存在[14], 即儲存在真菌細(xì)胞膜中的游離麥角甾醇和儲存在細(xì)胞液脂粒中的酯化麥角甾醇，關(guān)于游離態(tài)的測定的研究很多，而且方法也較為成熟，但對于酯化麥角甾醇的測定方法還鮮有報道，本實驗基于酯化麥角甾醇的性質(zhì)，且存在于山茶油中的麥角甾醇均為酯化的形式，通過對油脂樣品進(jìn)行皂化，建立山茶油中麥角甾醇含量的測定，為測定酯化態(tài)的麥角甾醇提供HPLC的測定方法。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀-紫外檢測器(DAD)(安捷倫科技(中國)有限公司)；FYC-500*8全自動旋轉(zhuǎn)萃取器(北京國環(huán)高科自動化科技研究院)；HH-6J數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋(金壇市城東盛聯(lián)實驗廠)；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI實驗室儀器公司)；BT125D電子天平(Sartorius)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)與試劑

麥角甾醇(≥99.0%，Dr.Ehrenstorfer)；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)(上海晶純生化科技股份有限公司，分析純)；焦性沒食子酸(廣東省化學(xué)試劑工程科技研究開發(fā)中心，分析純)；氫氧化鉀(廣州化學(xué)試劑廠，分析純)；甲醇(Honeywell色譜純)；無水乙醇(廣州化學(xué)試劑廠，分析純)；正己烷(廣州化學(xué)試劑廠，分析純)；三級水；無水硫酸鈉(廣州化學(xué)試劑廠，分析純)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取麥角甾醇對照品0.01010 g于100.0 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.4 樣品前處理

樣品的提取與凈化：準(zhǔn)確稱取樣品約2.0 g置于回流裝置的250 mL的磨口三角瓶中，加入0.2 g抗氧化劑BHT、1 g維生素C、1 g焦性沒食子酸以及40 mL無水乙醇混合均勻，再加10 mL 50%氫氧化鉀溶液，置于75℃攪拌水浴鍋中回流60min，皂化后立即放入冰水中冷卻。

將上述皂化后的溶液轉(zhuǎn)移至500 mL分液漏斗中，用30 mL的三級水分3次清洗三角瓶的殘留物，洗液一并倒入分液漏斗中，加入50 mL正己烷，分液漏斗置于全自動旋轉(zhuǎn)萃取器，震搖萃取5min，靜置分層，將下層水相溶液轉(zhuǎn)移到另一個分液漏斗中，再重復(fù)萃取兩次，合并上層正己烷，用三級水洗至中性。將洗至中性的正己烷過裝有適量無水硫酸鈉的濾紙，濾液裝在200 mL三角瓶內(nèi)，用少量正己烷洗滌無水硫酸鈉及濾紙合并于濾液。濾液在30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，往三角瓶中準(zhǔn)確加入5.0 mL甲醇，溶解殘留物，搖勻后，溶液過0.45μm濾頭，濾液供液相色譜測試。

1.5 色譜條件

色譜柱：安捷倫C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫30 ℃；檢測波長：波長282 nm，流動相：純甲醇。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

基于麥角甾醇的存在的兩種形態(tài)，麥角甾醇的提取主流的也有兩種方法，對于游離態(tài)的麥角甾醇，主要采取超聲波提取法；而對于以酯化形式存在的，一般采用皂化提取法[16],先把酯化的麥角甾醇經(jīng)氫氧化鉀溶液皂化變成游離態(tài)的麥角甾醇，本實驗加入無水乙醇，可以使油脂樣品與氫氧化鉀溶液進(jìn)一步的混合在一起，使油脂分子與堿液之間的接觸面變大，加快了皂化的速率，從而減少外界光照、氧氣等因素對麥角甾醇的影響。直接超聲提取法是適用于游離態(tài)麥角甾醇的測定。皂化提取法則適用于油脂樣品或者存在形式是酯化態(tài)的樣品。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

采用高效液相色譜測定麥角甾醇時，主要有正相色譜法和反相高效液相色譜法；GB/T 25221-2010采用的就是正相色譜法，但正相色譜法使用的流動相一般都為正己烷、環(huán)己烷等烷烴類試劑，該類試劑毒性比較大，而且氣味很重，長期使用會是實驗人員出現(xiàn)頭暈、惡心等現(xiàn)象。在反相高效液相色譜流動相的選擇時，因麥角甾醇是維生素D2的前體，結(jié)構(gòu)跟維生素D2較為相像，故參考了維生素D的測定時的流動相，選擇了甲醇：水=95:5以及純甲醇進(jìn)行比較，得到結(jié)果為純甲醇作為流動相時，出峰時間較為合適，分離度能夠到達(dá)日常檢測需求，色譜峰對稱因子為0.89，塔板數(shù)為16890；故選擇純甲醇最終流動相。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖以及樣品中色譜圖見圖1、圖2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard solution

圖2 山茶油樣品的液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of camellia oil sample

2.3 線性范圍

用甲醇將麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成濃度分別為0.50、1.00、2.50、5.00、10.0 mg/L，進(jìn)行測定，以麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)系列濃度(X)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得到的線性方程為Y=31.173X+0.3008，R2=0.99999，可知麥角甾醇在0.50～10.0 mg/L范圍內(nèi)，線性良好。

2.4 檢出限與定量限

麥角甾醇檢出限為1.0 mg/kg(信噪比S/N=3)；定量限為3.0 mg/kg(信噪比S/N=10)。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗

選定濃度為5.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)樣量為20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，求得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.35%，系統(tǒng)精密度良好，對稱因子為0.89，塔板數(shù)為16890。

2.6 重復(fù)性實驗

取山茶油樣品6份，按照“1.4”進(jìn)行樣品前處理，制得樣液，供液相色譜測定使用，求得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.56 %，符合要求，方法重復(fù)性良好。

2.7 加標(biāo)回收率

另取樣品6份，加入麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加標(biāo)量為6.0 mg/kg。按照“1.4”進(jìn)行處理，采用外標(biāo)法定量，求得樣品加標(biāo)回收率為94.5 %～102 %。方法的準(zhǔn)確度較好，可滿足日常檢測要求。

3 結(jié)論

本方法建立了山茶油中麥角甾醇的反相高效液相色譜法。該方法適用于山茶油中麥角甾醇的測定，該方法系統(tǒng)適用性實驗滿足要求、線性良好、檢出限低、方法準(zhǔn)確性高、靈敏、快速，可適用于山茶油中麥角甾醇的測定，也可為其它動植物油脂中麥角甾醇的檢測提供技術(shù)參考。

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(本文文獻(xiàn)格式：張志舟，張 飛，李勝男，等.高效液相色譜法測定山茶油中麥角甾醇含量[J].山東化工,2017,46(13):68-70.)

Determination of Ergosterol in Camellia Oil by High Performance Liquid Chromatography

ZhangZhizhou,ZhangFei,LiShengnan,ChenXiumin,CaiQundi

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals,China National Analytical Center(Guangzhou),Guangzhou 510070,China)

A new method for determination of ergosterol in camellia oil by reversed-phase high performance liquid chromatography.Peanuts were analyzed by high performance liquid chromatography after saponification with KOH- ethanol solution.The separation of ergosterol was conducted on a C18 column (4.6 mm×250 mm，5μm ) with the mobile phase of methanol.The flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was 282 nmand injection volume was 20μL. The egosterol was quantified by the external standard method.The linear regression equation was Y=31.173X+0.3008 with the range of 0.50～10.0mg/L.The correlation coefficients was 0.9999.The average recoveries of samples was in the range of 94.5%～102% and RSD was 3.56%. The determination of limit was1.0mg/kg. The results indicate that the method is accurate ,reliable and reproducibility in the analysis of camellia oil.

ergosterol;camellia oil;high-performance liquid chromatography(HPLC)

2017-05-02

廣東省科技計劃項目(2013B091604003)；廣東省科技計劃項目(2015B090906023)；廣東省科技計劃項目(2013B020501005)

張志舟(1988—)，男，廣東肇慶人，本科，助理工程師，主要從事食品、保健品、飼料安全檢測。

O657.7+2

A

1008-021X(2017)13-0068-03