寧夏鼻咽癌患者組織中EBV與HPV感染的相關(guān)性研究

李 霞,陳曉平,張 玉,魯 丹,馬瑞霞

·臨床研究·

寧夏鼻咽癌患者組織中EBV與HPV感染的相關(guān)性研究

李 霞1,陳曉平2,張 玉1,魯 丹1,馬瑞霞3

目的研究寧夏鼻咽癌患者組織中EB病毒(EBV) 與人乳頭狀瘤病毒(HPV)的感染情況及HPV基因型分布情況。方法收集經(jīng)活檢病理檢查確診的53例鼻咽癌患者石蠟組織樣本，采用核酸分子快速導(dǎo)流雜交基因芯片分型技術(shù)(Hybri Max)和實時熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行EBV定量檢測和37種HPV亞型檢測，并以44例鼻咽部黏膜組織慢性炎癥患者的石蠟組織為對照組。結(jié)果寧夏地區(qū)鼻咽癌與鼻咽部黏膜組織慢性炎癥患者中EBV的總感染陽性率分別為96.22%(51/53)、34.09%(15/44)，EBV在鼻咽癌和對照組表達(dá)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。鼻咽癌組織和鼻咽部黏膜組織慢性炎癥中HPV總感染性陽性率分別為45.2%(24/53)、9%(4/44)，鼻咽癌組中單一類型感染最常見的為HPV 16型45.83%(11/24)，HPV感染總陽性率在鼻咽癌和鼻咽部黏膜組織慢性炎癥組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；EBV和HPV兩種病毒混合感染在鼻咽癌和鼻咽部黏膜組織慢性炎癥患者中總感染率分別為45.3%(24/53)和4.5%(2/44)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論寧夏地區(qū)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展與EBV和HPV感染密切相關(guān)，主要以EBV感染為主，HPV感染亞型中以單一感染HPV 16+型最常見，同時約有50%的鼻咽癌患者存在EBV和HPV混合感染。

鼻咽癌； EB病毒；人乳頭狀瘤病毒；基因分型

鼻咽癌(NPC)是鼻咽部常見的具有地域差異性及種族遺傳傾向特征的上皮組織惡性腫瘤，全世界均有發(fā)病，但發(fā)病率有很大差異。我國南方是世界各地區(qū)中鼻咽癌的最高發(fā)地區(qū)之一，尤以廣東省佛山、廣西省的梧州及福建省為甚[1]。鼻咽癌的具體發(fā)病原因仍不是很清楚，研究認(rèn)為主要與遺傳、EB病毒(EBV)感染、環(huán)境地域性、食咸魚及腌制食品、煙酒及工業(yè)中甲醛密切有關(guān)[2-3]。本研究采用HybriMax技術(shù)和實時熒光定量PCR技術(shù)對53例鼻咽癌和44例鼻咽部黏膜組織慢性炎癥患者石蠟包埋組織標(biāo)本，分別進(jìn)行EBV定量檢測和37種HPV分型檢測，旨在探討鼻咽癌的發(fā)病過程與HPV、EBV感染之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料:入選樣本為經(jīng)病理檢查為鼻咽部石蠟組織包埋標(biāo)本97例，其中鼻咽癌患者53例，男39例，女14例，年 齡24～62歲，中位年齡53.67歲；鼻咽部黏膜組織慢性炎患者44例，男18例，女26例，年齡19～61歲，中位年齡46.95歲。鼻咽癌患者有完整臨床資料、影響學(xué)資料及電子纖維喉鏡報告。根據(jù) WHO 腫瘤組織學(xué)分型(1991)標(biāo)準(zhǔn)，53例鼻咽癌組織中，非角化型鱗細(xì)胞狀癌40例，低分化鱗狀細(xì)胞癌9例，中分化4例。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國腫瘤聯(lián)合會(AJCC)聯(lián)合制定的 TNM 分期法，將鼻咽癌患者分為 T1、 T2、 T3 和T4期，其中T1期8例、T2期7例、T3期14例、T4期24例；N06例、N17例、N233例、N37例、M16例、骨轉(zhuǎn)移5例、肺轉(zhuǎn)移1例。

1.2 研究對象:收集2011-2016年在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院經(jīng)活檢病理檢查確診為鼻咽癌和鼻咽部黏膜組織慢性炎患者的石蠟組織標(biāo)本。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)：有明確鼻咽癌的病理診斷及鼻咽部黏膜組織慢性炎的病理診斷，臨床病理資料完整，沒有經(jīng)過放化療治療的患者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)：有放療或化療病史，伴有其他腫瘤性疾病、自身免疫性疾病及其他性傳播疾病者。

1.5 方法

1.5.1 組織樣本DNA提取:將97例鼻咽癌和鼻咽部鼻咽部黏膜組織慢性炎患者石蠟包埋組織標(biāo)本隨機(jī)排列，無菌操作下切片，厚約3 μm，置入離心管中，常規(guī)脫蠟，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，提取的樣本DNA。

1.5.2 試劑來源和主要儀器：檢測EBV采用的EB病毒核酸定量檢測試劑盒購自凱普生物化學(xué)有限公司；Verti96-well Thermal Cycler PCR 擴(kuò)增儀(Applied Biosystems，美國)。檢測HPV采用的HPV核酸擴(kuò)增分型檢測試劑盒購自凱普生物化學(xué)有限公司；HybriMax HHM-2 HybriMax核酸分子快速雜交儀[食藥管械(準(zhǔn))字2004第2400106號，凱普生物科技有限公司，上海]。

1.5.3 EBV檢測:①樣本DNA提取采用液氮研磨后，按照試劑盒說明書提取標(biāo)本中的DNA。②設(shè)計引物序列及探針序列(包括上游引物、下游引物以及探針序列)、合成、純化。③PCR擴(kuò)增(根據(jù)PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行操作)。反應(yīng)結(jié)束后，用計算機(jī)將樣本和標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算出反應(yīng)體系中待測標(biāo)本中 DNA 的拷貝數(shù)。確定基線和閾值，取3～15個循環(huán)的熒光信號，使閾值線超過正常陰性對照擴(kuò)增曲線(無規(guī)則的噪音線)的最高點，且Ct值為Undet。質(zhì)控對照、陰性對照Ct值均應(yīng)顯示為Undet，陽性對照Ct值≤36。符合以上2個條件，此反應(yīng)為有效。④結(jié)果判定。樣本的Ct值顯示為Undet，判斷為陰性；Ct值≤40，判斷為陽性；若為40

鼻咽部慢性炎癥到鼻咽癌組織EBV拷貝數(shù)逐漸呈遞增趨勢，存在數(shù)量級比較，結(jié)果顯示癌癥組與炎癥組之間EBV拷貝數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

1.5.4 HPV37型檢測:①樣本DNA提取。采用液氮研磨后，按照試劑盒說明書提取標(biāo)本中的DNA。②PCR擴(kuò)增。按照樣本數(shù)量，分別取PCR premix、Taq酶23.25 μl、0.75 μl混勻，按照樣本編號取1 μl DNA加入到PCR混合液中，總反應(yīng)體積為25 μl。按照預(yù)先設(shè)置好的反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時以蒸餾水為陰性對照，進(jìn)行40個循環(huán)。③導(dǎo)流雜交。在導(dǎo)流雜交儀中放入標(biāo)記有HPV 6、11、16、18、26、31、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、66、67、68、69、70、71、72、73、81、82、83、84，共37種寡核苷酸探針的低密度基因芯片，按試劑盒說明書進(jìn)行導(dǎo)流雜交，酶標(biāo)顯色。④結(jié)果判斷。觀察檢測結(jié)果，陽性點呈現(xiàn)藍(lán)紫色圓點，根據(jù)芯片上不同HPV基因型分布相應(yīng)的圓點判斷HPV有無感染及判定亞型。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料組間比較用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽部良惡性組織間EBV感染情況比較：結(jié)果表明，鼻咽癌組織與鼻咽部黏膜組織慢性炎癥中EBV總感染陽性率分別為96.2%(51/53)、34.1%(15/53)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見表1。

表1 鼻咽部良惡性組間EBV感染率的比較[n(%)]

2.2 鼻咽部良惡性組織之間HPV感染情況比較：鼻咽癌組織中HPV總檢出陽性率為45.3%(24/44)，鼻咽部黏膜組織慢性炎癥HPV總檢出陽性率為9.1%(4/44)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 鼻咽部良惡性組間HPV感染率的比較[n(%)]

2.3 鼻咽癌組織中EBV與HPV兩種病毒共同感染情況比較：EBV和HPV兩種病毒混合感染在鼻咽癌和鼻咽部黏膜組織慢性炎癥患者組織中總感染率分別為45.3%(24/53)和4.5%(2/44)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見表3。

表3 鼻咽部良惡性組間EBV和HPV混合感染率的比較[n(%)]

3 討論

EBV的感染是多種淋巴系腫瘤的危險因素，如鼻咽癌、地方性伯基特淋巴瘤、某些類型的霍奇金病、鼻T細(xì)胞淋巴瘤和移植術(shù)后淋巴增生性腫瘤。蔣偉紅[3]等應(yīng)用PCR熒光定量檢測技術(shù)及原位雜交技術(shù)對同一鼻咽癌患者的癌、癌旁及對側(cè)正常黏膜組織三者中的EBV進(jìn)行定量檢測的定位分析，得出癌、癌旁和正常組織間EBV的感染差異有統(tǒng)計學(xué)意義；趙秀麗[4]對唐山市也做了同樣的研究顯示EBV感染分別為100%、72.3%、80%，說明EBV感染的異常信號表達(dá)可能是鼻咽癌的主要致癌環(huán)節(jié)。鼻咽癌具有明顯地域性，在我國南方高發(fā)。寧夏位于西北一少數(shù)民族地區(qū)，是國內(nèi)最大回族聚集地，該地區(qū)獨特的自然環(huán)境、生活環(huán)境以及少數(shù)名族獨特的飲食習(xí)慣差異，其鼻咽癌發(fā)病率較低。該地區(qū)鼻咽癌患者組織類型以低分化鱗癌多見，其EBV的感染陽性率是否與高發(fā)地區(qū)的鼻咽癌患者有所差異，為此本實驗采用熒光定量PCR檢測技術(shù)對寧夏鼻咽癌患者及黏膜慢性炎癥組織EBV定量檢測，結(jié)果顯示其EBV在在癌癥組織中高表達(dá)，提示寧夏鼻咽癌組織與EBV感染亦密切相關(guān)。雖然感染陽性率在EBV與鼻咽癌之間建立因果關(guān)系的證據(jù)不足，但提示EBV可能促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生，該地區(qū)的鼻咽癌與EBV相關(guān)，與相關(guān)研究相一致。同時對該地區(qū)鼻咽癌患者進(jìn)行HPV37型檢測研究發(fā)現(xiàn)，HPV在該地區(qū)鼻咽癌組織中亦高表達(dá)，HPV是一種度嗜黏膜和皮膚的病毒，為雙鏈螺旋DNA結(jié)構(gòu)。近年來研究發(fā)現(xiàn)HPV與頭頸部腫瘤有關(guān)，HPV16、HPV18型是致癌的高危病毒,它們在感染后其基因能整合到宿主染色體中,進(jìn)而表達(dá)出E6、E7等腫瘤蛋白,最終導(dǎo)致上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。其中E6蛋白與p53結(jié)合,阻礙對損傷的修復(fù)，E7蛋白可上調(diào)p16的表達(dá)；與視網(wǎng)膜瘤蛋白pRb結(jié)合使細(xì)胞永生化，兩者共同阻止細(xì)胞正常凋亡[5-6]。本研究顯示寧夏鼻咽癌組織中HPV陽性率高于鼻咽部炎癥組織，以HPV16型高表達(dá)，HPV16已確認(rèn)為癌基因，鼻咽癌患者EBV感染和HPV感染存在混合感染或交叉感染,其明顯高于鼻咽部黏膜慢性組織炎患者。楊帆[7]等研究認(rèn)為中國福建地區(qū)鼻咽癌中人乳頭狀瘤病毒感染率較低,該地區(qū)的鼻咽癌中無HPV和EBV病毒共同感染現(xiàn)象。目前鼻咽癌與HPV的報道不多，由于研究樣本量較小、HPV亞型較多。但研究發(fā)現(xiàn)HPV陽性在鼻咽癌中的生物學(xué)行為特征，鼻咽癌在我國高發(fā)，采用大樣本量并進(jìn)一步探討其發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，為推進(jìn)耳鼻咽喉頭頸外科難治病、易復(fù)發(fā)、危害大的常見病、多發(fā)病的病因?qū)W的再認(rèn)識，從而對完善和豐富病毒致病理論，促進(jìn)學(xué)科發(fā)展及規(guī)范化的診治，指導(dǎo)提高臨床診治效果，探索有效預(yù)防、研發(fā)和應(yīng)用基因疫苗以及減少衛(wèi)生資源浪費等都有重要臨床意義和社會經(jīng)濟(jì)價值。

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ThecorrelationresearchofEBVandHPVinthenasopharyngealcarcinomapatientsinNingxiaregion

LIXia1,CHENXiaoping2,ZHANGYu1,LUDan1,MARuixia3.

1.NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China;2.Departmentofotolaryngology,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,750004,China；3.DepartmentofOtorhinolaryngologyHeadandNeckSurgery,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

Correspondingauthor:CHENGXiaoping,Email:chen_xp@163.com

ObjectiveTo investigate the infection of Epstein-Barr virus infenction (EBV),human papilloma virus(HPV) and HPV genotype of nasopharyngeal carcinoma(NPC) in Ningxia region.Methods53 NPC tissue samples and 44 nasopharyngeal mucosa tissue samples have been collected.We used nucleic acid molecular rapid diversion hybrid gene chip classification technology (HybriMax) and real-time fluorescent quantitative PCR technology for this study.ResultsThe total infection rates of EBV in nasopharyngeal carcinoma and nasopharyngeal mucosa were 96.22%(51/53) and 34.09%(15/44).The expression of EBV infection in nasopharyngeal carcinoma and nasopharyngeal mucosa was significantly different (P<0.05).The total infection rates of HPV in nasopharyngeal carcinoma and nasopharyngeal mucosa were 45.2%(24/53) and 9%(4/44),in which the most common type of infection was HPV16+45.83%(11/24),The positive rate of HPV infection in nasopharyngeal carcinoma and nasopharyngeal mucosa chronic inflammation was statistically significant(P<0.05).The total infection rates of both EBV and HPV infection were 45.3%(24/53) and 4.5%(2/44) in nasopharyngeal and nasopharyngeal mucosal tissues.The expression of both HPV and EBV virus infection in nasopharyngeal carcinoma and nasopharyngeal mucosa were significantly different (P<0.05).ConclusionsThe development of nasopharyngeal carcinoma is closely related to EBV and HPV infection in Ningxia.The most important is EBV infection.There are also a number of HPV infections and HPV16 + type is the most common in HPV infection subtypes.At the same time,about 50% of nasopharyngeal carcinoma patients with EBV and HPV have the mixed infection.

Nasopharyngealcarcinoma;Epstein-Barrvirus;Humanpapillomavirus;Genotype

上海浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點學(xué)科群項目(PWZxq2014-09)

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004 2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院耳鼻喉科，上海 200135 3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，寧夏 銀川 750004

陳曉平，Email:chen_xp@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170814.1453.028.html

10.13621/j.1001-5949.2017.08.0710

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A

2017-02-14 [責(zé)任編輯]王凱榮