蓮草直胸跳甲熱激基因sHsp21在湖南和海南兩個地理種群中的差異表達分析

靳繼蘇，周忠實，郭建英

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193)

蓮草直胸跳甲熱激基因sHsp21在湖南和海南兩個地理種群中的差異表達分析

靳繼蘇，周忠實，郭建英*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193)

sHsp21(小熱激蛋白)是小熱激蛋白家族的成員，在外界環(huán)境壓力下能夠被誘導(dǎo)，熱激后能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和保護細胞免受外界脅迫。本文研究了入侵雜草空心蓮子草Alternantheraphiloxeroides生防天敵蓮草直胸跳甲的一個關(guān)鍵基因sHsp21，并對其進行熱激誘導(dǎo)表達以及RACE全長擴增。獲得全長cDNA 693 bp并完整的開放閱讀框567 bp，共編碼188個氨基酸。以30℃為對照，分別測定蓮草直胸跳甲AgasicleshygrophilaSelman & Vogt長沙種群和海南種群在模擬夏季特定10 ∶00-14 ∶00時段36℃、39℃高溫條件下sHsp21的表達量。連續(xù)熱激 6 d，每天4 h熱激后取樣，實時熒光定量PCR分析顯示：湖南種群高溫39℃和36℃誘導(dǎo)下sHsp21表達量都顯著高于對照組30℃；海南種群36℃誘導(dǎo)下的表達量與對照組30℃差異不顯著，39℃誘導(dǎo)下的表達量顯著高于對照組30℃和36℃。結(jié)果表明，sHsp21在湖南和海南兩地理種群不同耐熱能力上起到重要作用，并且sHsp21的高表達可能對其蟲體產(chǎn)生副作用，為下一步深入探究其生物學(xué)功能奠定了一定的基礎(chǔ)。

蓮草直胸跳甲；小熱激蛋白；熒光定量PCR；地理種群

目前，蓮草直胸跳甲(AgasicleshygrophilaSelman & Vogt，1999)是控制空心蓮子草最好的生防昆蟲，經(jīng)田間調(diào)查和室內(nèi)模擬實驗顯示隨著地理的差異，蓮草直胸跳甲在湖南和海南表現(xiàn)出對溫度的差異性，海南種群比湖南種群更耐熱(未發(fā)表)。熱激蛋白(Heat Shock Protein，HSPS)又稱熱休克蛋白或應(yīng)激蛋白(Heat Stress Protein)，是細胞或者生物體在一定的時間內(nèi)遭受高于或者低于其正常生長溫度時體內(nèi)熱激蛋白增加的一類蛋白質(zhì)，它廣泛分布于各個部位。熱激蛋白是生物體在不利環(huán)境因素下(高溫，低溫)合成的一種進化上高度保守的蛋白質(zhì)(王建義和慈忠玲，2008)。

1974年在果蠅幼蟲因增加溫度觀察到一系列特殊的蛋白，低分子量熱激蛋白(small Heat Shock Proteins，sHsps)因此而得名(夏佳音等，2007)。目前對于sHsps尚無明確的分類標準，根據(jù)已知的sHsps同源程度及分子量大小，Carper 等(1987)將各種生物體內(nèi)存在的幾十余種HSPs分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60及小分子HSP和泛素等6個家族。Morimoto等(1993)則將其分為HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP及泛素4個家族，認為來源不同的大分子HSPs(100 kDa以上)之間不具有相似的生物學(xué)特性，因此不能成為一個家族。但近年來研究又發(fā)現(xiàn)，大分子HSPs之間也擁有類似的功能，也可歸為一個家族。因此，HSPs的分類是相對的，伴隨著對其種類及生物活性的進一步認識和了解，其分類將會更趨合理。1982年，Ingoliademmg(Ingoliaetal.，1982)發(fā)現(xiàn)了果蠅的低分子量的熱激蛋白與眼晶體蛋白在進化上的相關(guān)性。而幾乎在100年前α晶體蛋白作為脊椎動物眼睛晶狀體的主要結(jié)構(gòu)蛋白已經(jīng)有報道(Mrneretal.，1894)。像Hsp90，Hsp70等大部分的熱激蛋白的研究已經(jīng)很多了，但是對于小分子的熱激蛋白研究相對較少，尤其是在鞘翅目昆蟲當中。

小分子熱激蛋白是組成最廣泛同時也是最不保守的分子伴侶家族(Haslbecketal.，2005)。大多數(shù)生物都能表達多種小熱激蛋白除了少數(shù)的真細菌不表達或者只表達一種且不同真核生物所含有的小分子熱激蛋白基因數(shù)不同(Kappéetal.，2002；Narberhaus，2002)。許多研究表明，不管機體處于熱激狀態(tài)還是生理狀態(tài)，其都會參與復(fù)雜的和重要的生物學(xué)過程。如：作為分子伴侶，阻止蛋白之間不必要的相互作用，幫助變性蛋白重新折疊(Beckmannetal.，1990)，誘導(dǎo)生物體的耐熱性(Dahlgaardetal.，1998)，穩(wěn)定細胞骨架，參與細胞損傷與修復(fù)，在生物體的生長、發(fā)育及進化過程中，在維持機體的生理狀態(tài)以及某些疾病的病理生理過程中均發(fā)揮重要的作用。

小休克蛋白的結(jié)構(gòu)也并不復(fù)雜，它們的主要結(jié)構(gòu)是有N端和C端2個部分組成(Gusevetal.，2002)。由于它們N端域的存在，使得在同一個物種之間具有很強的相對保守性。在生理狀態(tài)下，小休克蛋白處于低聚狀態(tài)，不與其他的低聚復(fù)合物結(jié)合，維持細胞內(nèi)的穩(wěn)定。C端域含有一個相當保守的α晶體蛋白(α-crystallin)結(jié)構(gòu)域(Horwitz，1992)，該結(jié)構(gòu)域是小熱休克蛋白家族成員共有的結(jié)構(gòu)域，在同一個物種之間它們高度保守，甚至在不同的物種之間也具有很高的的保守性。在低聚狀態(tài)下能夠很好的使其起著分子伴侶的功能。不同的小休克蛋白行使分子伴侶功能的狀態(tài)是有所不同的。例如是sHsp20有二聚體和低聚體兩種形式存在，在受到外界刺激的時候，二聚體發(fā)生變化聚合形成活性更高的低聚體復(fù)合物。又如酵母HSP26在生理溫度下是二十四聚體復(fù)合物，在受到刺激(熱激等)之后，二十四聚體復(fù)合物解離成具有生物活性的的二聚體復(fù)合物(Skouri-Panetetal.，2006)。

小熱激蛋白在維持細胞蛋白的穩(wěn)定、膜的維護、穩(wěn)定細胞骨架以及在核內(nèi)行使功能有著重要的意義。sHsp的主要功能是與其它蛋白質(zhì)進行相互作用，從而使完成生命過程中的各種細胞蛋白保持穩(wěn)定。當細胞受到外界脅迫時，會導(dǎo)致細胞蛋白變性，從而與sHsp結(jié)合，形sHsp-底物復(fù)合物。當外界刺激恢復(fù)正常之后，sHsp-底物復(fù)合物分離，在需要消耗能量的分子伴侶如Hsp70在ATP的幫助下重新折疊成正確的構(gòu)象，行使正常功能(夏佳音，2007)。因此，sHsp能夠非常有效的阻止蛋白變性，從而保護細胞免受熱激、凋亡等傷害。此外，有研究顯示，sHsp與膜的流動有關(guān)(Víghetal.，2007)。例如乳酸桿菌的小熱激蛋白Lo18在熱激的條件下與細胞膜相互作用來調(diào)節(jié)膜的流動性(Coucheneyetal.，2005)。此外，小熱激蛋白對參與細胞凋亡也有一定的作用。本實驗對蓮草直胸跳甲小熱激蛋白21(sHsp21)基因的克隆分析，通過實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，檢測了蓮草直胸跳甲兩個地理種群雌雄蟲基因組DNA中sHsp21的表達量。來進一步揭示蓮草直胸跳甲耐熱性的差異與熱激蛋白基因拷貝數(shù)間關(guān)系，為全面了解sHsp21在蓮草直胸跳甲中作用的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

湖南與海南新采集標本，在實驗室飼養(yǎng)一代后做實驗，飼養(yǎng)溫度25℃±2℃，濕度75%-90%，光周期L ∶D=14 ∶10。

1.2 供試植物

在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所溫室連續(xù)飼養(yǎng)的空心蓮子草。

1.3 溫度處理

采集剛羽化的的成蟲(雌雄比1 ∶1),在恒溫培養(yǎng)箱中進行高溫處理(30℃、36℃和39℃)4 h，然后在25℃恢復(fù)，以30℃為對照，連續(xù)處理6 d，每天采集雌雄蟲各6頭，液氮速凍后，-80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要試劑和儀器

本研究所有的引物及DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。常用Taq酶、dNTP等試劑購自北京全式金公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒，T3載體，qPCR試劑盒等購自全式金生物公司。

1.5 總RNA提取及第一鏈cDNA的合成

收集剛羽化的蓮草直胸跳甲20頭，采集后立即用液氮處理凍存，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛘吡⒓催M行實驗。用TRIzol法分離提取總的RNA，步驟為：將凍存的蓮草直胸跳甲樣品放入進口的1.5 mL EP試管中，迅速加入液氮中進行研磨，研磨好后加入1 mL Trizol，用振蕩器震蕩3 min，室溫靜置5 min后加入0.2 mL氯仿充分震蕩混勻15 s，室溫放置5 min，4℃條件下12000 rpm，15 min離心；吸取上清液于另一個1.5 mL EP試管中，加入等體積的異丙醇震蕩混勻，室溫放置10 min，4℃條件下12000 rpm，15 min離心；棄上清液加入1 mL 75% 乙醇，4℃條件下12000 rpm，10 min離心；棄上清，并在超凈工作臺放置 5 min，加入適量的DEPC處理5 min使RNA沉淀充分溶解，-80℃保存以備用，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。用IMPLEN NanoPhotometer P-Class P330(核酸蛋白分光光度計)和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度和完整性。根據(jù)Transscript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，合成第一鏈cDNA，貯存于-20℃冰箱備用。

1.6 sHsp21中間片段以及全長獲得

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序和NCBI庫比對結(jié)果，應(yīng)用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計上下游的引物(表1)對序列進行擴增，擴增體積為20 μL。PCR的反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 2.5 μL、dNTP (2.5 Mm)0.5 μL、引物(10 uM/μL)0.5 μL、Taq酶(2.5 U/μL)0.25 μL、模版DNA 2 μL、ddH2O 18.75 μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物膠回收純化后，連接至PEASY-T3載體，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞，在選擇性的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，然后進行PCR篩選陽性克隆后測序。根據(jù)得到的中間片段設(shè)計兩對特異性引物(GSP)(表1)反應(yīng)程序和體系根據(jù)SMARTer RACE 5′/3′ Kit試劑盒，陽性克隆后測序進行剪切拼接獲得全長。

表1 小熱激蛋白21(sHsp21)基因PCR引物序列

1.7 qPCR檢測目的基因sHsp21的表達水平

以上述提取的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模版，以β-actin基因作為內(nèi)參基因，qPCR檢測蓮草直胸跳甲抗逆基因sHsp21在不同溫度刺激條件下的表達變化。qPCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個循環(huán)；融解曲線為：95℃變性1 min，60℃退火30 s，95℃變性1 min，60℃退火30 s，1個循環(huán)，實時采集熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 sHsp21的同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

sHsp21在蓮草直胸跳甲卵巢中分離鑒定出來，通過RT-PCR和RACE-PCR獲得了全長693 bp的cDNA，其中完整的開放閱讀框(ORF)567 bp，共編碼188個氨基酸。對克隆的的基因序列用NCBI的BLASTn和BLASTx進行相似性比對，并將翻譯成的氨基酸通過DANMAN軟件進行同源性比對(圖3)。結(jié)果顯示該序列與其近緣稻水象甲的Hsp21核苷酸序列相似度很高，其相似性達到74%，并且與其它鞘翅目昆蟲之間也有較高的相似性。因此，可確定克隆的序列為蓮草直胸跳甲sHsp21目的基因。利用MEGA 5.0軟件將8種來源不同的昆蟲11種相似性較高的小熱激蛋白的氨基酸序列進行比對(劉慧春等，2013)，采用Neighbor-Joining法，構(gòu)建Bootstrap系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果表明，昆蟲綱的4個目的下的8個物種都能夠聚類分開，該聚類結(jié)果與昆蟲學(xué)傳統(tǒng)的分類是一致的，由此可以看出sHsp21是一個很保守的功能基因，能夠作為昆蟲系統(tǒng)進化分析的基因。

圖1 蓮草直胸跳甲sHsp21電泳圖Fig.1 The electrophoretogram of Agasicles hygrophila

圖2 蓮草直胸跳甲sHsp21氨基酸序列及基因序列Fig.2 The acid sequence and gene sequence of the sHsp21 of Agasicles hygrophila

圖3 蓮草直胸跳甲sHsp21與其他昆蟲氨基酸序列的同源性比較Fig. 3 Comparison of the amino acid sequences of sHsp21 in Agasicles hygrophila and other insects注：Agasicles hygrophila, 蓮草直胸跳甲；L. oryzophilus, 稻水象甲(KC620424.1)D. helophoroides, 花絨寄甲(KU050686.1)；G. atrocyanea, 酸模葉甲(AB207213.1).

圖4 用MEGA5.0構(gòu)建8種昆蟲sHsp21的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences alignment of sHsp21 in 8 insects with MEGA

2.2 高溫脅迫對sHsp21基因的表達

將海南和湖南蓮草直胸跳甲sHsp21的cDNA等比例(2-1)稀釋成不同的濃度(2-1～2-6)做標準曲線，其相關(guān)系數(shù)R2=0.991，擴增效率E=99.884%。內(nèi)參基因相關(guān)系數(shù)R2=1，擴增效率E=96.265。兩個基因的相關(guān)系數(shù)R2(0.98≦R≦1)和擴增效率E(95≦E%≦105)近似，表明可以運用相對定量的方法來評估目的基因的表達量。采用定量PCR的方法檢測sHsp21在高溫30℃、36℃和39℃條件下的相對表達水平，30℃為對照組。結(jié)果表明(圖5，6)，湖南種群高溫39℃，36℃誘導(dǎo)下sHsp21基因的表達量顯著高于對照組30℃；海南種群36℃誘導(dǎo)下的表達量與對照組30℃差異不顯著，39℃誘導(dǎo)下的表達量顯著高于對照組30℃和36℃。但39℃高溫誘導(dǎo)下1-6 d之間的表達量差異不顯著。由于海南地區(qū)的平均氣溫要高于湖南地區(qū)的平均氣溫，推測海南種群蓮草直胸跳甲逐漸適應(yīng)了高溫條件，而湖南種群由于沒有適應(yīng)高溫條件，所以短時的高溫使熱激蛋白升高從而影響了其壽命，繁殖力等。這也間接的說明了高溫條件下海南種群比長沙種群更耐熱。

圖5 湖南種群蓮草直胸跳甲sHsp21在30℃，36℃和39℃下的誘導(dǎo)表達Fig.5 High temperature of 30℃, 36℃ and 39℃ induced expression profiles of sHsp21 in Agasicles hygrophila in Hunan

圖6 海南種群蓮草直胸跳甲sHsp21在30℃，36 ℃和39℃下的誘導(dǎo)表達Fig.6 High temperature of 30℃, 36℃ and 39℃ induced expression profiles of sHsp21 in Agasicles hygrophila in Hainan

3 結(jié)論與討論

本研究通過克隆獲得全長693 bp的cDNA，其中完整的開放閱讀框(ORF)567 bp，共編碼188個氨基酸。序列分析顯示sHsp21是小熱激蛋白家族的成員包括保守域，比如說N-氨基酸末端區(qū)域，α晶體蛋白(α-crystallin)結(jié)構(gòu)域和C-氨基酸末端區(qū)域(Jongetal.，1998)。根據(jù)系統(tǒng)進化分析，小分子量熱激蛋白和其它鞘翅目昆蟲有很高的同源性，由此推測小熱激蛋白基因有很長的獨立進化歷史。

熱激處理之后通過實時熒光定量PCR檢測sHsp21的表達水平來判斷在湖南種群和海南種群兩地的差異表達并且高于常溫處理的表達水平。但是本研究沒有從蓮草直胸跳甲各個蟲態(tài)以及各個部位進行研究，只是對全蟲進行連續(xù)一周的熱處理等一系列的實驗，這是不同于其它文獻研究。在柞蠶的研究中，小熱激蛋白21在血細胞，卵巢，精巢以及中腸中都有表達，脂肪體中極少表達(Liuetal.，2013)。黑腹果蠅研究中，熱激蛋白基因在雄配子中也有表達(Joanisseetal.，1998)。

在本研究中比較了湖南長沙和海南萬寧的種群蓮草直胸跳甲小熱激蛋白sHsp21的表達量。對于長沙種群隨著溫度的升高小熱激蛋白sHsp21的表達量升高，并且隨著溫度的升高長沙種群的蓮草直胸跳甲的壽命、產(chǎn)卵量、孵化率等顯著降低(趙梅婷等未發(fā)表)。而海南種群在30℃和36℃熱激處理后sHsp21的表達量沒有顯著差異。本研究推測熱激蛋白的過量表達對長沙種群產(chǎn)生了負效應(yīng)，有研究表明每個物種的熱激蛋白的過量表達，其種群都在有益和損失之間維持平衡(S?rensenetal.，2003)。比如：熱激蛋白的過量表達是以顯著影響其生長發(fā)育速率和生殖力作為代價(S?rensenetal.，2003)。熱激蛋白的過量表達會降低成蟲的壽命，產(chǎn)卵量等其它的生理特性，在果蠅的研究中Hsp70的過量表達顯著降低了各個蟲態(tài)的年齡組成，減少成熟后代的數(shù)量以及抑制卵的孵化率(Silbermannetal.，2000)。本研究結(jié)果表明sHsp21在蓮草直胸跳甲高溫耐受性上可能起到重要作用并且sHsp21的高表達可能對其蟲體產(chǎn)生負作用，為下一步深入探究其生物學(xué)功能奠定了一定的基礎(chǔ)。在本實驗的研究中，長沙種群sHsp21過量表達，而海南種群則維持在一定的水平，是否sHsp21是影響長沙種群蓮草直胸跳甲的壽命以及生殖力等在高溫條件下顯著低于海南種群的關(guān)鍵基因呢？需要進一步去深入研究驗證。

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ThedifferentialexpressionanalysisofthesHsp21geneofHunanandHainantwogeographicpopulationsofAgasicleshygrophilaSelman&Vogt(Coleoptera:Cheysomelidae)

JIN Ji-Su, ZHOU Zhong-Shi, GUO Jian-Ying*

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests/Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

As a member of the family of small heat shock proteins, it is possible that thesHsp21 can be induced under certain circumstances, for example, under the pressure from external environment. As the heat shock is able to adjust the folding of protein and protect cells from damage of the outside stress. Focusing on thesHsp21, this paper mainly studied the relevant genes ofAgasicleshygrophilaSelman & Vogt, which is a promising biological control agent for invasiveAlternantheraphiloxeroidesand carries on the expression of heat shock induced, as well as total length of amplification by RACE. The full length we observed of cDNA is 693 bp while it contains a complete set of open reading frame of 567 bp, encoding 188 amino acids. Using constant temperature 30℃ as control. We manged to measure thesHsp21 expressive quantity of Hunan population and Hainan population under the simulative high-temperature period (10 ∶00-14 ∶00)of summer at 36℃、39℃ respectively. The consistant heat shocking lasted six consecutive days and sampling is arranged to be done 4 hours afterwards. The result of Real-time fluorescent quantitative PCR analysis suggests that: Hunan population under the 39℃, 36℃ high temperature inducedsHsp21 gene expressive quantity is significantly higher than the control group 30℃; Hainan population 36℃ under the high temperature induced thesHsp21 expression of the quantity is of no significant difference to the control group 30℃. Meanwhile, under the 39℃ high temperaturesHsp21 gene expressive quantity is significantly higher than the 36℃ and 30℃. Which leads to the conclusion thatsHsp21 onAgasicleshygrophilahigh temperature tolerance may play an important role as well as the high expression ofsHsp21 may cause negative effect to the insect (on its own), therefore provided us a certain foundation as we delve one step closer into the biological function ofsHsp21.

Agasicleshygrophila; small Heat Shock Protein (sHsp); RT-PCR; geographic populations

國家自然科學(xué)基金(31572068，31272107)

靳繼蘇，1991年生，碩士研究生，E-mail: jinjisu9110@163.com

*通信作者Author for correspondence, E-mail: Guojianying@caas.cn

Received: 2017-05-24; 接受日期Accepted: 2017-07-21

Q963;S433.5

：A

1674-0858(2017)04-0898-07

靳繼蘇，周忠實，郭建英.蓮草直胸跳甲熱激基因sHsp21在湖南和海南兩個地理種群中的差異表達分析[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報，2017,39(4):898-904.