添食氟化物后雌雄家蠶中腸和頭部氟離子的吸收累積規(guī)律

米 智 劉荔貞 徐 水 朱 勇

(1. 西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716；2. 山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大同 037009；3. 山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，大同 037009)

添食氟化物后雌雄家蠶中腸和頭部氟離子的吸收累積規(guī)律

米 智1,2劉荔貞3徐 水1朱 勇1

(1. 西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716；2. 山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大同 037009；3. 山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，大同 037009)

為了探討氟離子在雌雄家蠶中腸和頭部的吸收累積情況，以家蠶耐氟品種T6和氟化物敏感品種734為研究材料，按照常規(guī)方法飼養(yǎng)到5齡起蠶時，對2品種家蠶進(jìn)行雌雄鑒別，并將其分區(qū)飼養(yǎng)。添氟組喂食經(jīng)200mg/kg NaF溶液浸泡后的桑葉，另設(shè)清水對照組，檢測不同性別家蠶中腸和頭部氟離子濃度的積累情況。結(jié)果表明，在中腸中，對照組734和T6雄蠶氟離子濃度分別高雌蠶1.20倍和1.03倍，添氟組734和T6雄蠶均是雌蠶的1.05倍。734雄蠶添氟組是對照組的1.67倍，而雌蠶添氟組是對照組的1.58倍。T6雄蠶添氟組是對照組的1.22倍，而雌蠶添氟組是對照組的1.20倍。在頭部，對照組734和T6雄蠶分別是雌蠶1.39倍和1.08倍，添氟組734和T6雄蠶分別約是雌蠶的1.10倍和1.03。734雄蠶添氟組是對照組的1.10倍，而雌蠶添氟組是對照組的1.39倍。T6雄蠶添氟組是對照組的1.10倍，而雌蠶添氟組是對照組的1.03倍。兩種組織中，均表現(xiàn)出雄蠶中的氟離子濃度高于雌蠶的。

家蠶；氟化物；頭；中腸；氟離子

近年來隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展,陶瓷、磚瓦、磷肥、煉鋁、水泥、玻璃、火力發(fā)電等部門排放的廢氣中含有大量氟化物，給蠶桑生產(chǎn)帶來較大的危害。氟化物是一類原生質(zhì)毒劑，易透過各種組織的細(xì)胞壁與原生質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生毒性效應(yīng)[1,2]。研究表明，氟化物隨桑葉進(jìn)入蠶體累積于消化液、腸壁和體壁等處，通過消化管進(jìn)入血液，在血液和組織中與蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制生長發(fā)育，出現(xiàn)氟中毒癥狀[3]。雌雄家蠶對氟的耐受性因品種而異，但很多品種均表現(xiàn)出雄蠶耐氟性能強于雌蠶，從統(tǒng)計學(xué)角度看雌雄家蠶耐氟性能有差異但尚未達(dá)到顯著水平[4]。

氟離子測定方法常用的有氟離子選擇電極法、高溫灰化—堿融法、濕灰化—氣體吸收法等[5,6]。其中氟離子電極法，具有簡便、快捷、準(zhǔn)確等優(yōu)點，完全可以應(yīng)用于多樣品實驗中的氟離子含量測定。其余方法程序復(fù)雜，測定成本高，所需時間長。對于蠶桑業(yè)中氟化物污染程度的鑒定，要求快速、便捷、準(zhǔn)確，氟離子選擇電極法更為適合。

氟離子選擇電極檢測方法采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法[7,8]：即置電極于一系列的標(biāo)準(zhǔn)液中，測定標(biāo)準(zhǔn)液的電極電位。標(biāo)準(zhǔn)液的范圍應(yīng)包括預(yù)計樣品溶液的濃度，然后測量樣品溶液的電極電位。在對半數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度對數(shù)值(橫坐標(biāo))與相應(yīng)的電極電位(縱坐標(biāo))。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程，求得樣品溶液的氟離子濃度。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定時，測定液的pH值應(yīng)在5-6左右，因為氟離子選擇電極一般以pH在5-6之間測定值較為準(zhǔn)確。

本實驗在已知雌雄家蠶耐氟性的前提下，檢測不同組織中氟離子濃度，以期闡明氟離子在不同性別不同組織中的累積情況。

1 材料與試劑

1.1實驗材料

家蠶耐氟品種T6、敏感品種734，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供，西南大學(xué)家蠶遺傳育種室保存。按照常規(guī)方法飼養(yǎng)到5齡起蠶時，對家蠶進(jìn)行雌雄分別，并分區(qū)飼養(yǎng)。對照組喂食清水浸泡11min后自然晾干的新鮮桑葉，試驗組用200mg/kg NaF溶液浸泡11 min后自然晾干的桑葉飼養(yǎng)[9]，每隔8h添食1次，每天添食3次。試驗采用平行設(shè)計，每組設(shè)3個重復(fù)。從5齡起蠶第1-5d每天分別在冰盤上取各組幼蟲的組織樣品。

1.2樣品處理

(1)將蠶體置于冰盤上解剖，小心取出中腸，去掉中腸的內(nèi)容物，用0.9%生理鹽水沖洗干凈。

(2)取10頭家蠶中腸，加入5mL 0.04M pH7.0的PBS進(jìn)行勻漿，取1mL作為測試樣品。

(3)小心用滅菌后的剪刀剪取家蠶頭部組織，加入質(zhì)量9倍體積的9g/L NaCl溶液，制成10%的勻漿，3 500rpm離心10min，取上清0.5mL用作測試樣品。

(4)將測試樣品置于50mL容量瓶中，加10mL鹽酸(1+11)，密閉浸泡提取1h(不時輕輕搖動)，應(yīng)量避免樣品粘于瓶壁上。提取后加25mL總離子強度緩沖劑，加水至刻度，混勻，測定。

1.3試劑和藥品

本實驗所用水均為超純水，試劑全部貯于聚乙烯塑料瓶中。氟化鈉(NaF)需經(jīng)95-105℃干燥4h后冷卻(至恒重)使用。濃鹽酸(HCl)、乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)、檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2H2O)、乙酸(CH3COOH)、氫氧化鈉(NaOH)、高氯酸(HClO4)、氯化鈉(NaCl)均由科隆化工有限公司。

1.4儀器與設(shè)備

PHS-3C型精密酸度計(成都世紀(jì)方舟科技有限公司)，PF-1型氟離子選擇性電極(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，雷磁232型參比電極(上海雷磁儀器廠)，78-1型磁力加熱攪拌器(金壇市富華儀器有限公司)，純水儀(德國millipor-DQ3)。

1.5試劑配制

(1)1mol/L鹽酸：取10mL濃鹽酸，超純水稀釋，定容至120mL。

(2)1mol/L乙酸：準(zhǔn)確量取57.23mL冰乙酸，超純水稀釋，定容至1 000mL。

(3)3mol/L乙酸鈉溶液：稱取204g乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)溶于300mL水中，加1mol/L乙酸，調(diào)節(jié)pH至7.0，超純水稀釋，定容至500mL。

(4)0.75mol/L檸檬酸鈉溶液：稱取110g檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2H2O)溶于300mL水中，加14mL高氯酸，再加水稀釋，定容至500mL。

(5)總離子強度緩沖劑：3mol/L乙酸鈉溶液與0.75mol/L檸檬酸鈉溶液等量混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。

(6)氟標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.22g氟化鈉，溶于水，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，置冰箱中保存。

(7)氟標(biāo)準(zhǔn)使用液：吸取10.0mL氟標(biāo)準(zhǔn)溶液置于100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。如此反復(fù)稀釋此溶液至氟離子濃度為1.0μg/mL。

2 實驗方法

2.1繪制氟離子標(biāo)準(zhǔn)曲線

(1)接通酸度計電源，預(yù)熱20min。

(2)將酸度計按鍵選擇置“mv”位置，此時儀器顯示應(yīng)為0.00。

(3)取下飽和甘汞電極下端和上端小膠帽.檢查電極內(nèi)液位、晶體氣泡及多孔型物質(zhì)的滲漏情況。

(4)若都合格，則用蒸餾水清洗電極外部，用濾紙吸干外壁水分，若不合格，則加入飽和的KCl，以滿足電極需要。

(5)取出已在10-3mol/L的NaF溶液中浸泡活化2h以上的氟離子電極。

(6)檢查電極晶片內(nèi)側(cè)是否有氣泡。若有，應(yīng)讓電極下端晶片朝上，輕擊電極桿以趕出氣泡。

(7)將飽和甘汞電極和氟離子電極分別置于電極夾上，并接入儀器。

狐假虎威——The Fox Who Profited by the Tiger’s Might瞎子問太陽——-What the Sun Look Like?神像和好人——A Good Man iseasy to Bully.

(8)取6個潔凈的50mL容量瓶，分別加入10μg/mL氟標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，并在各容量瓶中分別加入總離子強度調(diào)節(jié)緩沖劑25mL和1mol/L鹽酸10mL，用蒸餾水稀釋至標(biāo)線后混勻，并依次由1到6編號。

(9)取一潔凈的50mL小燒杯，裝上40mL蒸餾水并放在電磁攪拌器托座上，插入兩電極。開啟電磁攪拌器，調(diào)節(jié)電磁攪拌器轉(zhuǎn)速。

(10)觀察儀器上的電位值，若數(shù)值接近370mv，說明氟電極已清洗好；如果相差甚遠(yuǎn)，應(yīng)重?fù)Q蒸餾水，再洗直至顯示值與370mv電位值相近。

(11)取6個潔凈的小燒杯貼上標(biāo)簽編號，在6個小燒杯中分別用所配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液蕩洗三次后，再倒入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

(12)用蒸餾水清洗干凈電極后，插入盛有含氟為0.0μg/mL的1號溶液的燒杯中，并調(diào)節(jié)電磁攪拌器轉(zhuǎn)速與9相同，待儀器上數(shù)字顯示穩(wěn)定后，停止攪拌，讀取電位值，并記錄。

(13)用超純水清洗電極，直至顯示值與氟電極空白電位值相近。

(14)依次由低濃度到高濃度分別測定各溶液的電位值，并記錄。注意，每次測完都要用超純水清洗電極，直至原空白電位值。

2.2樣品測定與分析

3 結(jié)果與分析

3.1氟離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)已知氟離子濃度的檢測結(jié)果，縱坐標(biāo)為“MV”的絕對值，橫坐標(biāo)為氟離子濃度對數(shù)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程式y(tǒng)=33.53x+238，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。

3.2不同組織中氟離子濃度變化

3.2.1 雌雄家蠶中腸中氟離子濃度變化

從圖2、3可以看到：734雌蠶對照組中腸氟離子濃度在前4d呈上升趨勢，且在第4d達(dá)最大值，第5d氟離子濃度下降；雄蠶對照組前3d呈先降后升的變化趨勢，之后同雌蠶的變化趨勢；雌蠶20mg/kg NaF處理組前3d呈平緩直線型下降，之后同對照組變化趨勢；雄蠶200mg/kg NaF處理組變化規(guī)律同雌蠶對照組變化相似。734雄蠶對照組在整個試驗期氟離子的平均濃度均高于雌蠶，約為雌蠶的1.20倍；200mg/kg NaF處理組的雄蠶中腸氟離子濃度約是雌蠶的1.05倍。雄蠶200mg/kg NaF處理組是對照組的1.67倍，而雌蠶200mg/kg NaF處理組是對照組的1.58倍。

圖1 氟離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖注：CK ♀表示對照組雌蠶，CK ♂表示對照組雄蠶，F(xiàn) ♀表示添氟200mg/kg的雌蠶，F(xiàn) ♂表示添氟200 mg/kg的雄蠶。

圖2 5齡家蠶734幼蟲添食NaF后中腸氟離子濃度變化

圖注：CK ♀表示對照組雌蠶，CK ♂表示對照組雄蠶，F(xiàn) ♀表示添氟200mg/kg的雌蠶，F(xiàn) ♂表示添氟200 mg/kg的雄蠶。

圖3 5齡家蠶T6幼蟲添食NaF后中腸氟離子濃度變化

T6品種中不管是雌蠶還是雄蠶，對照組與200mg/kg NaF處理組的變化規(guī)律基本一致，在前3d呈下降趨勢，在第4d上升達(dá)最大值，第5d呈下降；T6雄蠶對照組氟離子濃度在整個試驗期均高于雌蠶，平均濃度約為雌蠶的1.03倍；200mg/kg NaF處理組的雄蠶中腸氟離子濃度約是雌蠶的1.05倍。雄蠶200mg/kg NaF處理組是對照組的1.22倍，而雌蠶200mg/kg NaF處理組是對照組的1.20倍。不管是氟化物敏感品種734還是耐氟品種T6，不管是添氟處理組還是對照組，均為雄蠶中腸氟離子濃度大于雌蠶的，氟離子濃度隨著添氟濃度增加而增加。

3.2.2 雌雄家蠶頭部組織氟離子濃度變化

從圖4、5可以看到：734品種中不管是雌蠶還是雄蠶，對照組與200mg/kg NaF處理組的變化規(guī)律基本一致，在前3d呈先降后升的趨勢，在第4d上升達(dá)最大值，第5d呈下降。前3d和第5d，不管是雌蠶還是雄蠶，200mg/kg NaF處理組的頭部組織氟離子濃度均高于對照組，在第4d卻是雄蠶頭部對照組大于200mg/kg NaF處理組大于雌蠶200mg/kg NaF處理組大于雌蠶對照組。雄蠶在整個試驗期對照組氟離子的平均濃度均高于雌蠶，約為雌蠶的1.39倍；200mg/kg NaF處理組的雄蠶頭部氟離子濃度約是雌蠶的1.10倍。雄蠶200mg/kg NaF處理組是對照組的1.10倍，而雌蠶200mg/kg NaF處理組是對照組的1.39倍。

圖注：CK ♀表示對照組雌蠶，CK ♂表示對照組雄蠶，F(xiàn) ♀表示添氟200mg/kg的雌蠶，F(xiàn) ♂表示添氟200 mg/kg的雄蠶。

圖4 5齡家蠶734幼蟲添食NaF后頭部氟離子濃度變化

圖注：CK ♀表示對照組雌蠶，CK ♂表示對照組雄蠶，F(xiàn) ♀表示添氟200mg/kg的雌蠶，F(xiàn) ♂表示添氟200 mg/kg的雄蠶。

圖5 5齡家蠶T6幼蟲添食NaF后頭部氟離子濃度變化

T6除200mg/kg NaF處理組的雄蠶在前3d呈先升后降的變化趨勢，其余處理組呈先降后升的趨勢，在第4d上升且達(dá)最大值，在第5d下降，T6對照組和添氟組頭部組織在整個試驗期沒有規(guī)律可循，第4d對照組的氟離子濃度高于添氟組，而在第5d添氟組氟離子濃度又高于對照組。雄蠶對照組在整個試驗期氟離子的平均濃度均高于雌蠶，約為雌蠶的1.08倍；200mg/kg NaF處理組的雄蠶頭部氟離子濃度約是雌蠶的1.03倍。雄蠶200mg/kg NaF處理組是對照組的1.10倍，而雌蠶200mg/kg NaF處理組是對照組的1.03倍。

4 小結(jié)與討論

雌雄個體由于體內(nèi)某些生理生化特性的差異，導(dǎo)致昆蟲對外界不良環(huán)境的抵抗能力產(chǎn)生性別間的差異。對不同家蠶品種添食NaF，檢測5d內(nèi)不同濃度NaF處理后中腸和頭部組織中氟離子濃度。不管是雌蠶還是雄蠶，不管是氟化物敏感品種734還是耐氟品種T6，中腸組織隨著添氟濃度的增加，其氟離子濃度在增加，而頭部組織5d內(nèi)的平均濃度也是在增加，但與中腸組織有差異，在整個試驗期，中腸組織中任意一天均表現(xiàn)為添氟組的氟離子濃度高于對照組，而在頭部組織中卻不一致，有時添氟組的氟離子濃度高于對照組，有時對照組的氟離子濃度高于添氟組。

734、T6不同性別家蠶添食氟化物后，檢測其頭部和中腸中氟離子濃度，均表現(xiàn)出雄蠶中的氟離子濃度大于雌蠶的。同品種不同性別不同濃度之間的氟離子濃度差異分析，在頭部組織中，添食200mg/kg NaF的734雌蠶約是對照組的1.39倍，雄蠶約是1.10倍，T6雌蠶約是對照組的1.03倍，雄蠶約是對照組的1.10倍。由此可見，添氟處理后與對照組相比，734雌蠶頭部累積的相對氟離子濃度高于雄蠶，而T6雄蠶頭部累積的相對氟離子濃度高于雌蠶，說明不同家蠶品種在頭部組織中氟離子濃度累積與雌雄差異有關(guān)。在中腸中，添食200mg/kg NaF的734雌蠶約是對照組的1.58倍，雄蠶約是1.67倍，T6雌蠶約是對照組的1.20倍，雄蠶約是1.22倍。與對照組相比，734、T6雄蠶累積的氟離子濃度高于雌蠶，而734氟離子濃度在雌雄之間的差異大于T6。同品種不同性別同濃度之間的氟離子濃度分析，在頭部組織中，734對照組雄蠶約是雌蠶的1.39倍，添氟組雄蠶約是雌蠶的1.10倍，而T6對照組雄蠶約是雌蠶的1.08倍，添氟組雄蠶約是雌蠶的1.03倍。在中腸中，734對照組雄蠶約是雌蠶的1.20倍，添氟組雄蠶約是雌蠶的1.05倍，而T6對照組雄蠶約是雌蠶的1.03倍，添氟組雄蠶約是雌蠶的1.05倍。從上述數(shù)據(jù)來看，734不同性別家蠶各組織中氟離子濃度受氟化物影響明顯大于T6，且734對照組中雌雄家蠶氟離子濃度差異大于添氟組。

前人研究證明，同一品種雌雄蠶之間有一定的差異，即雄蠶(素蠶)有較雌蠶(花蠶)強的趨勢[10]。從本實驗數(shù)據(jù)來看，同品種同濃度NaF處理后家蠶雄蠶組織中氟離子平均濃度高于雌蠶組織，推測家蠶雌雄性個體中的某些基因或者蛋白，尤其一些解毒酶類或代謝酶類，與氟離子作用的差異較大，致使雌雄個體表現(xiàn)出不同的耐氟性。

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AbsorptionandAccumulationofFluorineIoninMidgutandHeadofFemaleandMaleBombyxmoriAfterFeedingwithFluoride

MI Zhi1,2LIU Li-zhen3XU Shui1ZHU Yong1

(1.CollegeofBiotechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China；2.CollegeofLifeScience,ShanxiDaTongUniversity,Datong,Shanxi037009,China；3.CollegeofChemistry&EnvironmentalEngineering，ShanxiDaTongUniversity，Datong,Shanxi037009,China)

We explored the absorption and accumulation of fluorine ion in the head and the midgut of silkworm (Bombyxmori), using the fluoride-resistant silkworm strain T6 and the fluoride-sensitive strain 734 as the experiment materials. The two silkworm strains were sex discriminated. From the first day of the fifth instar, the silkworm larvae were fed with mulberry leaves soaked in 0 and 200 mg/kg NaF solutions, respectively. Then we examined the fluorine ion concentration in their head and midgut. Results showed that in the midgut, fluorine ion concentration of the control groups of 734 and T6 male silkworm was 1.20 and 1.03 times higher than that of the female silkworm, respectively, and in the NaF-treatment groups of both strains, fluorine ion concentration of the male was 1.05 times higher than that of the female. The fluorine ion concentration of the NaF-treatment 734 male and female silkworm was 1.67 and 1.58 times higher than that of the control group, respectively. The fluorine ion concentration of the NaF-treatment T6 male and female silkworm was 1.22 and 1.20 times higher than that of their respective control groups. In the head, the fluorine ion concentration of the male silkworm of 734 and T6 was 1.39 and 1.08 times higher than that of the female silkworm in the control groups, respectively, and 1.10 and 1.03 times higher than the female in the NaF-treatment group. The fluorine ion concentration of the NaF-treated T6 male and female silkworm was 1.10 and 1.03 times, respectively, higher than that of the control group. In short, the male silkworm had higher fluorine ion concentration in both tissues than the female silkworm.

Bombyxmori; fluoride; head; midgut; fluorine ion

重慶市“十百千萬”優(yōu)質(zhì)蠶繭工程公共項目，高抗氟性家蠶新品種“渝蠶2號”的推廣與示范，山西大同大學(xué)博士科研啟動項目。

米智，男，山西，博士，講師，主要從事家蠶遺傳育種研究。E-mail:mizhi775@126.com

朱勇，教授，博士生導(dǎo)師。Tel：023-68251939，E-mail:zhuy@swu.edu.cn