大鼠早期局灶性腦缺血再灌注損傷中USP10的表達(dá)水平變化及其與自噬的關(guān)系

方聰聰 毛善平 曾智 董慧敏 劉寶輝 王舜 譚華威

大鼠早期局灶性腦缺血再灌注損傷中USP10的表達(dá)水平變化及其與自噬的關(guān)系

方聰聰 毛善平 曾智 董慧敏 劉寶輝 王舜 譚華威

目的 探討早期局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型中再灌注不同時(shí)間點(diǎn)USP10的表達(dá)水平變化及其與自噬的關(guān)系。方法 將36只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分成4組：假手術(shù)組、腦缺血2 h再灌注6 h模型組、腦缺血2 h再灌注12 h模型組、腦缺血2 h再灌注24 h模型組；采用線栓法致大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，給予神經(jīng)行為學(xué)評分，用TTC染色法測定腦梗死體積，透射電鏡觀察梗死周邊區(qū)皮層神經(jīng)元自噬，Western blot 法檢測梗死周邊區(qū)皮層USP10和自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達(dá)水平，免疫熒光雙標(biāo)法檢測梗死周邊區(qū)皮層神經(jīng)元中USP10及LC3B的表達(dá)水平變化。結(jié)果 免疫熒光雙標(biāo)顯示模型組自噬蛋白陽性細(xì)胞數(shù)與存活神經(jīng)元數(shù)均于再灌注12 h最多(P<0.05)，二者某種程度上趨勢一致；Western blot免疫熒光雙標(biāo)均顯示與假手術(shù)組相比，USP10及LC3B蛋白在模型組中表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，且于再灌注12 h組達(dá)到高峰(P<0.05)；透射電鏡顯示再灌注不同時(shí)間點(diǎn)自噬強(qiáng)度的變化與免疫熒光自噬蛋白表達(dá)水平的趨勢基本一致。結(jié)論 早期腦I/R損傷中自噬的激活某種程度上可減輕神經(jīng)元的損傷，而USP10可能通過某種機(jī)制調(diào)控腦I/R中自噬的發(fā)生發(fā)展。

腦缺血再灌注損傷 自噬 USP10 LC3

缺血性腦卒中是中國乃至全世界致殘率和致死率都較高的疾病之一，其發(fā)病是由于腦血管突然閉塞(腦缺血)引起一系列病理變化，從而導(dǎo)致腦神經(jīng)功能缺損。早期溶栓被證明是減輕神經(jīng)元損傷、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)最有效的方法。隨著介入技術(shù)的發(fā)展，動(dòng)脈內(nèi)溶栓被廣泛用于臨床并取得了良好的效果，但研究顯示缺血區(qū)恢復(fù)再灌注后腦組織損傷反而加重，出現(xiàn)更嚴(yán)重的功能障礙，且稱之為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)[1]。減輕該損傷對早期有效治療缺血性腦血管病和改善患者預(yù)后十分重要。

最近有研究發(fā)現(xiàn)再灌注期間尤其是再灌注早期機(jī)體會(huì)啟動(dòng)自噬(autophagy)[2-4]，通過清除損傷或多余的細(xì)胞器來修復(fù)缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷以及再灌注引起的繼發(fā)性損傷。它被認(rèn)為是新近發(fā)現(xiàn)的一種機(jī)體內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)現(xiàn)象[5]。但自噬是一把雙刃劍[6]，一方面自噬的啟動(dòng)可能有助于維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)，減少繼發(fā)損傷，清除已經(jīng)被損傷的細(xì)胞器而保護(hù)神經(jīng)元；另一方面自噬的過度激活同樣可以導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡，顯然這對于腦I/R中的神經(jīng)元恢復(fù)非常不利。無論是缺血預(yù)處理[7]還是缺血后處理[8]誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用均與自噬有著密切的關(guān)系，但是在腦缺血中自噬的水平如何決定細(xì)胞的生存與死亡尚不明確。因此，在腦I/R中研究不同時(shí)間點(diǎn)自噬強(qiáng)度的變化顯得十分有必要。

USP10是哺乳動(dòng)物泛素特異性蛋白酶(DUBs)的一員，能利用活性硫醇位點(diǎn)將泛素與靶蛋白拆開[9]，使靶蛋白泛素化障礙，阻斷泛素蛋白酶體途徑。有報(bào)道去泛素化酶家族DUBs中USP15[10],USP30[11]和USP35直接去泛素化Parkin的底物，下調(diào)線粒體自噬。

早期的研究報(bào)道在大鼠等多種腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭卸寄軌蛘T發(fā)自噬，包括全腦缺血或局灶性腦缺血以及腦缺血缺氧模型等[12-14]。也有研究證明自噬的激活與I/R損傷的減輕有關(guān)[15-16]，但其在腦I/R中作用機(jī)制尚不明確。本研究擬利用SD大鼠MCAO模型，探討在腦I/R中不同時(shí)間點(diǎn)自噬強(qiáng)度的變化、USP10的表達(dá)水平變化及二者之間的關(guān)系，為闡明自噬參與腦I/R損傷的機(jī)制及臨床研發(fā)治療腦I/R損傷的神經(jīng)保護(hù)性候選藥物提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性SD大鼠36只，體重250～300 g，來源于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SYXK(鄂) 2015-0027。

1.2 主要材料與試劑

大鼠MCAO模型尼龍線栓購于北京西濃科技有限公司；兔源性USP10、LC3B及GAPDH抗體均來自英國Abcam公司；IgG二抗(羊抗兔)來自英國Abcam公司；預(yù)染蛋白Marker購于Thermo公司；熒光二抗購于美國LICOR公司；BCA蛋白水平檢測試劑盒，RIPA裂解液(強(qiáng))試劑購于碧云天生；醋酸纖維素膜購于Biosharp。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將同一批健康成年SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組。假手術(shù)組：僅行手術(shù)及分離血管，不放線栓。模型組：將Zea longa線栓法[17]改良而建立模型。

1.3.2 大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型(MCAO)制備

5%異氟烷深度麻醉大鼠，取頸部正中切口，分離左側(cè)頸外、頸內(nèi)及頸總動(dòng)脈，結(jié)扎并離斷頸外動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈并預(yù)留一縫合線備用；在頸外動(dòng)脈近頸總動(dòng)脈分叉處離斷頸外動(dòng)脈及其周圍的分支，將頸外動(dòng)脈近頸動(dòng)脈分叉處剪一小口，向頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢插入尼龍線栓，去除頸內(nèi)及頸總動(dòng)脈的動(dòng)脈夾，將線栓全部插入時(shí)感到有阻力，即已達(dá)到大腦中動(dòng)脈的分叉處；栓塞成功后用預(yù)留的縫合線打活結(jié)扎緊線栓，縫合手術(shù)切口；阻斷2 h的血流后再次麻醉大鼠，拔除線栓并結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈，再次縫合手術(shù)切口。

1.3.3 神經(jīng)行為學(xué)評分

取材前參照Longa評分標(biāo)準(zhǔn)[18]進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。模型成功的標(biāo)志是大鼠麻醉蘇醒后出現(xiàn)缺血對側(cè)以前肢為重的偏癱。模型納入標(biāo)準(zhǔn)為神經(jīng)行為學(xué)評分在1分以上，且大鼠斷頭取腦后在顯微鏡下查看大腦中動(dòng)脈起始部略為擴(kuò)張并無血管內(nèi)血栓形成或出血。神經(jīng)行為學(xué)參照評分，即0分：無癥狀；1分：提尾時(shí)損傷對側(cè)前肢不能伸直；2分：行走時(shí)向損傷對側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：行走時(shí)向損傷對側(cè)傾倒；4分：無自發(fā)活動(dòng)或死亡。

1.3.4 2% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)測量腦梗死體積

異氟烷深度麻醉并處死大鼠，斷頭取腦，放入鼠腦專用切片模具中，沿冠狀位將大腦切成2 mm的切片，將切片于TTC中浸泡30 min，恰當(dāng)染色后浸于4%多聚甲醛中固定過夜，將切片按層面排列整齊并掃描[18]，使用NIH Image J軟件測定大腦皮層面積及梗塞面積，通過矯正腦水腫而計(jì)算出腦組織損傷程度，即測量病灶對側(cè)整個(gè)大腦半球面積與梗死同側(cè)正常半球組織，梗死面積由梗塞對側(cè)面積減去梗死同側(cè)正常組織面積而來，再乘以切片厚度(2 mm)即為梗死體積。整個(gè)半球的梗死程度由5片大腦切片梗死體積相加而來，最后以梗死體積占對側(cè)大腦皮層體積的百分比表示。

1.3.5 透射電鏡

用2%的戊巴比妥按6 mL/Kg麻醉大鼠后用含0.5%戊二醛的4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定，然后快速取腦，在冰上暴露并切取大鼠傷側(cè)皮層約1 mm×mm×mm大小，迅速入預(yù)冷的4%戊二醛，4 ℃保存；檢測前取出標(biāo)本經(jīng)1%餓酸固定2 h；梯度酒精、丙酮逐級脫水：50%酒精10 min→70%酒精10 min→80%丙酮10 min,2次→90%丙酮10 min，2次→無水丙酮10 min，2次→環(huán)氧樹脂包埋，60 ℃溫箱中聚合48 h； 切片機(jī)做超薄切片，厚度為100 nm醋酸鈾，檸檬酸鉛染色；透射電鏡觀察神經(jīng)元、線粒體、溶酶體及自噬體的超微結(jié)構(gòu)并拍照[18]。

1.3.6 Western blot 法檢測USP10和LC3蛋白的表達(dá)水平

用生理鹽水進(jìn)行心臟灌注后取腦，提取腦組織蛋白，BCA法測蛋白，將組織蛋白樣品與上樣緩沖液(5×)按照4∶1的體積比混勻，100 ℃，5～10 min變性組織蛋白后取50 g蛋白上樣，10%SDS—PAGE電泳，先70 V，40 min，然后110 V，1 h；將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用PBS洗3遍，每遍5 min；室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h；將一抗置膜于稀釋的一抗中(USP10，兔源性，1∶1000；GAPDH，兔源性，1∶1 000；LC3，兔源性，1∶1 000；)，4 ℃孵育過夜，后用PBST 洗膜3次，每次5 min；然后室溫下孵育二抗(羊抗兔1∶2000)2 h，先用PBST洗膜2遍，后用PBS洗膜1遍，每遍5 min，最后用Odyssey Infrared Imaging掃膜。

1.3.7 免疫熒光雙標(biāo)法檢測USP10和LC3蛋白的表達(dá)水平

先用生理鹽水再用4%的多聚甲醛快速灌注心臟后取腦，再將完整腦組織置于4%的多聚甲醛中，于4 ℃冰箱固定12 h以上；然后制成石蠟切片置于65 ℃烘箱中烘片2 h，脫蠟至水，用PBS洗3次，每次5 min；切片置于EDTA緩沖液中微波修復(fù)，中火至沸后斷電，間隔10 min低火至沸；自然冷卻后PBS洗3次，每次5 min；切片置于3%過氧化氫溶液中室溫下避光孵育10 min；PBS洗3次，每次5 min，甩干后5% BSA封閉20 min；去除BSA液，每張切片加入約50 μL稀釋的一抗覆蓋組織，4 ℃過夜；PBS洗3次，每次5 min；去除PBS液，每張切片加50 μL～100 μL相應(yīng)種屬的二抗，37 ℃孵育50 min；PBS洗3次，每次5 min；去除PBS液，每張切片加50～100 μL DAPI染液，室溫避光孵育5 min；染色后將切片放入PBS中洗3次，每次5 min；滴加適量的抗熒光淬滅劑于組織上，蓋玻片封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分的評估

假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能缺損，而MCAO6h組(2.33±0.81)、MCAO12h組(1.83±0.75)及MCAO24h組(2.00±0.89)分大鼠于麻醉清醒后即出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，如對側(cè)前肢屈曲，右側(cè)轉(zhuǎn)圈等，但任意兩組比較均無明顯差異(P>0.05)。

2.2 TTC染色

如圖1所示，各組均可見皮層及皮層下有明顯的白色梗死灶。

2.3 透射電鏡下觀察自噬體的超微結(jié)構(gòu)

如圖2所示，各組神經(jīng)元均出現(xiàn)異染色質(zhì)核膜下邊集；線粒體腫脹、嵴斷裂，甚至溶解消失；初、次級溶酶體、自噬溶酶體及自噬小體形成。

2.4 Western blot法檢測相關(guān)蛋白在各組中的表達(dá)水平見圖3～4。

2.5 免疫熒光雙標(biāo)法檢測梗死周邊區(qū)皮層神經(jīng)元中USP10和LC3蛋白的表達(dá)水平見圖5～8。

圖1 再灌注不同時(shí)間點(diǎn)腦梗死灶大小

圖3 Westernblot法檢測USP10和LC3蛋白在各組中的表達(dá)水平

圖2 透射電鏡下(×8000倍)腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)溶酶體及自噬體的檢測 注：→初級溶酶體，→次級溶酶體，→自噬小體，→自噬溶酶體，M為線粒體

圖4 Westernblot法檢測各組USP10及LC3B蛋白的表達(dá)水平 MCAO組USP10和LC3蛋白的表達(dá)明顯增加(與假手術(shù)組比較，?P<0．01)；其中MCAO12h組各蛋白表達(dá)量最高(與MCAO12h比較，△P<0．05)，而MCAO6h組與MCAO24h組各蛋白的表達(dá)水平卻無明顯差異(P>0．05)

3 討 論

近20年來腦卒中始終占我國主要疾病病死率前3位，其中缺血性腦卒中占所有腦卒中的87%[20]。腦卒中發(fā)生時(shí)十分兇險(xiǎn)，即使度過急性期，多數(shù)患者也會(huì)遺留許多后遺癥。因此，如何研發(fā)有效的藥物減輕CIRI、改善患者生存質(zhì)量一直是該領(lǐng)域急需攻克的難題。

圖5 免疫雙標(biāo)法檢測缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元中USP10的表達(dá)水平變化

圖6 免疫雙標(biāo)法檢測缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元中LC3B的表達(dá)水平變化 白色箭頭為目的蛋白在神經(jīng)元上的陽性表達(dá)；左側(cè)為NeuN標(biāo)記神經(jīng)元，右側(cè)為merged后

圖7 免疫熒光法檢測缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元的數(shù)量 模型組神經(jīng)元數(shù)量顯著減少(與假手術(shù)組比較，?P<0．01)，但MCAO12h組存活神經(jīng)元數(shù)最多(與MCAO12h組比較，△P<0．05)

圖8 免疫雙標(biāo)法檢測缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元中USP10及LC3B的表達(dá)變化 MCAO組USP10及LC3B陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(與假手術(shù)組比較，?P<0．01)，但MCAO12h組USP10及LC3B陽性細(xì)胞數(shù)最多(與MCAO12h組比較，△P<0．05)

CIRI機(jī)制十分復(fù)雜，包括活性氧自由基(Reactive oxide species,ROS)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、NO失調(diào)控、興奮性氨基酸毒性等事件。其中，ROS是CIRI的關(guān)鍵事件，線粒體是ROS損傷的靶器官，也是體內(nèi)ROS的主要來源之一。線粒體功能紊亂與ROS過量生成/NO失調(diào)控相互作用，進(jìn)一步可誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，從而加重神經(jīng)元損傷。研究表明自噬在腦I/R中可被激活進(jìn)而清除損傷的線粒體，間接清除積累的ROS,可能是治療缺血性腦卒中的一大潛在途徑[21]。

USP10是哺乳動(dòng)物的泛素特異性蛋白酶(DUBs)的一員，顯然可以阻斷泛素蛋白酶體途徑[9]。諸多研究證實(shí)缺血再灌注損傷時(shí)，泛素化蛋白質(zhì)聚集，蛋白酶體活性降低[22]。同時(shí)，有研究顯示去泛素化酶家族中的USP15、USP30和USP35可以下調(diào)線粒體自噬。一直以來自噬和泛素蛋白酶體都被看做是兩種相互獨(dú)立的蛋白降解系統(tǒng)，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)系統(tǒng)內(nèi)部有相互關(guān)聯(lián)之處[23]。本研究發(fā)現(xiàn)USP10與自噬蛋白的表達(dá)趨勢一致，并不難猜測USP10可能通過泛素蛋白酶體途徑在CIRI中參與自噬的調(diào)節(jié)。

LC3是自噬相關(guān)的一個(gè)重要蛋白，常被作為自噬起始的標(biāo)記物，也被作為檢測細(xì)胞自噬程度的分子標(biāo)記。LC3在細(xì)胞內(nèi)主要存在兩種亞型：LC3-A型和LC3-B型，LC3B在自噬的過程中始終定位于自噬體膜上[24]， LC3B含量的多少在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性。本研究在假手術(shù)組內(nèi)即有LC3B的低水平表達(dá)，而MCAO組LC3B蛋白表達(dá)水平自再灌注6 h起出現(xiàn)升高趨勢，在12 h達(dá)到高峰，隨后緩慢下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明MCAO組大鼠在接受缺血缺氧刺激后機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)并激發(fā)神經(jīng)元發(fā)生自噬，且在再灌注的6 h～24 h時(shí)間段中自噬呈持續(xù)性發(fā)生。

目前國內(nèi)針對自噬在腦缺血再灌注中的作用機(jī)制研究正在不斷深入，但是現(xiàn)有的研究仍然局限于自噬到底有無保護(hù)作用以及自噬的上游調(diào)控機(jī)制等方面。本研究結(jié)果顯示，腦I/R12 h存活神經(jīng)元的數(shù)量最多，在一定程度上與自噬強(qiáng)度有關(guān)，但24 h存活神經(jīng)元數(shù)卻并未與自噬強(qiáng)度變化高度一致，本研究推測①CIRI機(jī)制十分復(fù)雜，自噬的神經(jīng)保護(hù)作用不足以拯救所有方式的神經(jīng)元死亡；②自噬是一把雙刃劍，自噬的激活不足有可能并不能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，相反可能會(huì)導(dǎo)致更多神經(jīng)元損傷。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)在腦I/R不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元中USP10的表達(dá)水平變化均與自噬蛋白LC3B的變化高度一致。因此，本研究結(jié)果表明在早期腦I/R中自噬的激活對缺血神經(jīng)元有保護(hù)作用，且與自噬強(qiáng)度呈現(xiàn)一定程度的關(guān)系；本研究推斷USP10很可能參與了腦I/R中自噬的過程，并高度懷疑泛素蛋白酶體系統(tǒng)與自噬溶酶體途徑可能在腦I/R中存在交叉調(diào)控作用。

總之，自噬在早期腦I/R中被激活并在一定程度上發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用，而這種保護(hù)作用可能與自噬強(qiáng)度有關(guān)系；同時(shí)本研究推測USP10可能參與了早期腦I/R中的自噬過程，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究注重探討自噬與腦缺血/再灌注損傷的相互作用關(guān)系，將可能成為下一步的研究重點(diǎn)，并為腦缺血性疾病的治療提供新的思路和策略。

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(2016-08-12收稿)

The study on the relation between the expression of USP10 and autophagy following early focal cerebral ischemical reperfusion injury in rats

FangCongcong,MaoShanping，ZengZhi,etal.

DepartmentofNeurology,RenminHosiptalofWuhanUniversity,Wuhan430060

Objective To explore the relation between USP10 expression and autophagy in rats model of early focal cerebral ischemia-reperfusion(I/R) injury.Methods Totally 36 male, healthy Sprague-Dawley rats were used and randomlyassigned to four groups: Sham-operated group(Sham) and cerebral ischemia-reperfusion group (MCAO6 h,12 h and 24 h group).The focal cerebral chemia-reperfusiong ( I/R) rat models were established by the middle cerebral artery occlusion (MCAO) using intraluminal suture method. The behavior scales function rats was used as a general assessment of neural of brain injury; 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) straining was used to observe infarct volume; specific structure of autophagosome and specific protein of autophagy microtubule-associated protein 1 light chain 3 B(LC3B)were detected by transmission electron microscope,WB and immunofluorescence respectively.Results Compared to the Sham group, autophagy existed in different time periods after I/R shown both in transmission electron microscope, WB and immunofluorescence, which was in line with the expression of USP10. The number of positive cells and survival neurons was significantly increased at I/R 12H compared with sham group(P<0.05) in immunofluorescence.Conclusion The intensity of autophagy was positive correlation of the number of survival neurons in rats model of early focal cerebral ischemia-reperfusion(I/R) injury. The expression of USP10 was in accord with LC3B,which indicates USP10 might regulate the development of autophagy and would lay important foundation for the study on the interaction of autophagy-lysosomes system and ubiquitin-proteasomes system in cerebral I/R injury.

Cerebral ischemia/reperfusion Autophagy USP10 LC3B

武漢市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號為2013060602010270)

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[方聰聰 毛善平(通訊作者) 王舜 董慧敏]，病理科(曾智)，神經(jīng)外科(劉寶輝)，精神科(譚華威)

R743.33

A

1007-0478(2017)04-0290-07

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.04.004