球孢白僵菌HFW-05對煙粉虱的致病力及組織病理影響

曹偉平，宋 健，趙建江，馮書亮，杜立新

(河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所，河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室，河北保定 071000)

球孢白僵菌HFW-05對煙粉虱的致病力及組織病理影響

曹偉平，宋 健，趙建江，馮書亮，杜立新*

(河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所，河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室，河北保定 071000)

環(huán)境溫濕度是影響白僵菌菌株致病力的關(guān)鍵因素，本文測定了不同溫、濕度下白僵菌BeauveriabassianaHFW-05對煙粉虱Bemisiatabaci若蟲及卵的致病力，同時觀察了煙粉虱感病若蟲的組織病理變化。結(jié)果表明，各濃度下煙粉虱若蟲的校正死亡率隨時間變化曲線基本一致，接種3-4 d時出現(xiàn)死亡高峰，白僵菌HFW-05對煙粉虱1齡、2齡、3齡若蟲的LC50分別為5.94×104、1.06×105、5.08×105孢子/mL，LT50分別為2.54 d、2.68 d、3.18 d；白僵菌HFW-05對卵的致病力很低，1×108孢子/mL接種濃度下，卵的6 d感染率僅為24.9%。在25℃、30℃下，HFW-05對煙粉虱若蟲表現(xiàn)出最強的致病力，高于或低于此溫度時，煙粉虱若蟲死亡速度減慢，死亡率降低。相對濕度發(fā)生變化時，煙粉虱若蟲死亡速度和死亡率明顯不同，相對濕度高于90%時，煙粉虱若蟲死亡速度最快，死亡率最高，相對濕度介于70%-90%時，白僵菌HFW-05對煙粉虱若蟲的致病力無明顯差異，但校正死亡率顯著低于環(huán)境濕度大于90%的處理，相對濕度低于70%時,煙粉虱死亡率也達到60%左右。組織病理學(xué)觀察顯示尾部舌狀突是HFW-05侵染煙粉虱若蟲的關(guān)鍵部位。研究結(jié)果表明白僵菌HFW-05在煙粉虱的生物防治中有較大的潛力。

球孢白僵菌；煙粉虱；致病力；組織病理變化

煙粉虱BemisiatabaciGennadius主要危害十字花科、茄科、葫蘆科、豆科、錦葵科及花卉等多種作物及園林植物，通過刺吸植物汁液使植株褪綠、萎蔫，同時傳播黃化曲葉病毒等病毒病，嚴(yán)重時每平方厘米葉片的成蟲數(shù)高達40-50頭，每年給全球的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失(Perringetal., 1993；張芝利和羅晨，2001)。長期地采用化學(xué)防治使得煙粉虱對有機氯類、有機磷類、氨基甲酸酯類、煙堿類及昆蟲生長調(diào)節(jié)劑等殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，加大了煙粉虱防治難度(Nauenetal., 2002；何玉仙和黃建，2005；Wangetal., 2010)。利用昆蟲病原真菌等生物農(nóng)藥已成為防治煙粉虱的有效途徑。

白僵菌Beauveriabassiana是一種廣譜性昆蟲病原真菌，廣泛存在于自然界中，研究表明白僵菌對煙粉虱具有高度的侵染力(Wraightetal., 1988, 2000；Quesada-Moragaetal., 2006；Liu and Stansly, 2009；Liuetal., 2010)，白僵菌侵染對煙粉虱后代的生長、發(fā)育和繁殖可以產(chǎn)生一定的亞致死效應(yīng)，表現(xiàn)為煙粉虱若蟲羽化率降低(Torrado-Leónetal., 2006)，成蟲前期延長，子代種群增長慢，存活率低(王登杰等，2014)。白僵菌主要經(jīng)由體表侵染寄主昆蟲，溫度和濕度是影響菌株致病力的兩個最重要的環(huán)境因素，溫度和濕度對白僵菌的致病力具有互補與綜合作用，二者的有效結(jié)合是寄主昆蟲快速致死的重要條件(潘志萍，2008)。林華峰等(1998)認(rèn)為，75%的相對濕度下,任何溫度均不能使白僵菌孢子在松毛蟲Dendrolimuspunctatus體表萌發(fā)，高濕度與10℃-25℃的溫度組合是引起較高致病率所需的理想溫濕度條件。孫魯娟等(2001)發(fā)現(xiàn)相對濕度低于70%時，即使在最適溫度的情況下白僵菌對棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的致病力僅為50%左右。而在相對濕度為70%-80%時，白僵菌對小猿葉甲Phaedonbrassica幼蟲具有較高的致病力，校正死亡率最高可以達到83%(Heetal., 2005)?？梢姕貪穸仁怯绊懓捉┚虏×Φ年P(guān)鍵因素，但影響程度因菌株(種)和寄主昆蟲的不同而存在一定差異，環(huán)境條件對白僵菌侵染煙粉虱的影響研究較少，有必要明確溫濕度對白僵菌侵染煙粉虱的影響程度。本文還研究了煙粉虱感染白僵菌后蟲體的組織病理變化。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和昆蟲

球孢白僵菌HFW-05，河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所殺蟲微生物實驗室分離并保存。

煙粉虱采自河北定州番茄大棚，將田間捕捉到的煙粉虱在室內(nèi)無毒苗飼養(yǎng)至第二代時，捕捉50對煙粉虱成蟲放入養(yǎng)蟲籠中，同時放入5盆室內(nèi)盆栽5-6葉期的番茄無毒苗，待其產(chǎn)卵24 h后取出，剔除幼苗上的成蟲并移放在25℃±1℃恒溫下飼養(yǎng)，待其發(fā)育至各齡期的若蟲備用。

1.2 菌株培養(yǎng)和孢懸液配制

將白僵菌HFW-05接種在SDAY平板培養(yǎng)基上，26℃±1℃，恒溫培養(yǎng)至分生孢子脫落，用0.05%(v/v)無菌吐溫-80水溶液洗脫孢子，經(jīng)磁力攪拌器攪拌30 min，并用4層無菌紗布過濾，獲得純孢子懸浮液，血球計數(shù)板計數(shù)并配制成1×105、1×106、1×107、5×107、1×108孢子/mL梯度濃度的孢懸液。

1.3 白僵菌對煙粉虱的致病力測定

在解剖鏡下分別選取攜帶有30-60頭卵或若蟲的葉片，計數(shù)試蟲數(shù)量后浸入各梯度濃度的孢懸液中，浸漬2 s，吸干多余水分并自然晾干后將幼苗移入人工氣候箱中，飼養(yǎng)條件為26℃±1℃，光周期14 L ∶10 D，相對濕度75%±5%。接種后解剖鏡逐日檢查死蟲數(shù)(感病若蟲的蟲體呈干癟或不透明橙色；感病的卵粒呈干癟狀)，直至全部試蟲死亡或發(fā)育為成蟲為止。同時用0.05%(V/V)吐溫水處理煙粉虱作為對照。每處理設(shè)3次重復(fù)。

1.4 孢子萌發(fā)率測定

參照蔡悅等(2011)試驗方法，測定人工培養(yǎng)基上孢子在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的萌發(fā)率。

1.5 溫濕度對白僵菌HFW-05致病力的影響測定

溫度試驗：將攜帶有2齡若蟲的番茄葉片分別在1×107孢子/mL的孢懸液和對照0.05%(V/V)的吐溫水中浸漬2 s后取出，吸干多余水分并自然晾干后將幼苗移入設(shè)定不同溫度(5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃)的人工培養(yǎng)箱中，14 L ∶10 D，相對濕度75%±5%。每日檢查死亡蟲數(shù)，每處理設(shè)3次重復(fù)。

濕度試驗：處理同上，幼苗置于26℃±1℃生長箱中，生長箱的相對濕度分別設(shè)為95%±5%、85%±5%、75%±5%、65%±5%、55%±5%。上述所有生物測定處理均以對照自然死亡率在5%內(nèi)且無僵蟲視為有效實驗。

1.6 組織切片

接種后每隔24 h選擇感染癥狀明顯的若蟲，觀察癥狀并立即用包氏固定液固定。將樣品放入Bouin’s固定液(苦味酸水溶液約1.22%)75 mL，40%甲醛25 mL，冰醋酸5 mL固定24 h后，用70%酒精洗去上面的Bouin’s固定液(3-4次)，直至溶液不呈現(xiàn)黃色為止，然后經(jīng)常規(guī)等級濃度梯度酒精(70%、80%、90%、95%、100%)脫水后，分別先后置于1 ∶1酒精二甲苯混合液進行初步透明(時間約10 min)及純二甲苯進行徹底透明(時間約20 min)。浸蠟后進行常規(guī)石蠟切片，厚度為6 μm，蘇木精、伊紅雙染色，相差顯微鏡觀察，CCD攝像。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±SE)表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0版軟件處理，用Duncan’s新復(fù)極差法進行顯著性分析。采用SPSS 17.0版軟件進行回歸分析，計算LC50值、LT50值及其95%置信限，根據(jù)LC50值、LT50值的95%置信限是否重疊判斷各處理間差異是否顯著(Prabhakeretal., 2011)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙粉虱接種白僵菌HFW-05孢子后的感病癥狀

健康煙粉虱若蟲蟲體半透明，體色淡黃色至黃色，背部微隆起。若蟲接種白僵菌HFW-05孢子后，初期蟲體顏色無明顯變化，蟲體體色逐漸變?yōu)榘迭S色，半透明感消失，之后蟲體呈現(xiàn)紅褐色且蟲體背部凹陷，有菌絲從感染蟲體腹部末端伸出，最后感病蟲體表面密布白色菌絲。卵初產(chǎn)時淡黃綠色飽滿，感染的卵粒呈干癟狀，未觀察到卵粒長出菌絲體。

2.2 白僵菌HFW-05對煙粉虱的致病力

接種2 d后，各處理的煙粉虱若蟲均出現(xiàn)不同程度的感染(圖1)，隨著感染時間的延長及孢懸液濃度加大，若蟲累計死亡率逐漸升高，各濃度下煙粉虱若蟲的校正死亡率隨時間變化曲線基本一致，感染3-4 d后，各處理出現(xiàn)死亡高峰，之后趨勢平緩。白僵菌HFW-05對低齡若蟲的致病力顯著高于高齡若蟲，對煙粉虱1齡、3齡若蟲的LC50值差異顯著，對2齡若蟲的LC50值與1齡、3齡均沒有顯著差異；對1齡、2齡若蟲的LT50值差異不顯著，二者均顯著低于對3齡若蟲的LT50值。HFW-05對卵的致病力很低，1×108孢子/mL濃度下，煙粉虱卵6 d的累計感染率僅為24.9%。

2.3 不同溫度對白僵菌HFW-05孢子萌發(fā)及對煙粉虱若蟲致病力的影響

在人工培養(yǎng)基上，白僵菌HFW-05在20℃-30℃中培養(yǎng)6 h后已有40%左右的孢子伸出芽管，未伸出芽管的孢子也已膨大至原孢子體積約2倍左右，24 h的孢子萌發(fā)率均接近100%，孢子萌發(fā)生出的芽管粗壯，長勢良好；低于15℃時，培養(yǎng)6-12 h后僅見少量孢子伸出芽管，其余未萌發(fā)，孢子膨大也不明顯，在孢子萌發(fā)后，芽管伸長也較緩慢；35℃時孢子未見萌發(fā)(圖2)。由此表明，白僵菌HFW-05孢子萌發(fā)的適宜溫度為20℃-30℃，過低過高的溫度均不利于孢子的萌發(fā)生長。

不同溫度下白僵菌HFW-05對煙粉虱2齡若蟲侵染效果(表2)表明，低于15℃時，白僵菌HFW-05對煙粉虱若蟲侵染能力很低，但5℃下，也有極少量的孢子侵入蟲體并造成若蟲死亡。隨著環(huán)境溫度的升高，白僵菌HFW-05對煙粉虱若蟲的致病力逐漸提高，在25℃和30℃下，白僵菌HFW-05對煙粉虱若蟲表現(xiàn)出最強的致病力，兩種溫度下若蟲的校正死亡率差異不顯著(P<0.05)。35℃條件下，HFW-05對煙粉虱若蟲的致病力下降，6 d的累計死亡率為61.2%，顯著低于25℃、30℃?？梢姲捉┚鶫FW-05在25℃和30℃條件下才能對煙粉虱若蟲達到最佳的侵染效果。

圖1 不同濃度下白僵菌HFW-05對煙粉虱若蟲和卵的致病力Fig.1 Corrected mortality of nymphs and eggs of Bemisia tabaci in 2-6 d after inoculation of Beauveria bassiana (1×105-1×108 conidia/mL)

LC50LT50LC50(conidial/mL)95%置信區(qū)間95%fiduciallimitsLT50(day)95%置信區(qū)間95%fiduciallimits1齡1stinstar593×104232×104-152×105254236-2742齡2ndinstar106×104417×104-270×105268251-2873齡3rdinstar508×105195×105-132×106318294-344

圖2 不同溫度下HFW-05孢子萌發(fā)率Fig.2 Spores germination rate of strain HFW-05 at different temperature

2.4 不同濕度下白僵菌HFW-05對煙粉虱的致病力

總體來看(見圖3、表3)，相對濕度為90%以上時，煙粉虱2齡若蟲死亡速度最快，LT50為3.02 d，死亡率最高，6 d校正死亡率為87.9%；相對濕度低于90%時,白僵菌對煙粉虱的致死率顯著降低。接種白僵菌HW-05 2 d后，環(huán)境濕度大于70%時，煙粉虱的死亡率超過20%，隨著調(diào)查時間的延長，相對濕度介于70%-90%時，白僵菌HFW-05對煙粉虱若蟲的致病力無明顯差異(P<0.05)，LT50為3.34-3.63 d；相對濕度低于50%時，白僵菌HFW-05對煙粉虱若蟲致病力明顯減弱，6 d的累計死亡率低于50%，理論LT50為6.17 d。在各濕度處理條件下，空白對照煙粉虱若蟲的死亡率均低于5%，各處理的感病煙粉虱若蟲為白僵菌HFW-05有效致死。

表2 不同溫度下白僵菌HFW-05對煙粉虱若蟲的致病力

注：表中數(shù)據(jù)經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差檢驗，同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Data followed by different lower-case letters in each column were different at the significance level ofP<0.05 by Duncan’s new multiple rang test. The same below.

圖3 環(huán)境濕度對白僵菌HFW-05侵染煙粉虱若蟲的影響Fig.3 Effect of relative humidity on infection of Beauveria bassiana HFW-05 to nymphs of Bemisia tabaci

供試?yán)ハxInsects相對濕度(%)Relativehumidity回歸方程RegressionequationLT10(d)LT50(d)LT90(d)煙粉虱若蟲NymphsofBtabaci55±5Y=29049+2651X222596170718754265±5Y=29447+32679X172664255410485875±5Y=32737+30846X13954362809431985±5Y=33471+31562X13125333968497795±5Y=29884+41861X149553023861136

2.5 感染白僵菌HFW-05的煙粉虱若蟲組織病理學(xué)變化

接種白僵菌HFW-05 24 h的試蟲體表可見孢子附著(圖4-2b)，36 h時在尾部舌狀突可見較多菌絲體(圖4-2c)。48 h時在表皮萌發(fā)的孢子菌絲已伸長并開始穿透表皮侵入蟲體內(nèi)部(圖4-2d)，腹部菌絲體較多。72 h時菌絲已大量侵染至蟲體內(nèi)，組織模糊不清，結(jié)構(gòu)不完整(圖4-2e)。96 h后菌絲已經(jīng)均勻充滿肌肉組織，各器官已無法辨識(圖4-2f)，對照試蟲(圖4-2a)體內(nèi)各組織器官完整。

圖4 感染白僵菌HFW-05的2齡煙粉虱若蟲組織病理學(xué)變化Fig.4 Histopathological changes of Bemisia tabaci nymph infected with Beauveria bassiana HFW-05注：a，正常煙粉虱若蟲縱切面；b，孢子在體表附著；c，HFW-05孢子在若蟲尾部入侵；d，若蟲腹部出現(xiàn)菌絲；e，后期若蟲體內(nèi)組織解體，亞緣區(qū)變??；f，菌絲侵染至若蟲頭部，體腔內(nèi)充滿菌絲體。Note: a, Integrate longitudinal section of uninfected B. tabaci nymph; b, Conidia adhered on the cuticle surface of host；c, Nymph tail firstly invaded with conidia of strain HFW-05; d, Hypha in nymph abdomen；e,Infected fat bodies became disintegrated and submarginal area became thin; f, Nymph head invade with hypha and coelomic cavity filled with mycelium.

3 結(jié)論與討論

白僵菌孢子的萌發(fā)是侵染寄主的必要條件(Heetal., 2005)。白僵菌孢子萌發(fā)所需的起點溫度和菌株(種)及培養(yǎng)條件有一定關(guān)系，有人認(rèn)為在人工培養(yǎng)基上溫度高于15℃時白僵菌孢子才能萌發(fā)(Walstsdetal., 1970)，有人認(rèn)為在2℃下白僵菌孢子即可在蟲體體表萌發(fā)并侵染昆蟲(Doberskietal., 1981)。隨著溫度的升高，白僵菌孢子萌發(fā)生長的速度加快，但溫度高于32℃，多數(shù)白僵菌孢子不能萌發(fā)(鄺灼彬等，2005)，已有的研究表明白僵菌孢子萌發(fā)生長和侵染寄主的適宜溫度范圍在20℃-32℃(Iskandarovetal., 2006)。本實驗結(jié)果也表明25℃和30℃時，白僵菌HFW-05孢子對煙粉虱若蟲的致病力最高，與HFW-05孢子萌發(fā)的最適溫度相吻合；35℃時，HFW-05孢子在人工培養(yǎng)基上未見萌發(fā)，但對煙粉虱若蟲卻有一定的致病效果，一方面表明白僵菌HFW-05孢子在蟲體上可以忍受更高的溫度，另一方面，持續(xù)高溫降低了昆蟲的抵御能力，從而增加了孢子對寄主昆蟲的侵染機會。

高濕條件有利于白僵菌孢子在寄主體表的萌發(fā)和侵染。林華峰等(1998)認(rèn)為白僵菌孢子在表皮的萌發(fā)和侵入需要85%以上的濕度，少量寄主死亡是由于孢子隨食物進入消化道而導(dǎo)致感染。也有研究認(rèn)為濕度較低時白僵菌孢子可以在某些昆蟲體表萌發(fā)并侵染(Shippetal., 2003)，孫魯娟等(2001)發(fā)現(xiàn)在70%-80%相對濕度下白僵菌孢子對棉鈴蟲幼蟲的致死率可達52%，Ota等(1999)在溫室內(nèi)應(yīng)用白僵菌防治粉虱，環(huán)境平均濕度為78.1%-84.7%，對粉虱起到了很好的控治作用，也證明濕度較低時白僵菌可以侵染粉虱。本實驗中相對濕度低于70%時，白僵菌HFW-05對煙粉虱若蟲的致死率可達60%左右，進一步印證了環(huán)境濕度較低時，某些白僵菌菌株可以在寄主體表萌發(fā)入侵。本試驗僅研究了濕度和溫度的單因素條件下白僵菌HFW-05對煙粉虱的致病力差異，關(guān)于高溫低濕和低溫低濕等極端不利條件下白僵菌HFW-05對煙粉虱的致病力有待進一步研究。煙粉虱主要發(fā)生在夏季高溫季節(jié)，日間溫度有較長時間維持在35℃左右，嚴(yán)重超過白僵菌萌發(fā)生長的適溫范圍，因此在高溫下有致病作用的白僵菌菌株對于煙粉虱的生物防治更有意義。

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PathogenicityandhistopathologicalaffectionofBeauveriabassianaHFW-05onBemisiatabacinymphs

CAO Wei-Ping, SONG Jian, Zhao Jian-Jiang, FENG Shu-Liang, DU Li-Xin*

(IPM Center of Hebei Province, Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture, Institute of Plant Protection, Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Baoding 071000, Hebei Province, China)

Temperature and humidity are key factors to affect the pathogenicity ofBeauveriabassianaHFW-05. The pathogenicity ofB.bassianatoBemisiatabacinymphs under different temperatures and humidities were studied in the laboratory. The histopathological changes ofB.tabacinymphs infected by strain HFW-05 also were observed. The corrected mortality of each period ofB.tabacinymphs treated by strain HFW-05showed the same curves. The infection peak day of different instar nymphs appeared on the 3rd-4thday after inoculation. The LC50of the first to the third instar nymphs were 5.94×104，1.06×105and 5.08×105conidia/mL , respectively. The LT50were 2.54 d，2.68 d and 3.18 d, respectively. It showed very low pathogenic activity to the egg which infection rate was 24.9% after 6 d inoculation with 1×108conidia/mL concentration. Strain HFW-05 showed the highest pathoginicity toB.tabacinymphs at 25℃ and 30℃. The pathoginicity of HFW-05 decreased when the temperature <25℃ or >30℃. The mortalities of theB.tabacinymphs under different humidities showed significant differences. The nymphs died most quickly and the mortality was the highest under above 90% relative humidity, while the mortality decreased drastically under 70%-90% relative humidity. The mortality was about 60% under below 70% relative humidity. The conical lingula ofB.tabacinymphs was the most important invasive part.B.bassianaHFW-05 has the potential to be used for biological control againstB.tabaci.

Beauveriabassiana;Bemisiatabaci; pathogenicity; histopathological changes

河北省科技計劃項目(13226510D)；河北省農(nóng)科院研究與發(fā)展項目(A2015120102)；河北省財政項目(F16C10003)

曹偉平，女，1975年生，河北饒陽人，副研究員，主要從事害蟲生物防治，E-mail: cwplx751209@163.com

*通訊作者Author for correspondence，E-mail: lxdu2091@163.com

Received: 2016-06-30；接受日期Accepted: 2016-11-30

Q965.9;S476

：A

1674-0858(2017)04-762-08

曹偉平，宋健，趙建江,等.球孢白僵菌HFW-05對煙粉虱的致病力及組織病理影響[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報，2017,39(4):762-769.