廣玉蘭花精油的化學成分、抗氧化及抑菌活性分析

葉生梅 孫俊峰 龐寬壯 張榮莉

(安徽工程大學生物與化學工程學院，蕪湖 241000)

廣玉蘭花精油的化學成分、抗氧化及抑菌活性分析

葉生梅 孫俊峰 龐寬壯 張榮莉

(安徽工程大學生物與化學工程學院，蕪湖 241000)

用乙醚為溶劑索氏提取廣玉蘭花精油。氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC-MS)分離并分析鑒定廣玉蘭花精油成分及相對含量；鑒定出43個化合物，占精油總量的95.49%。DPPH自由基清除法測定精油的抗氧化活性；廣玉蘭精油有很強的清除DPPH自由基的能力，當質量濃度達到20 μg/mL時，去除率與抗壞血酸相當。抑菌圈法和平板菌落生長法測定精油的抑菌抗菌活性；廣玉蘭花精油對細菌、真菌均有抑制作用，特別是對紅酵母有強的抑制作用，當培養(yǎng)基中精油質量濃度為5.00 mg/mL時能完全抑制培養(yǎng)基中的紅酵母生長。廣玉蘭花精油用于食品工業(yè)不僅可作香料還具有食品防腐保鮮效果，具有一定的開發(fā)和利用價值。

廣玉蘭 精油 化學成分 抗氧化活性 抗菌活性

植物精油又稱揮發(fā)油或香精油,取自于植物的花、苞、葉、枝、根、樹皮、果實、種子和樹脂等,因其萃取自天然植物,自古以來被人們所喜愛，也日益受到國內外專家學者的關注,一方面是因為精油有令人愉悅的香氣；另一方面是由于精油具有多種活性功能，如抗氧化、抗菌、安神鎮(zhèn)痛等。從植物中尋找高效低毒的天然抗氧化物質將成為目前抗氧化劑發(fā)展的一個必然趨勢，植物精油的抗氧化活性國內外的研究報道比較多[1-4]。在農業(yè)領域,植物精油也得到越來越廣泛的研究,其對農業(yè)害蟲、植物病原菌表現(xiàn)出的生物活性引起了科研工作者的注意[5-8]。近年來,植物精油對動物致病真菌和細菌的殺菌活性得到了廣泛的研究。許多植物精油殺菌譜廣,對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、病原真菌等均有一定的殺菌活性[9-11]。植物精油的殺菌廣譜性以及強殺菌活性使其能夠開發(fā)成為消毒殺菌藥劑。 目前,植物精油在香料工業(yè)、醫(yī)療、農業(yè)等方面均得到了一定的應用和發(fā)展。我國野生與栽培的芳香植物就有56科,136屬,約300種。我國豐富的植物資源為精油的開發(fā)利用提供了有利條件。雖然，精油在植物界分布很廣，但是植物精油是植物的次生代謝產物，化學成分較為復雜,植物精油往往含有十多種至上百種化合物。尋找高活性的精油資源，精油中高效生理活性成分的鑒定與研究、將精油開發(fā)成為農藥、抗氧化劑、藥物等還有待研究[12-14]。

廣玉蘭(MagnoliagrandifloraL.)為木蘭科、木蘭屬常綠喬木,又稱洋玉蘭、荷花玉蘭。葉革質，葉長10～20 cm；花大如荷，呈現(xiàn)白色或淺黃色，芳香馥郁，花通常6瓣，直徑20～30 cm，花期5～7月；種子外皮紅色，9～10月果熟。廣玉蘭還對二氧化硫等有毒氣體有較強的抗性，病蟲害少，是凈化空氣、保護環(huán)境的優(yōu)良環(huán)保樹種。廣玉蘭葉及花中含有揮發(fā)油、木蘭花堿等多種化學成分，可治療嘔吐、腹瀉、高血壓、偏頭疼等，在醫(yī)藥方面的應用已有報道[5,15-17]，但對廣玉蘭花香精油的化學成分分析及其抗菌、抗氧化活性研究報道較少。本研究采用乙醚索氏提取廣玉蘭花香精油，用GC-MS聯(lián)用儀對其化學組成進行分析,并進一步考察香精油的抗氧化活性和抗菌性能，擬為合理利用廣玉蘭資源提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

廣玉蘭花2015年6月初采摘于安徽工程大學校園。無水乙醚、無水乙醇、無水硫酸鈉、抗壞血酸(均為分析純)：國藥集團化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基：美國Sigma 公司。

大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、紅酵母 (Rhodotorula)、黑曲霉 (Aspergillusniger)、根霉(Rhizopussp)：本校微生物實驗室保存。

GCMS-QP2010氣相色譜-質譜聯(lián)用儀：日本島津公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；PYX-DHS型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療設備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 廣玉蘭花精油的提取及化學成分分析

采摘的廣玉蘭花(整朵花)于烘箱60 ℃干燥后，萬能粉碎機粉碎用于精油提取的原料；無水乙醚索氏提取，虹吸4次；蒸餾回收乙醚后，加入無水乙醇-20 ℃放置24 h過濾，濾液蒸餾回收乙醇，得精油。對精油進行GC-MS分析、抑菌試驗和抗氧化試驗。

1.2.1.1 色譜條件

色譜柱：Rtx-5 MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；載氣為氦氣；進樣口溫度250 ℃，分流比1∶20；進樣量1 μL,柱流量1.3 mL/min升溫程序：60 ℃保持1 min,11 ℃/min升溫至90 ℃，保持2 min, 2 ℃/min升溫至95 ℃保持1 min，18 ℃/min升溫至180 ℃保持2 min，2 ℃/min升溫至185 ℃保持1 min，13 ℃/min升溫至255 ℃保持2min，2 ℃/min升溫至270 ℃保持1 min。

1.2.1.2 質譜條件

質譜參數(shù)：電子轟擊(EI)離子源70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度270 ℃；掃描范圍m/z30.00～500.00；延遲時間3 min；程序時間35.33 min。

1.2.1.3 數(shù)據處理

化合物的相對含量采用峰面積歸一法計算；根據NIST08和NIST08s譜庫檢索，并與標準譜圖對照解析對化合物進行定性分析。

1.2.2 精油對有機自由基DPPH抑制率的測定

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機自由基，其乙醇溶液呈紫紅色，在可見光區(qū)的最大吸收峰525 nm，當存在自由基清除劑時可與其單電子配對而使其褪色，褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關系，因而可用分光光度法測定精油對DPPH自由基的抑制率來評價其抗氧化性能[4,18]。用二倍稀釋法將精油稀釋成不同濃度，將2.00 mL樣品液及2.00 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液加入到同一試管中，搖勻，室溫下暗處靜置30 min后測定525 nm吸光度A,同時測定2.00 mL DPPH與2.00 mL溶劑(無水乙醇或蒸餾水)混合后的吸光度A0；以相同濃度的抗壞血酸為對照，用同樣方法測定抗壞血酸對DPPH的清除率。

自由基清除率=(A0-A)/A0×100%

1.2.3 玉蘭花精油抗細菌活性測定

1.2.3.1 菌種培養(yǎng)：大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌經斜面活化后分別轉接一環(huán)入LB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)12 h,用于精油抑菌活性測定菌種。

1.2.3.2 瓊脂擴散法測定抑菌圈直徑：取液體菌種0.2 mL于LB平板上，涂布均勻后將滅菌后烘干的直徑5 mm的圓形濾紙片2張疊放在平板上，在濾紙片上滴加10 μL的用1,3丙二醇二倍稀釋法稀釋的精油(0.22 μm微孔濾膜過濾除菌)，以1,3丙二醇為對照。37 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。每種菌每個精油濃度重復3次。

抑菌圈直徑=樣品抑菌圈直徑-對照抑菌圈直徑。

1.2.4 玉蘭花精油抗真菌活性測定

1.2.4.1 紅酵母懸液及黑曲霉、根霉孢子懸液的制備

將活化的紅酵母斜面菌種轉入生理鹽水中制成菌懸液，調整菌濃度105～166cfu/mL。將黑曲霉，根霉斜面孢子用無菌生理鹽水刮下，用4層無菌擦鏡紙過濾制成孢子懸液，并調整孢子濃度105～166cfu/mL。

1.2.4.2 瓊脂稀釋法測定抑菌活性

將精油(0.22 μm微孔濾膜過濾除菌)及菌液加入到冷卻至約50 ℃的15.0 mL PDA培養(yǎng)基中(PDA培養(yǎng)基中加入了0.5% Tween 20起乳化精油作用)，混勻到平皿，使平板中精油的終質量濃度5.00、2.50、1.25、0.63、0.00 mg/mL每個濃度重復3次。30 ℃培養(yǎng)一定時間，記錄菌落數(shù)及菌絲生長情況。

2 結果與分析

2.1 廣玉蘭花精油的化學成分

廣玉蘭花以乙醚為溶劑索氏提取的精油得率為1.98%。香精油的GC-MS測定總離子流圖見圖1，從精油樣品中共分離出74個峰?？傠x子流圖中各峰經質譜掃描后得到質譜圖，根據比對結果進一步進行人工圖譜解析鑒定出43個化合物，占精油總量的95.49%，見表1。

圖1 廣玉蘭花精油的總離子流圖

由表1可知,采用GC-MS分析技術共鑒定出廣玉蘭花香精油中主要成分為丁香烯(37.94%)、芳樟醇(11.06%)、香茅醇(9.94%)、桉葉油醇(3.95%)、2-甲基丁酸甲酯(3.86%)、β-欖香烯(3.02%)、β-蒎烯(2.67%)、α-古蕓烯(2.55%)、甲基丁香油酚(2.19%)、匙葉桉葉烯醇(1.66%)、氧化芳樟醇(1.47%)、檸檬醛(1.40%)、愈創(chuàng)木烯(1.38%)等。本法提取的廣玉蘭花精油馥郁芳香，令人愉悅，與其含有的萜類化合物、萜醇類化合物、萜酯類衍生物、倍半萜化合物、倍半萜含氧衍生物等賦香成分有關。如丁香烯(37.94%)具有辛香、木香、柑橘香、樟腦香，溫和的丁香香氣；芳樟醇(11.06%)具有濃青帶甜的似玫瑰木香氣，柔和果香氣息；2-甲基丁酸甲酯(3.86%)，具有醚香、果香、青香，在極低濃度下有甜的蘋果樣味道，成熟水果的香氣。甲基丁香油酚(2.19%)有清甜的丁香-茴香辛香氣，似香石竹氣息，香氣較透發(fā)而持久；氧化芳樟醇(1.47%)具強的花香、萜香、青香氣，還帶有清涼氣息，是一種多香韻的香料；檸檬醛(1.40%)檸檬醛具有檸檬芳香味。本試驗用乙醚提取后用乙醇純化的提取物在常溫下為淡黃色膏狀，而不是油狀。從成分可見與其含有酯類、酸類、高級醇類有關，與Li等[13]的報道有一定的差別,這可能是采收時間、地點以及提取方法不同等因素所致。

表1 廣玉蘭花精油的化學成分

2.2 精油對有機自由基DPPH抑制率

以分析純的抗壞血酸為對照，測定了廣玉蘭精油和抗壞血酸對有機自由基DPPH的清除率，結果如圖2所示。從圖2可看出，廣玉蘭精油有很強的清除自由基的能力，當質量濃度達到20 μg/mL時，去除率與抗壞血酸相當。Viuda-Martos等[1]、唐暉慧等[6]研究表明含有單萜氧化物或倍半萜的精油一般都有較好的抗氧化活性。廣玉蘭精油中(見表1)含有較豐富的萜類氧化物和萜類化合物如芳樟醇(11.06%)，香茅醇(9.94%)、桉葉油醇(3.95%)、丁香烯(37.94%)、β-蒎烯(2.67%)等含有亞甲基、羥基的基團的化合物化學性質活潑，易氧化而使精油具有抗氧化活性。所以精油有很強的對自由基的清除作用。

圖2 精油與抗壞血酸對DPPH清除率比較

2.3 精油的抑菌效果

2.3.1 精油對細菌的抑制作用

10 μL各濃度精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌的抑菌效果如表2所示，從表2可看出，精油對3種細菌均有抑制作用，對大腸桿菌的抑制作用較強。對金黃色葡萄球菌抑制作用次之，對枯草芽胞桿菌也有抑制作用，但抑制作用較弱。從表2還看出隨著精油濃度的減小，抑菌圈直徑減小。

表2 廣玉蘭花精油對細菌的抑菌活性/mm

2.3.2 精油對真菌的抑制作用

從表3可看出，與對照比較，精油對供試的真菌生長有抑制作用。其中對紅酵母的抑制作用最強，30 ℃ 培養(yǎng)48 h觀察到當培養(yǎng)基中精油質量濃度達1.25 mg/mL時，各皿均沒有紅酵母菌落生長；8 d時5 mg/mL精油的平板中仍然無紅酵母菌落生長，說明此濃度的精油能殺滅紅酵母。30 ℃培養(yǎng)48 h黑曲霉菌種各精油濃度的平板中均有菌落生長，但精油質量濃度大于1.25 mg/mL的各平板中黑曲霉菌落比對照中小，菌絲也短。表明對黑曲霉菌絲生長有抑制作用；8 d時各濃度平板中均長滿黑色孢子。培養(yǎng)48 h時，根霉菌種各精油濃度平板中根霉菌絲均長滿平板，但對照平板菌絲生長茂盛抵達皿蓋，而加有不同濃度精油的各平板中菌絲很短且細而彎曲，只達平板培養(yǎng)基的表面，說明當培養(yǎng)基中加入0.625 mg/mL精油時對根霉的菌絲生長有明顯的抑制作用；8 d時觀察，各濃度精油的根霉平板中菌絲長長，但呈絨毛狀，質量濃度大于1.25 mg/mL的平板中菌絲均未抵達皿蓋。從精油對黑曲霉、根霉的抑制作用說明，精油沒有抑制霉菌孢子的萌發(fā)，但對菌絲的生長有抑制作用。

精油對細菌和真菌的抑制作用與精油中的成分有關[11-12]，如β-古蕓烯具有抗炎鎮(zhèn)痛及清熱解表之功效，對大腸桿菌有較強的抑制作用；β-欖香烯廣泛用于腫瘤的臨床治療，其臨床應用已有廣泛研究；香茅醇(9.94%)具有抑制金黃色葡萄球菌及傷寒桿菌活性和曲霉、青霉菌絲生長作用；桉葉油醇(3.95%)，有樟腦氣息和清涼的草藥味道，香氣強烈而不持久，有一定防霉及殺菌防腐作用,反式-香葉醇(0.98%)有抗細菌和真菌作用。

3 討論與結論

用乙醚提取廣玉蘭花精油的得率為1.98%，比蔡桂香等[18]用水蒸氣提取的得率高。乙醚把花中脂溶性成分充分萃取出來，包括花中的大分子物質如革質、蠟質等，用乙醇低溫靜置，使萃取物中不溶于乙醇的成分去除，得到淺黃色的浸膏狀物而不是油狀。利用GC-MS聯(lián)用儀分析技術對廣玉蘭花精油進行了分析和鑒定，共鑒定出43個化合物，占精油總量的95.49%。廣玉蘭花香精油中主要成分為丁香烯(37.94%)、芳樟醇(11.06%)、香茅醇(9.94%)、桉葉油醇(3.95%)、2-甲基丁酸甲酯(3.86%)、β-欖香烯(3.02%)、β-蒎烯(2.67%)、α-古蕓烯(2.55%)、甲基丁香油酚(2.19%)、匙葉桉葉烯醇(1.66%)、氧化芳樟醇(1.47%)、檸檬醛(1.40%)、愈創(chuàng)木烯(1.38%)等。

廣玉蘭精油有很強的清除自由基的能力，當質量濃度達到20 μg/mL時，去除率與抗壞血酸相當。廣玉蘭花精油含有較豐富的萜類氧化物和萜類化合物如芳樟醇(11.06%)、香茅醇(9.94%)、桉葉油醇(3.95%)、丁香烯(37.94%)、β-蒎烯(2.67%)等含有亞甲基、羥基的化合物化學性質活潑，易氧化而使精油具有抗氧化活性。精油的易氧化性質要求精油在保存時用棕色瓶且避光低溫密閉保存。否則賦香、抗氧化、抑菌等活性成分易被破壞。

表3 廣玉蘭花精油對真菌的抑制作用

注：表中“—”表示無法計數(shù)。

廣玉蘭花精油對細菌、真菌均有抑制作用，特別是對紅酵母有強的抑制作用。當培養(yǎng)基中精油質量濃度5.00 mg/mL時能完全抑制培養(yǎng)基中的紅酵母生長，紅酵母在自然界中分布廣，是使食品腐敗的微生物之一，特別易使含糖高的食品腐敗變質。廣玉蘭花精油用于食品工業(yè)不僅可作香料還具有防腐保鮮效果，因此廣玉蘭花精油有一定的開發(fā)和利用價值。

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Analysis on Chemical Composition, Antioxidant and Antimicrobical Activities of the Essential Oils from the Flower ofMagnoliaGrandifloraL.

Ye Shengmei Sun Junfeng Pang Kuanzhuang Zhang Rongli

(College of Biological and Engineering, Anhui Polytechnic University, Wuhu 241000)

The essential oil from the flower ofMagnoliaGrandifloraL.was extracted using Soxhlet with ether. The chemical consitituents and the relative contents were identified by GC-MS by separation and analysis;forty-three compounds were qualitatively determined which accounted for 95.49% of essential oils. The antioxidant activities were analyzed by DPPH radical scavenging method; the essential oils show antioxidant activity to DPPH radical scavenging at a concentration of 20 μg /mL or more. The antimicrobical activities were identified by inhibition zone diameter and colony growth method;agar diffusion method and agar dilution method showed that the essential oils had antimicrobial activity to bacterial and fungi,it possessed stronger inhibition capacity onRhodotorula, when the essential oils to 5.00 mg/mL in the medium the red yeast growth were inhibited completely. The above results domenstrated that the essential oils from the flower ofMagnoliaGrandifloraL.were not only the spice of the food ingredient but also had a preservative effect for the food industry.Therefore,the essential oil had potential development and utilization value in the area of food, cosmetic and medicine.

MagnoliaGrandifloraL, essential oils, chemical composition, antioxidant activity, antbacterial activity

國家自然科學基金(21504001)，安徽省教育廳自然科學基金(KJ2010A349),安徽省大學生創(chuàng)新訓練(AH201410363148)

2016-05-17

葉生梅，女，1963年出生，高級實驗師，微生物菌種選育及生理生化

Q949.93

：A

：1003-0174(2017)08-0071-06