肺癌組織標(biāo)本庫(kù)的創(chuàng)建與管理

劉得水，岳麗玲，陳德慶，李祖彬，鮑紅光，溫憲春，劉吉成

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161005；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161000；4.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161000

肺癌組織標(biāo)本庫(kù)的創(chuàng)建與管理

劉得水1，岳麗玲1，陳德慶2，李祖彬3，鮑紅光4，溫憲春1，劉吉成1

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161005；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161000；4.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161000

目的探索肺癌組織標(biāo)本庫(kù)的創(chuàng)建和管理措施。方法收集肺癌組織腫瘤、癌旁和切緣遠(yuǎn)端非腫瘤組織和血液標(biāo)本，采用統(tǒng)一的采集和標(biāo)本管理辦法，建立肺癌標(biāo)本庫(kù)。結(jié)果截至2017年1月，該組織標(biāo)本庫(kù)共收集肺癌組織標(biāo)本307例，男性209例，女性98例，右側(cè)171例，左側(cè)136例，其中腺癌119例，鱗癌103例，小細(xì)胞癌77例，腺鱗癌8例，其中全套標(biāo)本219例，經(jīng)科學(xué)管理經(jīng)6個(gè)月存放后，全血和血清存放符合率較高，與存放前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血漿和淋巴細(xì)胞存6個(gè)月后存放差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論肺癌組織標(biāo)本庫(kù)的創(chuàng)建及系統(tǒng)化管理有助于為肺癌的基礎(chǔ)研究和臨床研究提供保障。

肺癌；標(biāo)本庫(kù)；創(chuàng)建；管理

肺癌是目前危害我國(guó)人民生命和健康的最大威脅的惡性腫瘤，肺癌已經(jīng)成為我國(guó)排名首位的惡性腫瘤，其死亡率超過惡性腫瘤死亡率的20%，每年新增病例超過50萬，預(yù)計(jì)未來我國(guó)將成為肺癌第一大國(guó)[1]。因此，目前大量的肺癌研究集中于臨床病例分析、血液學(xué)分析和組織病理學(xué)分析，不合理的采集和保存管理措施都極大地影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果[2]。因此，建立合理的數(shù)據(jù)庫(kù)和組織標(biāo)本庫(kù)的建立，有利于整合各方面資源，能夠?yàn)榉伟┑难芯刻峁┘皶r(shí)、快速、準(zhǔn)確和高效的組織標(biāo)本[3]。該研究針對(duì)肺癌組織標(biāo)本庫(kù)和數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行建立，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年1月—2016年6月就診于齊齊醫(yī)學(xué)院三所附屬醫(yī)院以及齊齊哈爾市第一醫(yī)院的肺癌病例資料。患者的納入標(biāo)準(zhǔn)為：①經(jīng)病理學(xué)診斷，確診為肺癌的患者；②經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，確診為肺癌的患者；③所有患者均符合知情同意原則，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)生多發(fā)腫瘤；②腫瘤發(fā)病灶不能明確是來源于肺腫瘤；③其他器官腫瘤轉(zhuǎn)移至肺部者。該研究經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，同意進(jìn)行該次研究。

1.2 主要設(shè)備

電子天平；普通臺(tái)式低速離心機(jī)，-80℃冰箱，-150℃超低溫冰箱，恒溫水浴箱，低溫高速離心機(jī)，臺(tái)式電腦；數(shù)碼相機(jī)等辦公器材與設(shè)備。

1.3 標(biāo)本的收集

1.3.1 組織標(biāo)本的收集 組織標(biāo)本選取者均經(jīng)培訓(xùn)合格的臨床醫(yī)生完成，腫瘤組織離體后，按照腫瘤、癌旁和切緣遠(yuǎn)端非腫瘤組織3部分取材，每部分取材至少1塊組織，并且組織大小直徑不小于0.5 cm，在組織離體的30 min內(nèi)，經(jīng)液氮處理30 min后，切取小塊用石蠟包埋，分類存放于-80℃超低溫冰箱中儲(chǔ)存。

1.3.2 血液標(biāo)本的收集 采血前先核對(duì)患者信息，記錄臨床數(shù)據(jù)庫(kù)，選取肘窩采血部位進(jìn)行常規(guī)采血。取不添加抗凝劑真空采血管收集靜脈血和添加EDTA抗凝劑真空采血管收集靜脈血10 mL，每份5 mL。血液標(biāo)本依據(jù)患者個(gè)人信息，二維碼打印機(jī)標(biāo)記，存放于-80℃超低溫冰箱儲(chǔ)存。

1.4 血清及血細(xì)胞標(biāo)本的保存

1.4.1血清標(biāo)本的保存 收集不加抗凝劑的血液標(biāo)本5 mL，室溫條件下放置3 h左右，采用普通臺(tái)式低速離心機(jī)離心10 min（2 000 r/min），所得血清標(biāo)本分為6份保存于200 uL凍存管中，打印二維碼放置于-80℃超低溫冰箱儲(chǔ)存。

1.4.2 血漿、淋巴細(xì)胞的保存 收集經(jīng)EDTA抗凝劑真空采血管中的血液標(biāo)本5 mL，采用普通臺(tái)式低速離心機(jī)離心10 min（2 000 r/min），所得血漿標(biāo)本分為6份保存于200 uL凍存管中，打印二維碼放置于-80℃超低溫冰箱儲(chǔ)存。將抗凝劑血漿后剩余血液采用0.01 g/L的PBS溶液稀釋2倍后混勻，取等量淋巴細(xì)胞分離液平均分配至15 mL離心管中，將稀釋血樣輕放置分離液上離心20 min（1 500 r/min），收集第二層細(xì)胞加入 0.01 g/L的PBS溶液5 mL的離心管中離心10 min（1 500 r/min），去上清液，再加0.01 g/L的PBS沖洗數(shù)次后離心10 min（1 500 r/min）后去上清液，最終沉淀物為淋巴細(xì)胞。取DMSO、1 640培養(yǎng)液、小牛血清比例為1:4:5配置成凍存液，將淋巴細(xì)胞放置于凍存液（3 mL）中，分4份分裝，每支0.8 mL[4]。經(jīng)二維碼打印粘貼，放入-4℃0.5 h，再放入-20℃2 h，最后放入-80℃低溫保存。

1.5 組織標(biāo)本與血液標(biāo)本的質(zhì)量控制與管理

1.5.1 組織標(biāo)本的質(zhì)量控制與管理 所有標(biāo)本均經(jīng)過病例技術(shù)人員檢查，符合腫瘤組織、癌旁組織和切緣遠(yuǎn)端非腫瘤組織的組織要求，離體時(shí)間控制在30 min之內(nèi)，轉(zhuǎn)運(yùn)期間符合病理轉(zhuǎn)運(yùn)要求，轉(zhuǎn)運(yùn)過程中單獨(dú)存放3種組織，避免相互污染[5]。

1.5.2 血液標(biāo)本的質(zhì)量控制與管理 同一患者血液標(biāo)本放入同一EP管盒中依據(jù)二維碼記錄。將兩份血液標(biāo)本分別放置于兩臺(tái)-80℃超低溫冰箱儲(chǔ)存，避免因冰箱故障導(dǎo)致血液標(biāo)本的損壞。全血標(biāo)本進(jìn)行肉眼觀察其顏色和外露情況。血清標(biāo)本入庫(kù)6個(gè)月采用電化學(xué)發(fā)光法對(duì)腫瘤標(biāo)記物CEA進(jìn)行檢測(cè)，觀察其變化情況，確保血清標(biāo)本的存儲(chǔ)質(zhì)量，淋巴細(xì)胞在入庫(kù)時(shí)進(jìn)行染色，計(jì)算存活率，在入庫(kù)后6個(gè)月再次染色，計(jì)算存活率，檢測(cè)淋巴細(xì)胞保存情況。

2 結(jié)果

2.1 組織標(biāo)本采集情況

截至2017年1月，該組織標(biāo)本庫(kù)共收集肺癌組織標(biāo)本307例，男性209例，女性98例，右側(cè)171例，左側(cè)136例，其中腺癌119例，鱗癌103例，小細(xì)胞癌77例，腺鱗癌8例，其中全套標(biāo)本219例（含所有組織標(biāo)本和血液標(biāo)本），占89.58%。詳見表1

表1肺癌組織標(biāo)本庫(kù)構(gòu)成

2.2 血液標(biāo)本采集情況

經(jīng)6個(gè)月存放后，全血和血清存放符合率較高，與存放前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血漿和淋巴細(xì)胞存放6個(gè)月后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但經(jīng)CEA檢測(cè)，入庫(kù)前CEA（13.04±0.143），和 6 個(gè)月后 CEA（13.56±0.240）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.995，P=0.573），血清標(biāo)本在存放6個(gè)月后質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在淋巴細(xì)胞存活率方面，6個(gè)月后平均存活率均大約90%，符合細(xì)胞存放生存標(biāo)準(zhǔn)。

表2肺癌數(shù)據(jù)庫(kù)血液標(biāo)本有效6個(gè)月后合格情況

3 討論

隨著臨床醫(yī)學(xué)、病理學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，針對(duì)腫瘤組織分析和血液樣本的分析已經(jīng)成為腫瘤基礎(chǔ)研究、臨床診斷和療效評(píng)估的重點(diǎn)領(lǐng)域。腫瘤標(biāo)本庫(kù)的建立能夠?qū)λ醒芯刻峁┏渥愕臉?biāo)本資源和信息提供[6]。以往數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，優(yōu)于缺乏系統(tǒng)化管理，僅僅低溫保存，沒有對(duì)血細(xì)胞及腫瘤組織標(biāo)本成分進(jìn)行檢測(cè)，缺乏了科研的前瞻性，也在一定程度上造成了科研的損失[7]。

該次研究，針對(duì)肺癌組織標(biāo)本進(jìn)行采集，嚴(yán)格的按照采集標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作，規(guī)范了信息的全面性，基礎(chǔ)信息采集做能夠幫助腫瘤臨床工作的流行病學(xué)采集，信息全面準(zhǔn)確，標(biāo)本采集經(jīng)過前期質(zhì)量控制，保障了3個(gè)部分組織標(biāo)本的質(zhì)量。建立了規(guī)范的血液標(biāo)本庫(kù)，在采血，保存和使用過程進(jìn)行規(guī)范化管理，嚴(yán)格遵循了科學(xué)的管理模式。該次研究顯示，經(jīng)6個(gè)月存放后，全血和血清存放符合率較高，保障了血液的存放質(zhì)量，這也得益于嚴(yán)格控制標(biāo)本離體時(shí)間和嚴(yán)格的管理措施。

綜上所述，肺癌組織標(biāo)本庫(kù)已經(jīng)初步建立，通過全面的，科學(xué)化和系統(tǒng)化的管理，保障了組織和血液標(biāo)本的質(zhì)量，為肺癌的科學(xué)研究提供了物質(zhì)保障。

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R73

A

1672-5654（2017）08（b）-0105-02

2017-05-08）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.23.105

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81202084）；齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（No.SFGG-201201）。

劉得水（1981-），男，遼寧撫順人，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向：腫瘤基礎(chǔ)研究。

劉吉成（1958-），男，黑龍江勃利人，博士，教授，研究方向：腫瘤發(fā)病機(jī)制研究，E-mail：qqybliu@126.com。