菌毒敵液、強(qiáng)力消毒靈液等六種消毒藥以及黃連、甘草、黃柏三種中藥不同提取法對(duì)實(shí)驗(yàn)室空氣菌的敏感程度的探究

張正瑩,吳 潤(rùn)

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅省蘭州市730000；2.景泰縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅省白銀市730400）

菌毒敵液、強(qiáng)力消毒靈液等六種消毒藥以及黃連、甘草、黃柏三種中藥不同提取法對(duì)實(shí)驗(yàn)室空氣菌的敏感程度的探究

張正瑩1,2,吳 潤(rùn)1

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅省蘭州市730000；2.景泰縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅省白銀市730400）

為了驗(yàn)證菌毒敵液、強(qiáng)力消毒靈液等六種消毒藥以及黃連、甘草、黃柏三種中藥不同提取法對(duì)實(shí)驗(yàn)室空氣菌的敏感程度，本實(shí)驗(yàn)采用微管-平板法測(cè)定了菌毒敵液、強(qiáng)力消毒靈液等六種消毒藥以及黃連、甘草、黃柏三種中藥不同醇提物和水提物對(duì)實(shí)驗(yàn)室空氣菌的最小抑菌濃度（MIC）,表明消毒藥品較中藥對(duì)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌的抑制作用效果好，黃連醇提物對(duì)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌的抑制作用明顯，甘草、黃柏的水提物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的抑制作用不明顯。綜合經(jīng)濟(jì)效益和滅菌效果的綜合考慮，中藥滅菌可值得研究。

醇提物；最小抑菌濃度；水提物；消毒藥

早在20世紀(jì)50年代我國(guó)醫(yī)藥工作者即開(kāi)始了中藥抑菌作用與抑菌成分研究，并發(fā)現(xiàn)許多具有抗菌作用的中藥。常規(guī)的藥敏實(shí)驗(yàn)方法：有①紙片瓊脂擴(kuò)散法；②試管稀釋法；③平板稀釋法；④打洞法；⑤挖溝法；⑥微量稀釋法等。然而這些方法也存在著其缺陷或局限性，因此我們應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇較合適的方法。試管稀釋法是一個(gè)比較好的方法，但具有實(shí)驗(yàn)工作量大，操作繁瑣，一個(gè)系列稀釋度含藥培養(yǎng)基只能測(cè)一種菌，營(yíng)養(yǎng)要求高的菌無(wú)法培養(yǎng)等弊端；打洞法同紙片擴(kuò)散法，存在藥物擴(kuò)散問(wèn)題，又沒(méi)有中藥標(biāo)準(zhǔn)紙片，實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以控制；平板稀釋法只需制兩個(gè)系列稀釋度含藥平板，一個(gè)稀釋度可同時(shí)測(cè)多種細(xì)菌，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，是一種比較理想的方法，但是必須注意細(xì)菌之間交叉感染的問(wèn)題；微量稀釋法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，且簡(jiǎn)便易行，但是結(jié)果不易觀察，加顯色劑以后不適用于需要加血的培養(yǎng)基。

根據(jù)以往的研究，傅文棟[1]對(duì)常見(jiàn)的抗菌抗中草藥的主要有效成分進(jìn)行了列表，對(duì)此做出了總結(jié)，如金銀花為綠原酸、異綠原酸、新綠原酸；黃連為小檗堿、黃連堿、巴馬亭。盧芳國(guó)[2]等研究了12個(gè)中藥復(fù)方的抗菌作用，發(fā)現(xiàn)由麻黃、杏仁、甘草、黃芩、魚(yú)腥草等組成的方劑抑菌效果最為明顯。楊勇[3]等對(duì)黃連中4種主要的生物堿的抑菌活性進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)小檗堿的抑菌活性最大，且4種黃連生物堿對(duì)G+菌的抑制活性大于G-菌和酵母菌。鄔蘇曉[4]等人研究發(fā)現(xiàn)黃柏抑菌效果較好，MIC為125mg/mL。中草藥在其他國(guó)家也是有所應(yīng)用的，WHO曾經(jīng)做出過(guò)這樣的估計(jì)，全球使用中藥的人數(shù)占全世界人口的65%-80%。

在中藥體外抑菌實(shí)驗(yàn)的研究中，一方面證實(shí)了其具有抑菌作用，另一方面也試圖發(fā)現(xiàn)其中的有效抑菌成分。到現(xiàn)在為止，發(fā)現(xiàn)有效地抑菌成分很多，而且有很多已經(jīng)直接或經(jīng)過(guò)改造后投入使用。從20世紀(jì)50年代起我國(guó)醫(yī)藥工作者開(kāi)始了對(duì)中藥抑菌作用與抑菌成分的研究，發(fā)現(xiàn)了很多有抗菌作用的中藥和其抗菌的主要成分，抗菌成分是很復(fù)雜的，它主要包括有生物堿、有機(jī)酸、萜類、黃酮、醌類等。

實(shí)驗(yàn)部分

1 材料

1.1 藥品

名稱 生產(chǎn)廠家金碘王（聚維酮碘溶液） 農(nóng)大潤(rùn)農(nóng)生物科技有限公司中農(nóng)衛(wèi)康消毒劑 哈爾濱中農(nóng)華大獸藥有限公司菌毒敵 湖南大乘醫(yī)藥化工有限公司強(qiáng)力消毒靈 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院中獸疫研究所藥廠威特格瑞 臨洮威特藥業(yè)有限公司燒堿 浩潤(rùn)化工甘草 景泰縣同濟(jì)大藥房黃柏 景泰縣同濟(jì)大藥房黃連 景泰縣同濟(jì)大藥房

1.2 細(xì)菌 實(shí)驗(yàn)室空氣菌

1.3 試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂，生產(chǎn)廠家：青島市高科技園海博生物科技有限公司

革蘭氏染液，生產(chǎn)廠家：青島市高科技園海博生物科技有限公司

普通肉湯培養(yǎng)基，生產(chǎn)廠家：杭州微生物試劑有限公司

1.4 儀器

儀器 型號(hào) 生產(chǎn)廠家生物安全柜 BSC-1300IIA2 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司壓力蒸汽滅菌器 WG-C35N.L 威海威高生物技術(shù)有限公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 DHG-9053A上海齊欣科學(xué)儀器有限公司電子天平 FA2104N 上海精密科學(xué)儀器有限公司超純水儀 OKP-S010 上海淶科儀器有限公司冰箱 BCD-256DT 青島海爾股份有限公司電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9052上海齊欣科學(xué)儀器有限公司

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制備

2.1.1 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備

30g營(yíng)養(yǎng)瓊脂加入1000mL超純水，高壓滅菌121℃，15min。放入生物安全柜，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)瓊脂溫度降到55℃左右時(shí)澆平板2-3cm厚。待平板內(nèi)瓊脂凝固后，冷藏備用[5]。

2.1.2 普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的制備

30g普通肉湯加入1000mL超純水，高壓滅菌121℃，15min。放入生物安全柜，紫外線消毒降溫到室溫冷藏備用。

2.2 試驗(yàn)藥液的制備

2.2.1 菌毒敵液在生物安全柜內(nèi)取10mL滅菌超純水加20uL菌毒敵原液將其作1：500倍稀釋到畜禽房舍及器具消毒濃度，冷藏備用。

2.2.2 中農(nóng)衛(wèi)康消毒劑 在生物安全柜內(nèi)取10mL滅菌超純水加20uL菌毒敵原液將其作1：500倍稀釋到畜禽房舍及器具消毒濃度，冷藏備用。

2.2.3 金碘王（聚維酮碘溶液）在生物安全柜內(nèi)取10mL滅菌超純水加10uL菌毒敵原液將其作1：1000倍稀釋到養(yǎng)殖場(chǎng)常規(guī)消毒濃度，冷藏備用。

2.2.4 威特格瑞液 在生物安全柜內(nèi)取10mL滅菌超純水加0.01g菌毒敵原液將其作1：1000倍稀釋到養(yǎng)殖場(chǎng)常規(guī)消毒濃度，冷藏備用。

2.2.5 強(qiáng)力消毒靈液 在生物安全柜內(nèi)取10mL滅菌超純水加0.01g菌毒敵原液將其作1：1000倍稀釋到飼養(yǎng)場(chǎng)所器具消毒濃度，冷藏備用。

2.2.6 燒堿溶液在生物安全柜內(nèi)稱取0.3g燒堿，加滅菌超純水10mL將其配成3%消毒濃度，冷藏備用。

2.2.7 醇提取 將黃連、黃柏、甘草粉碎，分別準(zhǔn)確稱取10g，放入燒杯內(nèi)，加入 70%乙醇100mL，用超聲波提取30min，提取3次，然后加熱濃縮，濃縮液放入恒溫干燥箱中干燥成藥膏，再用蒸餾水溶解配成1g/mL的藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆肹11]。

2.2.8 水提取 將黃連、黃柏、甘草粉碎，分別準(zhǔn)確稱取10g，放入錐形瓶中，加入適量的蒸餾水侵泡2-3h，用超聲波作用30min，然后用水煎20min，每種藥煎2-3次后濃縮成藥膏，用蒸餾水稀釋到1g/mL的藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆肹5]。

2.3 菌種的準(zhǔn)備

取澆好的一個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板打開(kāi)放置在實(shí)驗(yàn)室，24小時(shí)后挑取菌落并用普通營(yíng)養(yǎng)肉湯做增菌培養(yǎng)，放置恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)18-24h候得原菌液。取試管分別對(duì)原菌液用生理鹽水進(jìn)行二倍比稀釋，用移液器從8號(hào)管中取20μL菌液注入平板上，重復(fù)做3個(gè)平板，并用L棒將其涂勻，培養(yǎng)18-24h查菌落數(shù)，得出原菌液的細(xì)菌濃度。將原菌液或稀釋后的菌液用生理鹽水稀釋到所需濃度106cfu/mL[6]，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 各藥液對(duì)試驗(yàn)菌的最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

在生物安全柜內(nèi)，采用微管-平板法。每種藥物12支EP管，每個(gè)EP管內(nèi)加入500μL的肉湯，向第1支EP管里加入500μL配好的藥液，混勻，從中吸取500μL加入第2支EP試管[5]，依次類推，直至第11支試管，棄去500μL，12號(hào)EP管做陰性對(duì)照。1-12號(hào)EP管內(nèi)加入20μL菌液，37℃培養(yǎng)18-24h后，將其分別接種到平板上[13]，37℃再培養(yǎng)18-24h后，得試驗(yàn)藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的MIC[7][8]。

3 試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)試驗(yàn)[8]，可以得出菌毒敵液、中農(nóng)衛(wèi)康消毒劑、金碘王（聚維酮碘溶液）、威特格瑞液、強(qiáng)力消毒靈液和燒堿溶液的最小抑菌濃度的MIC,記錄于表2。

藥名 MIC（g/mL）菌毒敵液 1/500*8中農(nóng)衛(wèi)康消毒劑 1/500*16金碘王（聚維酮碘溶液） 1/500*2威特格瑞液 1/500*128強(qiáng)力消毒靈液 1/500*128燒堿溶液 1/500*256甘草醇提物 1/32甘草水提物 1/8黃連醇提物 1/64黃連水提物 1/16

黃柏醇提物 1/32黃柏水提物 1/8

4 結(jié)論

燒堿溶液對(duì)試驗(yàn)菌的抑制作用明顯，強(qiáng)力消毒靈液和威特格瑞液對(duì)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌的抑制作用相當(dāng)，對(duì)試驗(yàn)菌的抑制作用僅次于燒堿，其它消毒藥對(duì)某些實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌的抑制作用不明顯。其中三種中藥的醇提物都比水提物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的抑制作用強(qiáng)，這三種中藥其中黃連醇提物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的抑制作用最強(qiáng)，黃連和黃柏的水提物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的抑菌作用較小。此結(jié)論為實(shí)驗(yàn)室消毒等工作具有指導(dǎo)意義。

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1003-8655（2017）04-0010-03