雷帕霉素調(diào)控自噬在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞退變中的機制研究

王浩 曹飛 斯海波 沈彬

（四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科，成都610041）

·基礎(chǔ)研究 ·

雷帕霉素調(diào)控自噬在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞退變中的機制研究

王浩 曹飛 斯海波 沈彬*

（四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科，成都610041）

背景：骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis,OA）的發(fā)生與軟骨細胞自噬活動降低、細胞穩(wěn)態(tài)失衡密切相關(guān)。雷帕霉素是一種常用的自噬誘導(dǎo)劑，能上調(diào)自噬活動、維持細胞穩(wěn)態(tài)。目的：明確能否通過雷帕霉素提高軟骨細胞自噬相關(guān)因子的表達，促進軟骨細胞生存。方法：收集正常軟骨標(biāo)本5例，中期及晚期OA軟骨標(biāo)本各10例。免疫組織化學(xué)檢測軟骨組織中自噬相關(guān)蛋白表達情況。體外分離、培養(yǎng)軟骨細胞，進行藥物實驗。各期OA標(biāo)本軟骨細胞分為低、中、高濃度實驗組和對照組，分別予以1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L雷帕霉素及相同體積培養(yǎng)基。運用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）及Western-Blot檢測自噬相關(guān)因子ULK1、Beclin1、LC3表達變化規(guī)律。結(jié)果：免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，隨著OA退變程度加重，軟骨組織中自噬相關(guān)蛋白陽性表達率逐漸降低。PCR及Western-Blot發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素干預(yù)正常軟骨細胞后，實驗組自噬相關(guān)因子ULK1、Beclin1、LC3表達量高于對照組，且與雷帕霉素呈濃度依賴性。中期OA軟骨細胞結(jié)果與正常軟骨細胞類似，但組間差異更明顯。晚期OA軟骨細胞中，實驗組自噬相關(guān)因子表達量較對照組呈上升趨勢，但升高幅度較小。結(jié)論：雷帕霉素可以上調(diào)自噬相關(guān)因子的表達，其中正常及中期OA軟骨細胞對雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬活動具有良好的反應(yīng)性，而晚期OA軟骨細胞對雷帕霉素刺激反應(yīng)較差。

骨關(guān)節(jié)炎；自噬；mTOR信號通路；雷帕霉素

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis,OA）是一種常見的慢性退行性改變的關(guān)節(jié)病，其主要病理改變是關(guān)節(jié)軟骨細胞減少和軟骨基質(zhì)降解[1,2]。近年來隨著對OA發(fā)病機制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)軟骨細胞穩(wěn)態(tài)失衡與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

自噬作為細胞的一種保護性機制，廣泛參與細胞的發(fā)育、增殖、凋亡等多個過程，在軟骨細胞的成熟及穩(wěn)態(tài)維持過程中，自噬同樣發(fā)揮著重要作用。自噬可以調(diào)節(jié)細胞對外界刺激做出適應(yīng)性反應(yīng)，并及時清除受損的細胞器及大分子物質(zhì)，避免損傷的累積，促進細胞存活[3]。自噬是自噬相關(guān)基因（autophagy associated gene,ATG）參與介導(dǎo)的蛋白質(zhì)加工修飾過程，其中ATG 1、ATG 6、ATG 8（哺乳動物中的同源物分別稱作ULK1、Beclin1、LC3）是自噬途徑的3個主要管理者，分別充當(dāng)誘導(dǎo)者、調(diào)節(jié)者、執(zhí)行者的角色[4]。自噬的分子機制與信號調(diào)控通路十分復(fù)雜，其中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是諸多信號調(diào)控通路與分子機制作用的交匯點，對自噬調(diào)節(jié)發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，是自噬的負性調(diào)控因子[5]。

雷帕霉素是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，可以抑制mTOR信號通路的mTOR復(fù)合物1（mTOR complex 1,mTORC1），從而誘導(dǎo)自噬活動[6]。研究[6-8]表明，雷帕霉素可以上調(diào)神經(jīng)細胞、肝癌細胞、腎小球足細胞等多種細胞的自噬活動。設(shè)想在OA軟骨細胞退變過程中能否通過雷帕霉素抑制mTOR信號通路，從而上調(diào)自噬活動，促進OA軟骨細胞的自我修復(fù)。因此，本研究使用雷帕霉素干預(yù)正常軟骨細胞，中期OA及晚期OA軟骨細胞，運用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）及Western-Blot技術(shù)，分別從mRNA及蛋白水平檢測自噬相關(guān)因子的表達變化規(guī)律，從而闡明雷帕霉素在自噬調(diào)節(jié)中的作用以及與軟骨細胞退變的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

正常組（取自因重度毀損傷行膝上截肢術(shù)者）、中期OA組（取自因膝關(guān)節(jié)中度OA行單間室膝關(guān)節(jié)置換術(shù)者）及晚期OA組（取自因膝關(guān)節(jié)重度OA行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)者）膝關(guān)節(jié)軟骨均取自四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科手術(shù)室。分別搜集正常組軟骨標(biāo)本5例，中期及晚期OA組軟骨標(biāo)本各10例。該研究已獲得四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)授權(quán)，所有患者均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者知情同意，并簽署知情同意書；②既往體健，否認其他疾患；③符合骨關(guān)節(jié)炎臨床表現(xiàn)、影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有膝關(guān)節(jié)感染病史、明確的關(guān)節(jié)外傷史者；②術(shù)前傳染病篩查乙肝、梅毒等陽性者；③繼發(fā)性O(shè)A者；④類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎者。

1.2 主要試劑

Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基（由Hycolon公司提供）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（由EU Fermentas公司提供）；熒光定量PCR試劑盒（由大連寶生物公司提供）；Anti-ULK1、Anti-Beclin1和Anti-LC3（由Abcam公司提供）；ACTB、ULK1、Beclin1和LC3引物（由上海生工生物工程有限公司提供），雷帕霉素（由北京索萊寶公司提供）。

1.3 實驗方法

1.3.1 軟骨細胞分離與培養(yǎng)：從手術(shù)室獲取的標(biāo)本，浸泡在含DMEM低糖培養(yǎng)基中，低溫保存，盡快轉(zhuǎn)移至實驗室。在超凈工作臺內(nèi)，用組織剪將標(biāo)本剪成約0.5×0.5 cm2軟骨片后，換用眼科剪將軟骨片盡量剪碎成約1 mm2的軟骨碎塊。在物理消化的基礎(chǔ)上，0.25%的胰蛋白酶消化20 min，PBS溶液清洗后加含0.2%Ⅱ型膠原酶的DMEM低糖培養(yǎng)基，置于37℃水浴箱中輕微震蕩消化30～40 min，加入胎牛血清終止消化，l000 rpm離心5 min，棄上清，即得到消化下的軟骨細胞。將上述獲得的軟骨細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃恒溫、5%CO2體積分數(shù)及飽和濕度的孵箱中進行培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液。

1.3.2 雷帕霉素干預(yù)各期軟骨細胞：將培養(yǎng)成功的軟骨細胞分成以下4組：低濃度實驗組、中濃度實驗組、高濃度實驗組和對照組。實驗組加入一定濃度的雷帕霉素進行干預(yù)，對照組加入相同體積的無血清培養(yǎng)基。低、中、高濃度實驗組加入的雷帕霉素濃度分別為低（1 μmol/L）、中（5μmol/L）、高（10 μmol/L）。

將第二代軟骨細胞接種到6孔板中，每孔接種1×105個細胞，每孔加入2 ml含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2體積分數(shù)的孵箱中培養(yǎng)過夜，待細胞豐度為30%～40%時進行藥物實驗。1.3.3軟骨標(biāo)本免疫組織化學(xué)：軟骨標(biāo)本經(jīng)固定、脫鈣、脫水、浸蠟包埋、常規(guī)切片后，二甲苯對石蠟切片進行脫蠟處理，梯度酒精水化；3%H2O2淬滅內(nèi)源性過氧化物酶；抗原修復(fù)；5%山羊血清處理10 min后，室溫下一抗孵育孵育1 h；生物素標(biāo)記的二抗孵育1 h；二氨基聯(lián)苯胺顯色；蘇木素復(fù)染、脫水、透明、干燥，中性樹脂封片，鏡檢觀察。

1.3.4 熒光定量PCR檢測：6孔板培養(yǎng)軟骨細胞，待細胞融合率達30%～40%進行實驗，采用Trizol法提取細胞RNA，核酸蛋白分析儀檢測RNA含量與純度，1%凝膠電泳確定RNA片段的完整性。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照PCR試劑盒說明書進行ULK1、Beclin1、LC3 mRNA的檢測。采用ACTB（β-Actin）為內(nèi)參照基因。利用2-ΔΔCT法分析相應(yīng)基因表達，每個樣本設(shè)置3個重復(fù)。引物序列如表1所示。

1.3.5 Western-Blot檢測：6孔板培養(yǎng)軟骨細胞，待細胞融合率達30%～40%進行實驗，用預(yù)冷的蛋白提取液裂解軟骨細胞提取總蛋白；BCA法測定蛋白濃度；SDSPAGE電泳；70 V，電流300 mA，冰浴下轉(zhuǎn)膜1.5 h后封閉；室溫下一抗孵育2 h，TBST洗膜；二抗孵育2 h，TBST洗膜，每次5 min，共3次，加入ECL顯色液曝光顯影。采用Quantity one凝膠圖像分析軟件測定目標(biāo)基因條帶灰度值和內(nèi)參條帶灰度值比值，得出目標(biāo)基因蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS V20.0（IBM USA）軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗，3組或3組以上比較采用單因素方差分析檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 軟骨標(biāo)本免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

為了初步探索自噬與骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系，我們采用免疫組織化學(xué)對各組軟骨標(biāo)本中自噬相關(guān)蛋白的表達情況進行了檢測（圖1）。采用陽性著色細胞計數(shù)法分析發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)蛋白ULK1、Beclin1及LC3在正常軟骨組織中穩(wěn)定表達，隨著OA的進展，自噬相關(guān)蛋白陽性表達率逐漸降低，在晚期OA軟骨標(biāo)本中陽性表達率最低，各組間有統(tǒng)計學(xué)差異（圖2）。

表 1 熒光定量PCR引物序列

圖1 軟骨組織免疫組化（100×）

圖2 自噬相關(guān)蛋白ULK1、Beclin1及LC3在軟骨組織中的表達情況

2.2 熒光定量PCR檢測結(jié)果

雷帕霉素干預(yù)正常軟骨細胞后，實驗組軟骨細胞內(nèi)自噬相關(guān)基因ULK1、Beclin1及LC3表達量高于對照組，其中，低濃度組自噬基因表達量較對照組呈升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異，而中、高濃度組與對照組之間有統(tǒng)計學(xué)差異；隨著雷帕霉素濃度的增加，3個濃度組自噬相關(guān)基因表達量逐漸升高，其表達量與雷帕霉素之間呈濃度依賴性，其中，中、高濃度組較低濃度組有統(tǒng)計學(xué)差異，而高濃度組較中濃度組表達量進一步增加，但無統(tǒng)計學(xué)差異（圖3）。

圖3 正常軟骨細胞中自噬相關(guān)基因表達量

雷帕霉素干預(yù)中期OA軟骨細胞后，結(jié)果與正常軟骨細胞類似，但組間差異更加明顯。其中，中、高濃度組ULK1表達量較低濃度組有統(tǒng)計學(xué)差異，Beclin1及LC3在實驗組間均有統(tǒng)計學(xué)差異（圖4）。

圖4 中期OA軟骨細胞中自噬相關(guān)基因表達量

雷帕霉素干預(yù)晚期OA軟骨細胞后，實驗組軟骨細胞內(nèi)自噬相關(guān)基因表達量較對照組呈上升趨勢，但升高幅度較小，其中高濃度實驗組表達量最高，且與其他各組間有統(tǒng)計學(xué)差異，其余各組間均無統(tǒng)計學(xué)差異（圖5）。

圖5 晚期OA軟骨細胞中自噬相關(guān)基因表達量

2.3 Western-Blott檢測結(jié)果

雷帕霉素干預(yù)正常軟骨細胞后，實驗組軟骨細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白ULK1、Beclin1及LC3表達量高于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異；隨著雷帕霉素濃度的增加，3個濃度組自噬相關(guān)蛋白表達量逐漸升高，其表達量與雷帕霉素之間呈濃度依賴性，其中，中、高濃度組Beclin1表達量較低濃度組有統(tǒng)計學(xué)差異，ULK1及LC3在3實驗組間均有統(tǒng)計學(xué)差異（圖6、7）。

圖6 正常軟骨細胞中自噬相關(guān)蛋白表達條帶圖

圖7 正常軟骨細胞中自噬相關(guān)蛋白表達量

雷帕霉素干預(yù)中期OA軟骨細胞后，結(jié)果與正常軟骨細胞類似（圖8、9）。

圖8 中期OA軟骨細胞中自噬相關(guān)蛋白表達條帶圖

圖9 中期OA軟骨細胞中自噬相關(guān)蛋白表達量

雷帕霉素干預(yù)晚期OA軟骨細胞后，實驗組軟骨細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達量較對照組呈上升趨勢，但升高幅度較小，其中，高濃度實驗組表達量最高，且與其他各組間有統(tǒng)計學(xué)差異，而低、中濃度組較對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（圖10、11）。

3 討論

圖10 晚期OA軟骨細胞中自噬相關(guān)蛋白表達條帶圖

圖11 晚期OA軟骨細胞中自噬相關(guān)蛋白表達量

雷帕霉素是一種常用的自噬誘導(dǎo)劑。Pan等[6]用雷帕霉素干預(yù)體外神經(jīng)細胞帕金森模型后，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞中自噬體數(shù)量明顯增多，損傷的線粒體被自噬體清除，神經(jīng)細胞恢復(fù)了正常的功能狀態(tài)。Caramés等[9]建立體外軟骨機械損傷模型，用雷帕霉素處理軟骨塊后，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能顯著提高自噬相關(guān)蛋白的表達水平，并能夠減少軟骨細胞的死亡及蛋白聚糖的丟失。雷帕霉素作為mTOR的負性調(diào)控因子，能促進自噬，阻止軟骨細胞退變。然而，人骨關(guān)節(jié)炎是由多種因素共同作用的結(jié)果，單純依靠體外模型獲得的軟骨可能并不能真正意義上替代人的OA軟骨，從而喪失其研究結(jié)果對臨床的指導(dǎo)意義。因此，本研究通過雷帕霉素干預(yù)人不同退變階段的軟骨細胞，觀察能否上調(diào)自噬活動，從而終止甚至逆轉(zhuǎn)軟骨細胞退變。

本研究首先通過免疫組織化學(xué)檢測自噬相關(guān)因子ULK1、Beclin1及LC3在人軟骨組織中的表達，結(jié)果顯示隨著OA的進展，自噬相關(guān)蛋白陽性表達率逐漸降低，各組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異。雷帕霉素干預(yù)正常軟骨細胞及中期OA軟骨細胞后，實驗組軟骨細胞內(nèi)ULK1、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表達量高于對照組，且隨著雷帕霉素濃度的增加，實驗組自噬相關(guān)因子表達量逐漸升高，與雷帕霉素呈濃度依賴性，組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異。而雷帕霉素干預(yù)晚期OA軟骨細胞后，實驗組軟骨細胞內(nèi)自噬相關(guān)因子表達量較對照組呈上升趨勢，但升高幅度較小。這與Sa-saki等[10]和Matsuzaki等[11]的研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素對正常軟骨細胞及中期OA軟骨細胞自噬的誘導(dǎo)作用更強，而對于晚期OA軟骨細胞的自噬誘導(dǎo)能力較弱。因而，推測當(dāng)高強度的破壞因素持續(xù)作用于軟骨細胞，自噬活動不堪重負，自噬這種適應(yīng)性反應(yīng)難以保護軟骨細胞，軟骨細胞自噬活性被抑制，凋亡活性增強。此外，晚期OA軟骨細胞退變程度較重，細胞功能異常，而自噬本質(zhì)是自噬相關(guān)基因調(diào)控的蛋白加工修飾過程，因此，晚期OA軟骨細胞對雷帕霉素調(diào)控的自噬活動反應(yīng)性較差。

Chang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在正常氧含量條件下，雷帕霉素作用于正常軟骨細胞后，正常軟骨細胞自噬活動增強，細胞死亡率由干預(yù)前的34.47%下降至5.53%；而用自噬抑制劑3-MA抑制低氧條件下的OA軟骨細胞自噬活動后，其死亡率由干預(yù)前的40.16%下降至9.61%。因此，認為增強正常軟骨細胞自噬活動，能促進軟骨細胞生存，而增強OA軟骨細胞自噬活動，則促進軟骨細胞凋亡。而Caramés等[9]的研究表明，雷帕霉素能上調(diào)OA軟骨細胞自噬活動并降低軟骨細胞凋亡率。Sasaki等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素能使OA軟骨細胞自噬活動增強，并通過降低ROS的表達從而抑制細胞凋亡。這些研究結(jié)果之間的差異提示，某些外界因素能夠調(diào)節(jié)自噬對細胞生存活性的影響。Iglewski等[13]報道，自噬對細胞生存的影響取決于細胞外刺激的類型。當(dāng)細胞暴露于DNA損傷試劑，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，放射性環(huán)境時，自噬活動的增強有利于細胞生存[14-16]，而細胞處于低氧、砒霜等治療條件下，自噬活動的增強則促進細胞凋亡[17,18]。因此，雷帕霉素調(diào)控自噬活性與OA軟骨細胞退變之間的具體機制仍需進一步深入研究。

綜上所述，通過不同濃度的雷帕霉素干預(yù)正常軟骨細胞及中、晚期OA軟骨細胞后發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可以上調(diào)自噬相關(guān)因子的表達，抑制軟骨細胞凋亡，促進細胞生存，其中正常軟骨細胞及中期OA軟骨細胞對雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬活動具有良好的反應(yīng)性，而晚期OA軟骨細胞對雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬活動反應(yīng)較差。

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Research on the mechanism of Rapamycin regulating autophagy in the degenerativee process of osteoarthritis chondrocytee

WANG Hao,CAO Fei,SI Haibo,SHEN Bin*

（Department of Orthopedics,West China Hospital,West China Medical School,Sichuan University,Chengdu 610041,China）

【Absttrraactt】Background::Osteoarthritis is the result of chondrocytes degeneration.While autophagy is a cellular homeostasis mechanism that plays an essential role in preventing chondrocytes degeneration.Rapamycin as an autophagy inducer could upregulate autophagy activity and maintain cell homeostasis.Objecttiivee::To observe the changes of expression of autophagy related molecules(ULK1,Beclin1 and LC3)after regulation of mTOR signal pathway by Rapamycin.Methodss::Five normal cartilage samples and a total of 20 moderate and severe osteoarthritis cartilage samples with 10 of each were collected from amputation or knee arthroplasty surgery.Immunohistochemical techniques were used to detect the expression of autophagy-related proteins such as ULK1,Beclin1 and LC3 in cartilage.Knee cartilage cells were isolated and cultured in vitro for drug experiment.Osteoarthritis chondrocyte samples were divided into four groups:low,medium,high concentration Rapamycin groups and blank control group,treated with 1 μmol/L,5 μmol/L,10 μmol/L Rapamycin and the same volume of medium,respectively.PCR and Western-blot tests were performed to detect the mRNAand protein expression of autophagy related molecules(ULK1,Beclin1 and LC3).Resullttss::The results of immunohistochemistry showed that the expression of ULK1,Beclin1 and LC3 in the cartilage decreased significantly with the degradation of osteoarthritis.The results of PCR and Western-blot tests showed that in the normal chondrocyte,autophagy related molecules(ULK1,Beclin1 and LC3)were significant higher in low,medium and high concentration Rapamycin groups than those in blank control group,and were concentration-dependent on Rapamycin.The results of experiment on moderate osteoarthritis chondrocyte were similar to those of the normal chondrocyte,while the difference among groups was more significant.In the severe osteoarthritis chondrocyte,autophagy related molecules were higher in low,medium and high concentration Rapamycin groups than those in the blank control group,but no significant difference was found.Conclusiionss::Rapamycin can increase the expression of autophagy related molecules such as ULK1,LC3 and Beclin1.The autophagy activity is enhanced in the normal chondrocyte and the moderate osteoarthritis chondrocyte significantly by Rapamycin,but that in the severe osteoarthritis chondrocyte is little changed by Rapamycin.

Osteoarthritis;Autophagy;mTOR Signaling Pathway;Rapamycin

2095-9958（2017）06-0 248-06

10.3969/j.issn.2095-9958.2017.03-19

*通信作者：沈彬，E-mail：shenbin_1971@163.com