鋅離子對螺旋霉素生物合成的影響

武 培,張小紅,劉守強,謝 婷,孫玉杰

(1.西北農(nóng)林科技大學,陜西 楊凌 712100;2.天方藥業(yè)有限公司,河南 駐馬店 463000)

鋅離子對螺旋霉素生物合成的影響

武 培1,2,張小紅1*,劉守強2,謝 婷2,孫玉杰2

(1.西北農(nóng)林科技大學,陜西 楊凌 712100;2.天方藥業(yè)有限公司,河南 駐馬店 463000)

在螺旋鏈霉菌發(fā)酵過程中添加鋅離子有利于螺旋霉素的生物合成。在搖瓶發(fā)酵過程中，于發(fā)酵開始28 h時向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.24 g/L的鋅離子，螺旋霉素的效價提高17%；放大至15 L發(fā)酵罐，成功驗證了鋅離子對螺旋霉素生物合成的促進作用，發(fā)酵放罐效價達3590 U/mL，比對照罐效價提高了20%，比搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的效價提高了125 U/mL。采用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中的有機酸發(fā)現(xiàn)，鋅離子可能刺激了菌體代謝，提高了螺旋霉素合成前體乙酸和丙酸的含量，進而促進了螺旋霉素的生物合成。

螺旋鏈霉菌；螺旋霉素；鋅離子；生物合成

螺旋霉素(spiramycin，簡稱SPM)是一種16元的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，屬于多組分中譜抗生素[1-2]，無誘導耐藥性，不良反應較低，交叉耐藥性小[3]，在臨床上占有重要的地位[4]。在螺旋霉素的生物合成過程中，菌體的初級代謝與次級代謝相互交叉作用，故在生長期內(nèi)促進初級代謝不僅有助于增大生物量，增強菌體活力，還為合成螺旋霉素提供更多的原材料。大量的前體物質(zhì)會在螺旋霉素生物合成過程中通過一系列反應參與普拉特內(nèi)醋的形成，如乙酸、丙酸、丁酸及一些還未被研制清楚的物質(zhì)[5-6]。

目前，國內(nèi)外學者對螺旋霉素的生物合成進行了多方面的優(yōu)化研究，從碳源、氮源、接種量、攪拌和剪切力到前體的添加等，取得了斐然的成果。例如：Ahmed Lebrihi等[7]報道銨離子調(diào)節(jié)氨基酸的代謝，氨基酸影響了螺旋霉素前體乙酸，丙酸和丁酸等的合成，在一定程度上影響螺旋霉素的生物合成。胡蓉等[5]發(fā)現(xiàn)在螺旋霉素鏈霉菌發(fā)酵過程中，添加丙三醇丙會促進細胞的EMP途徑和TCA循環(huán)，增加前體物質(zhì)的含量，為其合成螺旋霉素提供更多的能量，多方面提高了螺旋霉素的效價。毛全貴等[8]報道某些金屬離子對螺旋霉素的生物合成有一定的影響，通過小試、中試及生產(chǎn)性實驗驗證了Cu2+、Ca2+、Fe2+和Mg2+等不同金屬離子、不同添加濃度及不同添加時間對螺旋霉索發(fā)酵水平的影響。鋅離子是細胞中堿性磷酸酶、脫氫酶、肽酶和脫羧酶的輔因子，存在于乙醇脫氫酶、堿性磷酸酶、醛縮酶、RNA與DNA聚合酶中。發(fā)酵培養(yǎng)基中鋅離子能提高磷酸甘油醛脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等鋅酶的活性[9-11]。目前，關于鋅離子對螺旋霉素生物合成的影響未見相關研究報道。

本文通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)考察不同濃度的鋅離子、鋅離子不同添加時間對螺旋霉素生物合成的影響，并擴大至15 L發(fā)酵罐進行驗證，同時檢測發(fā)罐酵體系發(fā)酵液中螺旋霉素合成前體乙酸和丙酸的濃度，以明確鋅離子對螺旋霉素生物合成的影響，為提高螺旋霉素工業(yè)化生產(chǎn)效率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

螺旋霉素鏈霉菌(Streptomyces spiramyceticus)，由天方藥業(yè)有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(%)：淀粉3.0，黃豆餅粉2.5，NaCl 0.2，蛋白胨0.5，玉米漿0.4，CaCO30.5，pH值 6.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：淀粉5.0，黃豆餅粉2.0，魚粉2.5，葡萄糖0.3，KH2PO40.1，NaCl 0.8，玉米漿2.5，NH4NO30.5，MgSO40.1，CaCO30.5，植物油0.4，pH值 6.4。

補料培養(yǎng)基(%)：淀粉12.0，魚粉2.0，α-淀粉酶0.03，玉米漿1.5，NH4NO30.8，NaCl 0.5，KH2PO40.05，MgSO40.1，CaCO30.7，植物油0.4，泡敵0.03，自然pH值。

培養(yǎng)基滅菌條件：121 ℃，30 min。

1.1.3 儀器與設備

pH計：北京哈納儀器廠；中型壓力滅菌器：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械有限公司；TDL-80-2B臺式低速離心機：上海安亭科學儀器廠；SZK202超凈工作臺：蚌埠中瑞凈化設備有限公司，GZF-GF101-BS干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；CX31-12L02顯微鏡：奧林巴斯；BSW-A 10 L發(fā)酵罐：上海傲中生物工程有限公司，LC-20AT高效液相色譜儀：島津企業(yè)管理(中國)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)工藝

1.2.1.1 搖瓶培養(yǎng)

搖瓶一級種子培養(yǎng)：挖取斜面培養(yǎng)基上0.5 cm左右的菌塊，接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，27℃，220 r/min，培養(yǎng)48 h。

搖瓶二級種子培養(yǎng)：搖瓶一級種子培養(yǎng)液以6%的接種量接種到裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，27℃，220 r/min，培養(yǎng)24 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：搖瓶二級種子培養(yǎng)液以6%的接種量接種到裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，27℃，220 r/min，培養(yǎng)96 h。

1.2.1.2 15 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

發(fā)酵罐所需的一級和二級種子培養(yǎng)方法與搖瓶種子培養(yǎng)方法相同。

將二級種子培養(yǎng)液以6%的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的15 L發(fā)酵罐中(接后體積10 L)。控制發(fā)酵溫度27℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，風量1:0.3 vvm，培養(yǎng)108 h。發(fā)酵25 h起每隔8 h補一次料，以保證發(fā)酵過程中有足夠的營養(yǎng)和能量。

1.2.2 鋅離子對發(fā)酵培養(yǎng)中螺旋霉素生物合成的影響

1.2.2.1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中鋅離子最適添加濃度的確定

在搖瓶發(fā)酵開始0 h時分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加為0.16、0.20、0.24、0.28和0.32 g/L的鋅離子作為實驗組，以不添加鋅離子的作為對照組，進行放瓶效價的比較，確定搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中鋅離子的最適添加濃度。

1.2.2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中鋅離子最適添加時間的確定

在搖瓶發(fā)酵中分別于20、24、28、32和36 h添加0.24 g/L的鋅離子作為實驗組，并以不添加鋅離子作為對照組，發(fā)酵結束后，通過比較放瓶效價，確定搖瓶發(fā)酵中鋅離子的最適添加時間。

1.2.2.3 小試(15 L發(fā)酵罐)

利用15 L發(fā)酵罐進行不添加鋅離子(對照組)和在發(fā)酵24 h時添加量0.24 g/L的鋅離子(實驗組)的發(fā)酵培養(yǎng)，周期取樣，通過比較放罐效價以及發(fā)酵過程中乙酸濃度和丙酸濃度的變化情況，進一步確定鋅離子對螺旋霉素生物合成的影響。

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 生物效價

生物效價的測定采用管碟法[12]。

1.2.3.2 有機酸的測定

采用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中乙酸和丙酸的濃度，采用內(nèi)標法[13]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得實驗數(shù)據(jù)均為最少3次平行實驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 不同濃度鋅離子對螺旋霉素生物合成的影響

在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加一定濃度梯度的鋅離子(0.16～0.32 g/L)作為實驗組，以不添加鋅離子作為對照組，搖瓶發(fā)酵效價結果如圖1所示。

圖1 不同濃度鋅離子對螺旋霉素生物合成的影響

由圖1可知，搖瓶發(fā)酵開始0 h時分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的鋅離子在一定程度上有利于螺旋霉素的生物合成。螺旋霉素搖瓶發(fā)酵效價隨著鋅離子濃度的增加而增加，當鋅離子的濃度為0.24 g/L時，螺旋霉素搖瓶發(fā)酵效價達到最大值3201 U/mL，比對照組效價提高了10%；當鋅離子的濃度繼續(xù)增大時，螺旋霉素搖瓶發(fā)酵效價反而大幅度降低，當鋅離子的濃度為0.32 g/L時，螺旋霉素搖瓶發(fā)酵效價達3018 U/mL，比對照組效價僅提高了3%，可能是菌體不能完全利用高濃度的鋅離子，多余的鋅離子可能對菌體代謝產(chǎn)生了毒性，影響了螺旋霉素的合成。因此，鋅離子濃度為0.24 g/L時，為促進螺旋霉素搖瓶發(fā)酵效價的最適濃度。

2.2 鋅離子不同添加時間對螺旋霉素生物合成的影響

在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別于發(fā)酵的不同時間添加0.24 g/L的鋅離子，以不添加鋅離子作為對照，發(fā)酵結束后，搖瓶效價測定結果如圖2所示。

圖2 鋅離子不同添加時間對螺旋霉素生物合成的影響

由圖2看出，在螺旋鏈霉菌搖瓶發(fā)酵的不同時間添加鋅離子對螺旋霉素產(chǎn)量的影響存在明顯差異，在發(fā)酵20～36 h期間添加鋅離子均顯著促進了螺旋霉素產(chǎn)量的提高，與對照組相比，效價分別提高了12%、14%、17%、15%和13%。其中發(fā)酵28 h時添加0.24 g/L的鋅離子，對螺旋霉素生物合成的促進作用最明顯，搖瓶發(fā)酵效價高達3465 U/mL?？赡馨l(fā)酵28 h添加鋅離子大大刺激了菌體的初級代謝，增了強菌體活力，積累了大量合成前體物，為發(fā)酵后期大量合成螺旋霉素提供了更多的原材料。

2.3 15 L發(fā)酵罐中添加鋅離子對螺旋霉素生物合成的影響

前期搖瓶實驗證明，在搖瓶發(fā)酵過程中，于發(fā)酵28 h時向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.24 g/L的鋅離子，螺旋霉素的效價提高了17%。以此濃度和添加時間為基點放大至15 L發(fā)酵罐，分析放罐效價，進一步確定鋅離子對螺旋霉素生物合成的影響。實驗結果如圖3所示。

圖3 15 L發(fā)酵罐中添加鋅離子對螺旋霉素生物合成的影響

圖3表明，當向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了鋅離子后，螺旋霉素生物合成能力大幅度提高，放罐效價達3590 U/mL，比對照罐效價提高了20%。同時，相比搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的效價3465 U/mL，發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵效價提高了125 U/mL，這不僅驗證了在發(fā)酵開始28 h時向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.24 g/L的鋅離子對螺旋鏈霉的生物合成有促進作用，同時也反映了鋅離子對螺旋霉素工業(yè)生產(chǎn)的意義。

2.4 15 L發(fā)酵罐中添加鋅離子對有機酸積累的影響

15 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)螺旋鏈霉菌時，周期取樣，采用高效液相色譜法測發(fā)酵液中乙酸濃度和丙酸濃度，分析鋅離子對螺旋鏈霉菌發(fā)酵過程中有機酸積累的影響。實驗結果如圖4所示。

圖4表明，28 h向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.24 g/L的鋅離子和不添加鋅離子的對照組有顯著差異，76 h左右大概是發(fā)酵的一個時間節(jié)點，76 h前對照組乙酸濃度比實驗組略高，而76 h后，實驗組乙酸濃度迅速增加，96 h達到最高，濃度為2.45 g/L，但此時對照組乙酸濃度僅為0.76 g/L，僅為實驗組的30%。在76～96 h間乙酸大量積累為螺旋霉素的生物合成提供了條件，96 h后實驗組的乙酸濃度開始下降，108 h乙酸濃度僅為0.93 g/L，說明乙酸被菌體利用得較多，而對照組中的乙酸濃度也逐漸降低至0.43g/L。對于丙酸來講，整體呈增長趨勢，對照組整體高于對照組。對照組丙酸濃度由2.67 g/L增長至4.27g/L，實驗組丙酸濃度由2.46 g/L增長至4.10 g/L，說明丙酸在整個發(fā)酵過程中處于積累狀態(tài)，實驗組積累的丙酸濃度低于對照組，推測可能被利用的更充分。乙酸和丙酸可以促進大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的生物而合成，表明鋅離子的添加大大豐富了大環(huán)內(nèi)酯合成的前體庫，進一步說明了鋅離子對螺旋霉素的生物合成具有促進作用。

圖4 發(fā)酵液中有機酸的含量

3 結論

在搖瓶發(fā)酵過程中，于發(fā)酵開始28 h時向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.24 g/L的鋅離子，螺旋霉素的效價提高17%。放大至15 L發(fā)酵罐，驗證了發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加鋅離子可大幅度提高螺旋霉素的生物合成能力，放罐效價達3590 U/mL，比對照罐效價提高了20%，比搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)效價提高了125 U/mL。同時采用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中乙酸和丙酸的濃度變化，發(fā)現(xiàn)有機酸濃度受鋅離子添加的影響，鋅離子可能刺激了菌體代謝，提高了螺旋霉素合成前體乙酸和丙酸的含量，進而促進了螺旋霉素的生物合成。

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(本文文獻格式：武 培,張小紅,劉守強，等.鋅離子對螺旋霉素生物合成的影響[J].山東化工,2017,46(11):20-22,26.)

Influence of Zn2+on Spiramycin Biosynthesis

WuPei1,2,ZhangXiaohong1*,LiuShouqiang2,XieTing2,SunYujie2

(1.Northwest A&F University, Yangling 712100,China;2.Topfond Pharmaceutical Co., Ltd., Zhumadian 463000,China)

Adding Zn2+made for Spiramycin biosynthesis during the fermentation process of Streptomyces spiramyceticus. It increased the titer about 17% more than the control that added 0.24 g/L of Zn2+ions at 28 h in the process of shake flask fermentation. It was successfully demonstrated the role of Zn2+ions to promote Spiramycin biosynthesis after amplification to 15 L fermentor. The titer of fermentation tank was 3590 U/mL, which was increased by about 20% compared with that of the control tank, and the titer was increased by 125 U/mL compared with that of the shake flask. The detection of organic acids in the fermentation broth by HPLC showed that the Zn2+ions could stimulate the metabolism of the cells and improve the content of acetic acid and propionic acid, and further promote the Spiramycin biosynthesis.

Streptomyces spiramyceticus;spiramycin;Zn2+;biosynthesis

2017-04-08

武 培(1984—)，男，碩士研究生，工程師，主要從事微生物發(fā)酵工作；通訊作者：張小紅，女，博士，副教授，碩士生導師。

TQ465.5

A

1008-021X(2017)11-0020-03