印楝素A和印楝素B對棉鈴蟲生長發(fā)育的影響

路 偉，李佳琪，鄺鵬昆，肖紹偉，王茂源，郭永超，徐漢虹

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

印楝素A和印楝素B對棉鈴蟲生長發(fā)育的影響

路 偉1**，李佳琪1*，鄺鵬昆1，肖紹偉1，王茂源1，郭永超1，徐漢虹2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

為了明確印楝素A和印楝素B生物活性的差異，選用印楝素A和印楝素B對棉鈴蟲生長發(fā)育的影響進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明：印楝素A和印楝素B對棉鈴蟲3齡幼蟲具有良好的拒食活性，5 μg/mL處理48 h對棉鈴蟲3齡幼蟲的拒食率分別為85.17%和69.02%。分別用含有藥劑(1 μg/mL)的飼料飼喂棉鈴蟲5齡幼蟲，結(jié)果表明：印楝素A和印楝素B能夠明顯抑制棉鈴蟲5齡幼蟲的體重增長，處理14 d后幼蟲的體重分別下降50.28%和43.08%，僅有少量個(gè)體化蛹，化蛹率分別為26.67%和13.33%。進(jìn)一步的羽化結(jié)果表明：經(jīng)印楝素A和印楝素B處理的蟲蛹均未能完成羽化。綜合各階段試驗(yàn)結(jié)果來看，印楝素A和印楝素B的生物活性存在差異，印楝素B對棉鈴蟲生長發(fā)育的抑制作用高于印楝素A。

印楝素A；印楝素B；棉鈴蟲；生物活性；作用機(jī)理

印楝素(azadirachtin)是從印楝樹種子里提取的一種植物源殺蟲劑，屬于四環(huán)三萜類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)大體可分為十氫化萘和三環(huán)呋喃左右兩部分(徐漢虹，2001)，對400多種農(nóng)、林、衛(wèi)生害蟲具有拒食、抑制昆蟲生長發(fā)育、忌避、胃毒和絕育等生物活性，且害蟲不易產(chǎn)生抗藥性(Morgan，2009)。印楝素是當(dāng)前世界公認(rèn)的廣譜、高效的環(huán)境友好型殺蟲劑(陳小軍等，2010)。印楝素及其類似物繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前已分離出印楝素A、B、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、O、P、Q 15種印楝素類似物(Kouletal.，2003；Kanokmedhakuletal.，2005；徐漢虹等，2017)，在印楝素10多種類似物中，印楝素A(AZA-A)的含量最高、拒食活性最強(qiáng)(徐漢虹等，2017)。另一個(gè)重要成分是印楝素B(AZA-B，3-tigloylazadirachtol)，AZA-B的含量為AZA-A的1/3～1/2(張志祥等，2007)。一般認(rèn)為印楝素直接或間接地通過破壞昆蟲口器上的化學(xué)感受器，刺激其特異性抑制型感覺細(xì)胞，或者阻斷對取食刺激物起反應(yīng)的感受器受體細(xì)胞的信號輸入，從而抑制昆蟲的取食行為(Luoetal.，1995；Mordueetal.，1998)；干擾昆蟲內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響促前胸腺激素(PTTH)的合成與釋放，使幼蟲不能正常蛻皮和化蛹而導(dǎo)致死亡(李曉東和趙善歡，1995；Laietal.，2014)。目前國內(nèi)外對AZA-B的研究較少，本文對比研究了AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲Heliothisarmigera生長發(fā)育的影響，以期為進(jìn)一步明確印楝素及其類似物的作用機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 印楝素A和印楝素B的化學(xué)結(jié)構(gòu)式(徐漢虹，2001)Fig.1 Chemical structural formula of azadirachtin A and azadirachtin B(Xiu HH,2001)

1 材料與方法

1.1 供試材料

AZA-A(純度97.0%)、AZA-B(純度95.2%)均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 供試?yán)ハx

敏感品系的棉鈴蟲由中國農(nóng)科院植物保護(hù)研究所棉花害蟲研究組養(yǎng)蟲室室內(nèi)人工飼料飼養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1拒食活性測定

參考張志祥等(2007)的方法。將新鮮潔凈的常規(guī)棉花葉片，用打孔器打成直徑2 cm的葉碟。將AZA-A、AZA-B用丙酮-水(1 ∶3，v/v)配制成5 μg/mL的供試藥液，將葉碟在供試藥液中浸3 s后取出，室溫晾干后將葉碟放入墊有保濕濾紙的培養(yǎng)皿(Φ=9 cm)中，每個(gè)皿放入3片葉碟、接1頭饑餓處理6 h的棉鈴蟲3齡幼蟲，每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)，超純水作為空白對照。48 h后測定剩余葉面積，計(jì)算非選擇性拒食率。非選擇性拒食率計(jì)算公式如下：

1.3.2對試蟲體重和化蛹率的影響

選取棉鈴蟲5齡幼蟲，將1 μg/mL AZA-A、AZA-B的藥劑分別添加至飼料中，每個(gè)指型管內(nèi)1頭5齡幼蟲、并放入含有藥劑的飼料，每個(gè)處理15個(gè)重復(fù)。正常飼料作為空白對照。每2 d稱重記錄棉鈴蟲的體重，并觀察棉鈴蟲的化蛹?xì)v期、化蛹率。

1.3.3對試蟲蛹重和羽化率的影響

每2 d稱重記錄棉鈴蟲的蛹重，繼續(xù)觀察1.3.2每組處理試蟲的蛹重變化及羽化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 AZA-A和AZA-B的拒食活性比較

AZA-A和AZA-B處理48 h后對棉鈴蟲3齡幼蟲的非選擇性拒食活性結(jié)果見表1。結(jié)果表明：AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲3齡幼蟲均表現(xiàn)出良好的拒食活性，在5 μg/mL的劑量下處理48 h，對棉鈴蟲3齡幼蟲的拒食率分別為85.17%和69.02%，與對照處理差異顯著，AZA-A和AZA-B處理之間差異不顯著。

2.2 AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲幼蟲體重和化蛹率的影響

試驗(yàn)結(jié)果(見表2)表明，對照組棉鈴蟲5齡幼蟲經(jīng)過15.67 d的化蛹?xì)v期后蛻皮化蛹，化蛹率達(dá)到86.67%。而AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲幼蟲的體重增長具有明顯抑制作用，與對照組相比，1 μg/mL劑量處理4 d后，棉鈴蟲5齡幼蟲的體重分別下降33.15%和30.54%；處理14 d后，棉鈴蟲5齡幼蟲的體重分別下降50.28%和43.08%，少量個(gè)體死亡，AZA-A對棉鈴蟲體重抑制作用優(yōu)于AZA-B。與對照組相比，AZA-A和AZA-B處理組化蛹率僅為26.67%和13.33%，大部分高齡幼蟲的發(fā)育停滯在幼蟲階段，未能完成蛻皮化蛹，與對照組相比差異顯著。AZA-A和AZA-B處理組中少量的化蛹個(gè)體平均化蛹?xì)v期也呈現(xiàn)滯后推遲，分別為17.63 d和18.50 d，說明AZA-B對棉鈴蟲幼蟲化蛹的抑制作用高于AZA-A。

2.3 AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲蛹重和羽化率的影響

繼續(xù)觀察每組處理試蟲的蛹重變化及羽化情況，試驗(yàn)結(jié)果見表3。結(jié)果表明：棉鈴蟲蛹期的蛹重呈逐漸下降的趨勢，對照組棉鈴蟲蟲蛹經(jīng)過8.56 d羽化，羽化率為75.00%。而AZA-A和AZA-B處理組的蟲蛹均未能完成羽化。

表1 AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲3齡幼蟲的非選擇性拒食活性(48 h)

注：采用鄧肯氏多重比較進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。Note: Duncan’s multiple comparisons were used for significance analysis (P<0.05).

表2 AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲5齡幼蟲體重的影響

注：采用鄧肯氏多重比較進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。Note: Duncan’s multiple comparisons were used for significance analysis (P<0.05).

表3 AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲蛹重和羽化率的影響

注：采用鄧肯氏多重比較進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。Note: Duncan's multiple comparisons were used for significance analysis (P<0.05).

3 結(jié)論與討論

在印楝素類似物中，AZA-B的含量和拒食活性低于AZA-A，但兩者在印楝素殺蟲劑中都具有重要的作用。印楝素對鱗翅目、膜翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目和纓翅目等400多種農(nóng)、林、倉儲(chǔ)和衛(wèi)生害蟲具有拒食、忌避等生物活性(徐漢虹等，2017)。Liner等(1995)研究發(fā)現(xiàn)印楝素對大菜粉蝶Pierisbrassicae幼蟲中間的栓錐感覺器的抑制型感受細(xì)胞有很強(qiáng)的刺激作用，但是對兩側(cè)的栓錐感覺器的蔗糖、氨基酸和芥子糖苷感受細(xì)胞沒有作用。Mordue等(1998)發(fā)現(xiàn)印楝素及其大部分類似物都刺激了化學(xué)感受器的抑制型神經(jīng)元細(xì)胞，并且指出鱗翅目昆蟲草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda、煙蚜夜蛾Heliothisvirescens、灰翅夜蛾Spodopteralittoralis和棉鈴蟲對印楝素的拒食活性與化學(xué)感受器的神經(jīng)活性有關(guān)。張志祥等(2007)研究發(fā)現(xiàn)AZA-A和AZA-B對小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、斜紋夜蛾Spodopteralitura3齡幼蟲都具有良好的的拒食活性，拒食率均達(dá)80%以上，兩者對棉鈴蟲的拒食活性達(dá)到差異顯著水平。Qiao等(2014)利用電生理膜片鉗技術(shù)研究了印楝素對果蠅的拒食作用，發(fā)現(xiàn)印楝素可以顯著降低果蠅食道下神經(jīng)節(jié)(Suboesophageal ganglion，SOG)Ca2+通道電流的峰值和振幅，并引起SOG興奮性突觸后電流(mEPSCs)頻率的降低，進(jìn)而抑制SOG的自發(fā)乙酰膽堿能的釋放。昆蟲大多數(shù)味覺神經(jīng)元投射于SOG，與取食行為密切相關(guān)，推測印楝素通過抑制昆蟲SOG興奮性膽堿能突觸傳遞和Ca2+通道，干擾昆蟲神經(jīng)中樞系統(tǒng)，從而起到對昆蟲的拒食作用。

印楝素另一主要的作用機(jī)理是調(diào)節(jié)昆蟲生長發(fā)育活性，表現(xiàn)為抑制幼蟲生長發(fā)育，導(dǎo)致幼蟲體質(zhì)量減輕、不能正常發(fā)育，幼蟲蛻皮受阻而死亡，或蛻皮后形成幼蟲-蛹中間體，造成多種器官畸形而致死(Yanetal.，2012；Laietal.，2014)。Koolman等(1988)通過放射免疫法發(fā)現(xiàn)印楝素并不能直接與蛻皮激素受體結(jié)合；對前胸腺合成蛻皮激素也沒有直接作用(Barnbyma & Klocke，1990)。說明蛻皮激素合成量的下降很可能是印楝素作用于靶器官后間接調(diào)控的結(jié)果。Lai等(2014)研究發(fā)現(xiàn)果蠅成蟲盤是印楝素的重要靶器官，印楝素通過誘導(dǎo)幼蟲成蟲盤發(fā)生細(xì)胞凋亡，上調(diào)胰島素樣肽dilp8表達(dá)，進(jìn)而降低PTTH的分泌，印楝素可能通過果蠅幼蟲營養(yǎng)-胰島素信號途徑調(diào)控蛻皮激素、抑制幼蟲生長發(fā)育。

印楝素所引發(fā)的生理效應(yīng)也可能是印楝素作用于細(xì)胞生長發(fā)育、細(xì)胞骨架或其細(xì)胞信號通路后引起的效應(yīng)(Huangetal.，2011；Yanetal.，2012)。Garcia等(1991)發(fā)現(xiàn)印楝素A可以抑制長紅獵蝽Rhodniusprolixus細(xì)胞的有絲分裂。Huang等(2010)研究發(fā)現(xiàn)印楝素可以誘導(dǎo)粉紋夜蛾TrichoplusianiBTI-Tn-5B1-4細(xì)胞程序性死亡，并且AZA-A對粉紋夜蛾BTI-Tn-5B1-4細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞膜電位的影響大于AZA-B；但AZA-B對細(xì)胞核的破損率和破損程度要顯著高于AZA-A，這表明AZA-A和AZA-B在作用機(jī)理上具有一定的差異性。Huang等(2011)發(fā)現(xiàn)p53蛋白參與了印楝素A對Sl-1細(xì)胞周期的阻滯，抑制細(xì)胞增殖過程和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，印楝素A通過調(diào)控Sl-1細(xì)胞中線粒體凋亡通路中Ca2+信號，誘導(dǎo)Sl-1細(xì)胞發(fā)生凋亡。Shao等(2016)發(fā)現(xiàn)印楝素A通過抑制斜紋夜蛾Sl-1細(xì)胞信號通路PI3K-AKT-Tor的磷酸化水平而誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，同時(shí)通過線粒體途徑激活Caspase-3引發(fā)細(xì)胞凋亡，且印楝素誘導(dǎo)的自噬信號先于凋亡發(fā)生，并通過激活tAtg5分子開關(guān)促發(fā)細(xì)胞自噬向凋亡轉(zhuǎn)化。

AZA-A和AZA-B雖然結(jié)構(gòu)相似，但在母體分析碳環(huán)上C-1、C-3取代基丁烯酯鍵的位置存在差異，環(huán)氧環(huán)C-11取代基也存在“-H”與“-OH”的不同(張志祥等，2005)。Simmonds等(1995)認(rèn)為印楝素母體分子碳環(huán)上C-7、C-11、C-22和C-23是決定生物活性的關(guān)鍵位置，基團(tuán)取代能明顯影響其活性。體重變化、化蛹率和羽化率是昆蟲生長發(fā)育的幾個(gè)重要指標(biāo)，本試驗(yàn)中AZA-A和AZA-B對棉鈴蟲幼蟲都具有良好的拒食活性，并能夠顯著抑制棉鈴蟲幼蟲的蛻皮發(fā)育、化蛹率和羽化率，綜合各階段的試驗(yàn)結(jié)果來看，AZA-B對棉鈴蟲生長發(fā)育的抑制作用要高于AZA-A，引起兩者差異的分子生物學(xué)機(jī)制還有待更深入的研究。

References)

Barnby MA, Klocke JA. Effects of azadirachtin on levels of ecdysteroids and prothoracicotropic hormone-like activity inHeliothisvirescens(Fabr.)larvae [J].JournalofInsectPhysiology, 1990, 36 (2): 125-131.

Chen XJ, Yang YZ, Zhang ZX,etal. Progress on safety evaluation of azadirachtin and neem insecticide [J].EcologyandEnvironmentalSciences, 2010, 19 (6): 1478-1484. [陳小軍, 楊益眾, 張志祥, 等. 印楝素及印楝殺蟲劑的安全性評價(jià)研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2010, 19 (6): 1478-1484]

Garcia ES, Gonzales MS, Azambuja P. Effects of Azadirachtin inRhodniusprolixus: Data and hypotheses [J].MemoriasdoInstitutoOswaldoCruz, 1991, 86 (Supplement 2): 107-111.

Huang JF, Shui KJ, Li HY,etal. Antiproliferative effect of azadirachtin A onSpodopteralituraSl-1 cell line through cell cycle arrest and apoptosis induced by up-regulation of p53 [J].PesticideBiochemistryandPhysiology, 2011, 99 (1): 16-24.

Huang XY, Li OW, Xu HH. Induction of programmed death and cytoskeletal damage onTrichoplusianiBTI-Tn-5B1-4 cells by Azadirachtin [J].PesticideBiochemistryandPhysiology, 2010, 98 (2): 289-295.

Kanokmedhakul S, Kanokmedhakul K, Prajuabsuk T,etal. Azadirachtin derivatives from seed kernels ofAzadirachitaexcelsa[J].JournalofNaturalProducts, 2005, 68 (7): 1047-1050.

Koolman J, Bidmon HJ, Lehmann M,etal. On the mode of action of azadirachtin in blowfly larvae and pupae [C]. Sehnal F, Zabza A, Denlinger DL. Endocrinological Frontiers in Physiological Insect Ecology, Wroclaw: Wroclaw Technical University press, 1988: 55-67.

Koul O, Multani JS, Goomber S,etal. Activity of some nonazadirachtin limonoids fromAzadirachtaindicaagainst lepidopteran larvae [J].AustralianJournalofEntomology, 2004, 43 (2): 189-195.

Lai D, Jin XY, Wang H,etal. Gene expression profile change and growth inhibition inDrosophilalarvae treated with azadirachtin [J].JournalofBiotechnology, 2014, 18 (5): 51-56.

Lin-er L, Van Loon JJA, Schoonhoven LM. Behavioural and sensory responses to some neem compounds byPierisbrassicaelarvae [J].PhysiologicalEntomology, 1995, 20 (2): 134-140.

Li XD, Zhao SH. The toxic effects and mode of azadirachtin on insects [J].JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity, 1995, 17 (1): 118-122. [李曉東, 趙善歡. 印楝素對昆蟲的毒理作用機(jī)制[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1995, 17 (1): 118-122]

Luo L, Van Loon JJA, Schoonhoven LM. Behavioral and sensory responses to some neem compounds byPierisbrassicaelarvae [J].PhysiologicalEntomology, 1995, 20 (2): 134-140.

Mordue AJ, Simmonds MSJ, Ley SV,etal. Actions of azadirachtin, a plant allelochemical, against insects [J].PesticideScience, 1998, 54 (3): 277-284.

Morgan ED.Azadirachtin, a scientific gold mine [J].BioorganicandMedicinalChemistry, 2009, 17 (12): 4096-4105.

Qiao JD, Zou XL, Lai D,etal. Azadirachtin blocks the calcium channel and modulates the cholinergic miniature synaptic current in the central nervous system ofDrosophila[J].PestManagementScience, 2014, 70 (7): 1041-1047.

Shao XH, Lai D, Zhang ZX,etal. Induction of autophagy and apoptosisviaPI3K/AKT/TOR pathways by azadirachtin A inSpodopteralituracells [J].ScientificReports, 2016, 6: 35482.

Simmonds MSJ, Blaney WM, Ley SV,etal. Azadirachtin: Structural requirements for reducing growth and increasing mortality in Lepidopterous larvae [J].EntomologiaExperimentalisetApplicata, 1990, 55 (2): 169-181.

Xu HH. Insecticidal Plants and Botanical Insecticides [M]. Beijing: China Agriculture Press, 2001: 159-184. [徐漢虹. 殺蟲植物與植物源殺蟲劑[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2001: 159-184]

Xu HH, Lai D, Zhang ZX. Research and application of botanical pesticide azadirachtin [J].JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity, 2017, 38 (4): 1-11. [徐漢虹, 賴多, 張志祥. 植物源農(nóng)藥印楝素的研究進(jìn)展[J]. 2017, 38 (4): 1-11]

Yan C, Zhang ZX, Xu HH. An SSH library responsive to azadirachtin A contructed inSpodopteralituraFabricius cell lines [J].JournalofBiotechnology. 2012, 159 (1-2): 115-120.

Zhang ZX, Cheng DM, Xu HH. A comparative study on the bioactivity of azadirachtin A and azadirachtin B [J].PlantProtection, 2007, 33 (3): 80-82. [張志祥, 程東美, 徐漢虹. 印楝素A和印楝素B生物活性比較[J]. 植物保護(hù), 2007, 33 (3): 80-82]

Zhang ZX, Tian YQ, Cheng DM,etal. Stability comparison of azadirachtin A and azadirachtin B [J].JournalofNanjingAgriculturalUniversity, 2005, 28 (1): 125-127. [張志祥, 田永清, 程東美, 等. 印楝素A和印楝素B的穩(wěn)定性比較[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 28 (1): 125-127]

In order to confirm the bioactivity differences, azadirachtin A and azdirachtin B were used to study the effects on growth and development ofHelicoverpaarmigera. The results showed that: Azadirachtin A and azadirachtin B revealed favorable antifeedant activity against 3rdinstar larvae ofH.armigera, when the 3rdinstar larvae ofH.armigerawere treated with 5 μg/mL of azadirachtin A and azadirachtin B for 48 h, the antifeedant rates were 85.17% and 69.02%. The growing development results showed that azadirachtin A and azadirachtin B can inhibit the growth of 5thinstar larvae ofH.armigeraafter 14 d at 5 μg/mL, and larval weight were decreased by 50.28% and 43.08%, respectively. Only a few individuals completed pupation, pupation rate were 26.67% and 13.33%. The further results showed that the pupae ofH.armigeratreated by azadirachtin A and azadirachtin B were failed to complete eclosion. According to the test results at various stages, the conclusion was that the bioactivities of azadirachtin A and azadirachtin B were different, and inhibition of azadirachtin B on the growth ofH.armigerawas higher than azadirachtin A.

Azadirachtin A; azadirachtin B;Helicoverpaarmigera; bioactivity; mechanism

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(DXSCX92016001)

路偉，男，1984年生，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥安全性評價(jià)，E-mail：teerakon@sina.com

*并列第一作者：李佳琪，男，1994年生，本科生，E-mail: 458534582@qq.com

Received: 2017-06-23; 接受日期Accepted: 2017-07-17

Q965.9；S448

：A

1674-0858(2017)04-0945-05

路 偉，李佳琪，鄺鵬昆,等.印楝素A和印楝素B對棉鈴蟲生長發(fā)育的影響[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2017,39(4):945-949.

**通訊作者Author for correspondence, E-mail: teerakon@sina.com

EffectsofazadirachtinAandazadirachtinBonthegrowthanddevelopmentofHeliothisarmigera

LU Wei1**, LI Jia-Qi1*, KUANG Peng-Kun1, XIAO Shao-Wei1, WANG Mao-Yuan1, GUO Yong-Chao1, XU Han-Hong2(1. College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China; 2. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)