果蠅Cullin 5基因dsRNA設(shè)計及RNAi效率檢測

何倩毓，張原熙，劉勝軍，孫蕊，張瑩

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.大慶市環(huán)保局環(huán)境監(jiān)測中心站）

果蠅Cullin 5基因dsRNA設(shè)計及RNAi效率檢測

何倩毓1，張原熙2，劉勝軍1，孫蕊1，張瑩1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.大慶市環(huán)保局環(huán)境監(jiān)測中心站）

Cullin 5作為Cullin蛋白家族的一員對調(diào)控細胞內(nèi)蛋白降解有著重要意義。為便于深入研究果蠅中Cullin 5基因的功能，對Cullin 5基因的5’UTR區(qū)域進行dsRNA設(shè)計，并通過PCR和體外轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的dsRNA。利用RNA干擾以及Realtime PCR檢測得到該dsRNA的RNAi效率。結(jié)果表明設(shè)計及合成的Cullin 5基因的dsRNA可顯著降低Cullin 5的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.01），與對照組相比較，其mRNA水平下降至27%，表明該dsRNA具有RNA干擾效果。該實驗將為今后研究果蠅Cullin 5基因的功能提供一定的技術(shù)支持。

黑腹果蠅；Cullin 5；dsRNA；RNA干擾；Real-time PCR

細胞內(nèi)外的大多數(shù)蛋白質(zhì)在生物體生長發(fā)育的過程中處于不斷更新的狀態(tài)，即不斷地被降解和被新合成的蛋白質(zhì)取代。蛋白的降解在細胞的生理活動中發(fā)揮著不可替代的作用，一旦其發(fā)生異常將導(dǎo)致許多疾病，如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等。細胞內(nèi)蛋白的降解主要通過兩個途徑，即細胞自噬（Autophagy）和泛素蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin proteasome system，UPS）。其中UPS負責特異性地降解大多數(shù)細胞內(nèi)蛋白，它是一種高效的蛋白降解途徑，其生物學(xué)作用非常廣泛。UPS通過降解生物體內(nèi)的關(guān)鍵蛋白可以精細調(diào)控著細胞中的許多信號通路和生理過程，如DNA復(fù)制、細胞周期、DNA損傷修復(fù)、腫瘤抑制、生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等[1-2]。

UPS特異性降解蛋白過程中起決定性作用的是E3泛素連接酶。由Cullin蛋白組成的Cullin-Ring Ligase（CRL）所調(diào)控的降解事件，在其中占有相當大的比例。CRL復(fù)合體是由含RING結(jié)構(gòu)域的催化亞基（如ROC1、ROC2）、Cullin骨架蛋白、接頭蛋白（如SKP1，ElongB/C，DDB1等）以及底物識別亞基（如F box，DCAF等）這四個部分組成。CRL復(fù)合體中所包含的Cullin骨架蛋白的不同決定了構(gòu)成CRL的RING亞基、接頭蛋白以及底物識別亞基的不同及特定的功能。在人類基因組中共存在7種Cullin蛋白，分別是Cullin 1、Cullin 2、Cullin 3、Cullin 4A、Cullin 4B、Cullin 5及Cullin 7[3-4]。已有研究表明Cullin 5與神經(jīng)突觸的形成以及卵細胞的發(fā)生有關(guān)[5-6]，而且這種功能可能是通過激活MPK-1的信號通路來完成的。此外研究發(fā)現(xiàn)，Cullin 5與分子伴侶Hsp90的底物蛋白的活性密切相關(guān)，Cullin 5可通過在分子水平和細胞水平上調(diào)控Hsp90抑制劑誘導(dǎo)的癌基因的降解及生物活性的喪失[7-8]。為了深入探尋Cullin 5的生理功能及具體的調(diào)控機制，研究擬在果蠅這一模式昆蟲中針對果蠅基因組中的Cullin 5基因設(shè)計及合成dsRNA，研究將為下一步闡明Cullin 5的功能提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用果蠅Kc細胞由東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院鄒傳山老師實驗室提供。使用添加5%胎牛血清（Fetal bovine serum，South American Origin，Hyclone）的Schneider果蠅細胞培養(yǎng)基（Schneider’s Drosophila Medium 1X，liquid，Gibco，Invritogen），在27℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞密度達到106mL-1時，以1∶5的比例轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑

T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（由普洛麥格生物技術(shù)有限公司提供）；Real-time PCR試劑盒（由寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司提供）；其余試劑為實驗室常規(guī)所備試劑。

1.3 dsRNA設(shè)計及引物合成

根據(jù)Flybase上發(fā)布的Cullin 5基因信息（Flybase ID：FBgn0039632）設(shè)計dsRNA。dsRNA設(shè)計的原則：dsRNA長度在500 bp左右，且通過BLAST比對不能與果蠅基因組中其他基因有超過19 bp的同源性。根據(jù)確定的dsRNA合成區(qū)域的核苷酸序列，采用Primer Premier 5.0.軟件設(shè)計Cullin 5的PCR引物以及對照基因EGFP的PCR引物，并在每一對引物的5’末端加上T7啟動子序列GGATCCTAATACGACTCACTATAGG，作為最終PCR擴增引物。具體引物序列見表1。引物合成委托上海生工公司完成。

表1 dsRNA合成引物序列及擴增產(chǎn)物大小Table 1Primers used for dsRNA synthesis and the size of the dsRNAs

1.4 雙鏈DNA的擴增

采用Trizol法提取果蠅Kc細胞的RNA，并利用M-MLV酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA[9]。分別以果蠅Kc細胞的cDNA以及pEGFP-N1質(zhì)粒為模板，表1中的引物進行Cullin 5、EGFP雙鏈DNA的PCR擴增。擴增產(chǎn)物凝膠分析后進行膠回收，并測序鑒定。鑒定成功后，每個基因的多管PCR膠回收產(chǎn)物進行濃縮使其濃度達到合成dsRNA的要求。濃縮方法：將多管PCR膠回收產(chǎn)物合并一管后，加入0.1倍體積3 M醋酸鈉（pH=5.2）和1倍體積的異丙醇，混勻，置于冰上5 min后，4℃12 000 rpm離心30 min，棄上清，加500 μL預(yù)冷的75%乙醇，4℃12 000 rpm離心10 min，棄上清干燥5 min后加30 μL無RNA酶污染的水溶解，-20℃保存待用。

1.5 dsRNA的合成

以濃縮后的雙鏈DNA為模板，采用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒分別合成Cullin 5和EGFP的dsRNA，具體步驟按說明書操作并根據(jù)實際情況進行微調(diào)。

1.6 RNAi干擾實驗

向12孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)以2×105密度接種果蠅的Kc細胞，12 h后，分別加入實驗組Cullin 5和對照組EGFP的dsRNA，每組dsRNA的加入量均為5 μg/mL，每組三個實驗重復(fù)，孵育48 h后，收集細胞。

1.7 Real-time PCR檢測RNAi效率

分別收集各dsRNA處理的Kc細胞，提取RNA后并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋10倍后采用TOYOBO的SYBRGreen Realtime Master Mix（TOYOBO，Cat. OPK-201）進行Real-time PCR。以果蠅rp49作為內(nèi)參基因，采用2-△△ct法分析目的基因的相對表達水平，每個樣品重復(fù)進行三次，取各組數(shù)據(jù)的平均值和標準誤，并將實驗結(jié)果繪制成柱形圖。表2為Realtime PCR涉及到的引物。

1.8 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果采用SPSS 16.0“Independent Samples T-Test”分析?！?”表示P＜0.05；“**”表示P＜0.01。

表2 Real-time PCR引物序列及擴增產(chǎn)物大小Table 2Primers used for Real-time PCR and the size of the products

2 結(jié)果

2.1 雙鏈DNA擴增結(jié)果

分別以果蠅Kc細胞的cDNA以及pEGFP-N1質(zhì)粒為模板，利用表1引物進行PCR擴增，合成雙鏈DNA。經(jīng)電泳檢測獲得目的大小的特異性條帶（圖1）。膠回收產(chǎn)物測序后BLAST比對確認為目的片段。

圖1 Cullin 5基因以及EGFP基因dsRNA區(qū)域?qū)?yīng)的DNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1The electrophoresis result of DNAs corresponding to the dsRNA regions of Cullin 5 and EGFP

2.2 dsRNA合成結(jié)果

以濃縮后的雙鏈DNA為模板，利用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒分別合成EGFP-dsRNA以及Cullin 5-dsRNA，合成后的dsRNA稀釋100倍進行瓊脂糖凝膠電泳。通過凝膠成像系統(tǒng)分析得到如圖2所示的特異的、與目的大小一致的單一條帶。

2.3 Cullin 5基因dsRNA的RNAi效率檢測及分析

為分析合成的Cullin 5-dsRNA是否有效，將dsRNA轉(zhuǎn)入Kc細胞中，孵育48 h后收集細胞，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA后利用Real-time PCR檢測Cullin 5基因的表達。實驗結(jié)果表明Cullin 5-dsRNA處理的Kc細胞中Cullin 5基因的表達顯著下降（P＜0.01），與EGFP-dsRNA處理組相比較，其mRNA水平下降至27%（圖3）。

3 討論

作為E3泛素連接酶家族中的一員，Cullin 5最早在人胚胎腎細胞293T中被發(fā)現(xiàn)參與Hsp90抑制劑格爾德霉素誘導(dǎo)的ERBB2的降解[7]。近期研究發(fā)現(xiàn)除調(diào)控ERBB2的降解，Cullin 5還參與調(diào)控眾多蛋白激酶的泛素化及降解，如BRAFV600E，AKT以及CDK4等[8]。Cullin 5主要是通過結(jié)合Elongin B/C以及SOCSbox來識別特異性底物，完成泛素從E2到底物之間的傳遞過程。人類基因組中存在大約30個SOCS蛋白，那么在Cullin 5降解不同的底物過程中如何選擇性結(jié)合特異的SOCS蛋白來發(fā)揮其功能目前尚不清楚。到目前為止只有少數(shù)幾個的SOCS蛋白的功能被鑒定。有報道發(fā)現(xiàn)，Cullin 5和HIV蛋白病毒體感染因子Vif（HIV protein virion infectivity factor，一種SOCSbox蛋白）能夠形成CRL5 E3連接酶，這種E3連接酶可以特異的介導(dǎo)人的抗病毒蛋白APOBEC3G的降解[10]。

圖2 Cullin 5基因以及EGFP基因dsRNA電泳結(jié)果Fig.2The electrophoresis result of dsRNAs targeted to Cullin 5 and EGFP

圖3 Cullin 5 RNAi效率檢測Fig.3Detection of the RNAi effeciency of Cullin 5

到目前為止，Cullin 5的功能研究較少，尚無人建立相關(guān)的Cullin 5小鼠模型體系進行研究，僅在秀麗線蟲及果蠅等模式生物中發(fā)現(xiàn)Cullin 5與神經(jīng)突觸的形成以及卵細胞的發(fā)生有關(guān)[5-6]。為了便于今后有效地研究Cullin 5的功能，實驗利用果蠅這一模式生物，針對果蠅基因組中的Cullin 5基因設(shè)計合適的RNA干擾區(qū)域，并利用細胞RNAi技術(shù)和Real-time PCR方法檢測干擾效率，結(jié)果顯示所設(shè)計及合成的Cullin 5-dsRNA可使果蠅Kc細胞中Cullin 5的轉(zhuǎn)錄水平下降至對照組的27%。研究成果將為日后進一步研究Cullin 5的功能提供了強有力的技術(shù)保障。

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Design of dsRNA Regions for Drosophila Cullin 5 Gene and Detection of the RNAi Efficiency

He Qianyu1，Zhang Yuanxi2，Liu Shengjun1，Sun Rui1，Zhang Ying1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Environmental Monitoring Center Station，Daqing Environmental Protection Agency）

As one of the members of Cullin proteins family，Cullin 5 played an important role in regulation of protein degradation.To facilitate the further studies on the function ofCullin5 inDrosophila，dsRNA targeted to the 5’UTR region of Cullin 5 was designed，and synthesized by PCR and the in vitro transcription methods.Then the RNAi efficiency was detected through RNAi and Real-time PCR.The results showed that the transcriptional level ofCullin 5was reduced significantly by the dsRNA ofCullin 5synthesized in this study（P＜0.01），and the mRNA level decreased to 27%compared to that in the control group.This study could provide strong technical support for the study on function ofCullin 5inDrosophilain the future.

Drosophila melanogaster；Cullin 5；double strand RNA；RNA interference；real-time PCR

TS214.9

A

1002-2090（2017）04-0037-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.009

2017-01-12

黑龍江省自然科學(xué)基金項目（C2016040）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)成、引進人才科研啟動項目（XYB2015-07）。

何倩毓（1986-），女，講師，中科院上海生命科學(xué)研究院畢業(yè)，現(xiàn)主要從事動物遺傳育種方面的研究工作。