引進(jìn)紅三葉種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析

柴繼寬，趙桂琴，孟麗娟

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070）

紅三葉（Trifoliumpratense）是豆科蝶形花亞科三葉草屬多年生草本植物，又名紅車軸草、紅花荷蘭翹搖、金雀菜等［1］，壽命較長(zhǎng)，一般可以生存5～8年，甚至10年以上［2］。紅三葉草質(zhì)柔軟，葉量豐富，品質(zhì)優(yōu)良，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，各種家畜均喜食［3］。此外，紅三葉也因含有大量的異黃酮等物質(zhì)而頗受保健品和醫(yī)藥產(chǎn)品市場(chǎng)的青睞［4］。

我國(guó)紅三葉種質(zhì)資源比較匱乏，野生種僅見于新疆、貴州、云南等地［5］。上世紀(jì)70年代從美國(guó)、新西蘭和歐洲引進(jìn)了一批紅三葉優(yōu)良品種，目前在生產(chǎn)中使用的已經(jīng)很少。我國(guó)在紅三葉方面的研究主要側(cè)重于栽培技術(shù)［6］，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［7］，轉(zhuǎn)基因［8］，異黃酮含量［9］以及高富硒能力［10］等方面。有關(guān)刈割時(shí)間、次數(shù)［11］對(duì)紅三葉再生草生物學(xué)特性的影響以及施氮、磷肥和緩釋復(fù)合肥［12］對(duì)紅三葉營(yíng)養(yǎng)元素含量、草產(chǎn)量和品質(zhì)效應(yīng)方面的報(bào)道也比較多。

到目前為止，通過全國(guó)草品種審定委員會(huì)等級(jí)的紅三葉品種只有4個(gè)，且都是地方品種。生產(chǎn)中使用的紅三葉品種主要來自國(guó)外。對(duì)引進(jìn)品種的深入研究是進(jìn)一步利用的基礎(chǔ)。由于地域差異，引進(jìn)種質(zhì)有時(shí)會(huì)表現(xiàn)出優(yōu)異的特性［13］，但受環(huán)境條件的影響比較大。同一基因型在不同環(huán)境條件下表現(xiàn)不同，而相同的表型又可能具有不同的基因型［14］。紅三葉是異花授粉植物，單純通過表型性狀來研究其遺傳關(guān)系以及進(jìn)行種質(zhì)篩選，可靠性比較低。在研究多樣性時(shí)，不僅要分析形態(tài)特征如外觀、葉型、株高、莖色、熟期等方面的差異，還需要分析其遺傳背景。因此，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)尤其是分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)紅三葉的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行研究顯得尤為重要。

通過分子標(biāo)記不僅可以了解到植物遺傳背景信息，還可以深入研究其遺傳多樣性，可靠性比較高［15］。ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）分子標(biāo)記技術(shù)是一種基于PCR的新興DNA分子標(biāo)記技術(shù)。與其他分子標(biāo)記相比，ISSR分子標(biāo)記具有很大的優(yōu)越性，如試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、成本低、快速靈敏、穩(wěn)定性高、所需DNA量少等［16-17］，而且不需要預(yù)先知道研究對(duì)象的基因組序列，大大減少了多態(tài)性分析的預(yù)備工作。近年來，ISSR分子標(biāo)記在牧草種質(zhì)資源的鑒定與評(píng)價(jià)中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。在苜蓿（MedicagoSativa）［18］、羊茅（FestucaOvina）［19］、雀麥屬（Bromus）［20］和鴨茅（Dactylis）［21-22］等種質(zhì)資源遺傳多樣性研究方面均有報(bào)道。三葉草方面的研究主要集中于白三葉。Sharmas等［23］利用形態(tài)學(xué)和RAPD分子標(biāo)記對(duì)引進(jìn)白三葉品種遺傳多樣性進(jìn)行了分析；George等［24］利用SSR標(biāo)記檢測(cè)了不同產(chǎn)地白三葉品種的遺傳多樣性。國(guó)內(nèi)李潤(rùn)芳［25］等、張婧源［26］等利用SRAP技術(shù)對(duì)白三葉種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了研究。紅三葉方面，Dias等［27］利用形態(tài)學(xué)和SSR分子標(biāo)記對(duì)來自35個(gè)國(guó)家的80份紅三葉的遺傳多樣性進(jìn)行了分析；Camposs等［28］利用RAPD分子標(biāo)記對(duì)4組紅三葉優(yōu)異親本材料遺傳多樣性進(jìn)行了分析；Herrmann等［29］對(duì)紅三葉AFLP反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化并對(duì)紅三葉野生種和栽培種的遺傳多樣性做了分析；Paplauskiene等［30］利用ISSR-PCR分子標(biāo)記研究紅三葉品種的遺傳變異。目前國(guó)內(nèi)利用ISSR標(biāo)記研究紅三葉遺傳多樣性尚未見報(bào)道。

本研究擬利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，從DNA分子水平上分析31份國(guó)外引進(jìn)紅三葉種質(zhì)間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性狀況，旨在為紅三葉種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)及合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為來自俄羅斯、加拿大和美國(guó)的31份紅三葉種質(zhì)材料（表1），均按10m2（2m×5m）的小區(qū)種植于甘肅省中部的榆中縣良種場(chǎng)；于分枝期取樣，每份材料隨機(jī)取30個(gè)單株，從每個(gè)單株上采集基部剛展開的新葉2～3片，置于-80℃冰箱內(nèi)保存。

1.2 基因組DNA的提取與檢測(cè)

采用改良的CTAB法［31］提取紅三葉葉片總DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，并用Gene Spec核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA質(zhì)量濃度。最后將樣品稀釋為20ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)材料及來源Table 1 The materials and their source

1.3 ISSR引物篩選

基于ISSR 標(biāo)記在苜蓿［18］、扁蓄豆（Pocockia ruthenia（L.）Boiss.）［32］、豬屎豆（Crotalariamucronata）［33］等豆科植物的研究報(bào)道。本研究ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）提供的100個(gè)ISSR引物序列，選出20個(gè)引物進(jìn)一步篩選用于紅三葉ISSR-PCR反應(yīng)，由上海生物工程有限公司合成。

1.4 ISSR-PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

利用正交設(shè)計(jì)，從4個(gè)水平上對(duì)影響ISSRPCR反應(yīng)體系的主要因素（Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物）進(jìn)行篩選與優(yōu)化，建立了重復(fù)性好、反應(yīng)穩(wěn)定的紅三葉ISSR-PCR反應(yīng)體系。即25μL反應(yīng)體系中，包含40ng模板DNA，10×PCR-buffer 2.5μL，2.5mmol·L-1Mg2+，2.5U Taq DNA聚合酶，引物1μmol·L-1，0.2mmol·L-1dNTP。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，引物退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)35次；72℃延伸7min，4℃保存。

PCR擴(kuò)增完成后，取8μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.7%的瓊脂糖凝膠上電泳，用DM2000作標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照，在1×TBE緩沖液中電泳約1h（電壓為100 V），檢測(cè)后置于UVP紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)電泳圖譜中清晰可辯的擴(kuò)增條帶在同一位置上的有無記數(shù)，有記為“1”，無記為“0”，統(tǒng)計(jì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)。計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)比率P=i/j×100%，式中i為多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)目，j為統(tǒng)計(jì)出的位點(diǎn)總數(shù)。用POPGEN1.32軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）、Nei基因多樣性指數(shù)（H）、有效等位基因數(shù)（Ne）和Shannon多樣性信息指數(shù)（I）。用軟件NTYSYS-PC 2.10e計(jì)算遺傳相似系數(shù)（genetic similarity）GS=2Nij/（Ni+Nj），式中，Ni和Nj分別為i和j兩材料的擴(kuò)增條帶數(shù)，Nij為i和j兩材料共有的擴(kuò)增條帶數(shù)。根據(jù)GS值按非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（UPMGA）進(jìn)行聚類分析，建立聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的質(zhì)量檢測(cè)

將提取的31個(gè)供試材料的基因組DNA的質(zhì)量進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。31份紅三葉種質(zhì)的基因組DNA都呈現(xiàn)清晰、可辨譜帶，無降解現(xiàn)象，無彌散的熒光出現(xiàn)，加樣孔清晰，同時(shí)無RNA和其他非特異性DNA片段污染，因此保證了供試材料DNA進(jìn)行ISSR分析的有效性和準(zhǔn)確性。

圖1 31個(gè)紅三葉品系基因組DNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis of genetic DNA for 31red clover accessions

2.2 ISSR引物篩選及擴(kuò)增條帶的多態(tài)性

利用兩個(gè)表型差異較大的材料對(duì)20個(gè)ISSR引物進(jìn)行篩選，淘汰擴(kuò)增效果差、帶型不易辨認(rèn)的引物，最終篩選出5個(gè)條帶清晰、穩(wěn)定性和重復(fù)性好且相對(duì)條帶較多的引物（表2）。利用這5個(gè)引物對(duì)所有31份紅三葉種質(zhì)基因組DNA進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出61個(gè)DNA片段，其中多態(tài)性帶58個(gè)，多態(tài)性比率高達(dá)95.08%。單條引物擴(kuò)增出的清晰條帶數(shù)在8～20條之間，平均每條引物擴(kuò)增出11.6條多態(tài)性條帶，其中引物850最多擴(kuò)增出20條多態(tài)性條帶；引物848最少能擴(kuò)增出4條多態(tài)性條帶。擴(kuò)增出的DNA片段集中在150～2000bp之間。其中，多態(tài)性百分率最高的為引物849，850和851，均為100%；最低的為引物841，為75%?？梢奍SSR檢測(cè)紅三葉種質(zhì)資源遺傳多樣性的效率很高，也表明紅三葉種質(zhì)在分子水平上的遺傳多樣性是比較豐富的。引物851對(duì)31份紅三葉種質(zhì)基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。

表2 供試材料的ISSR引物及擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Primers used in ISSR and amplification results of tested materials

圖2 UBC851對(duì)31份紅三葉種質(zhì)的ISSR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The amplification result of UBC851ISSR marker

2.3 遺傳多樣性分析

等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon多樣性信息指數(shù)（I）和Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）都是衡量遺傳多樣性水平的常用指標(biāo)。有效等位基因數(shù)（Ne）和Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）是目前應(yīng)用較為廣泛的遺傳多樣性指數(shù)，具有明顯的遺傳學(xué)意義。Shannon多樣性信息指數(shù)（I）本身沒有遺傳學(xué)意義，但方便與同類研究進(jìn)行比較［34］。通過 POPGENE1.32軟件分析，結(jié)果表明，31份紅三葉種質(zhì)材料的平均Na，Ne，H和I值分別為1.9508，1.3162，0.2092 和0.3427（表3）。

表3 31份紅三葉種質(zhì)材料遺傳多樣性指數(shù)Table 3 Genetic diversity indexes of 31red clover germplasm

2.4 遺傳相似性分析

遺傳相似系數(shù)是用來比較群體或個(gè)體間相似程度的度量參數(shù)，遺傳相似系數(shù)值越大，說明材料間相似程度越大，遺傳背景一致性越強(qiáng)［35］。利用5個(gè)引物產(chǎn)生的標(biāo)記信息，經(jīng)POPGENE1.32分析軟件計(jì)算31份紅三葉種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)（GS），得到供試材料相似系數(shù)矩陣（表4）。遺傳相似系數(shù)值越大，說明材料間的親緣關(guān)系越近，反之，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。由表4可知，31份紅三葉種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)在0.5902～0.9344之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.7840。從表4可以看出，1號(hào)和2號(hào)、5號(hào)和6號(hào)、17號(hào)和18號(hào)種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)最大（0.9344），說明他們之間的親緣關(guān)系最近，遺傳差異相對(duì)較??；16號(hào)和31號(hào)之間的遺傳相似系數(shù)最?。?.5902），說明二者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳差異相對(duì)較大。

表4 ISSR標(biāo)記的31份紅三葉材料之間的遺傳相似系數(shù)Table 4 Genetic similarity coefficient of 31red clover germplasm based on ISSR

2.5 聚類分析

為了確定各供試材料間的遺傳關(guān)系，通過NTSYS-PC 2.10e軟件，以31份紅三葉種質(zhì)材料和61個(gè)位點(diǎn)的譜帶數(shù)為原始矩陣，利用非加權(quán)平均距離法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建31個(gè)紅三葉種質(zhì)間的遺傳關(guān)系聚類圖（圖3）。從圖3可以看出，供試材料以遺傳相似系數(shù)0.806為閾值可以將31份紅三葉種質(zhì)聚為5類。第Ⅰ類由來自俄羅斯的10份紅三葉種質(zhì)材料組成；第Ⅱ類包括11份種質(zhì)材料，其中有來自俄羅斯的9份種質(zhì)和加拿大的2份種質(zhì)；第Ⅲ類由來自加拿大的2份紅三葉種質(zhì)組成；第Ⅳ類是來自加拿大的24號(hào)種質(zhì)；第Ⅴ類包括7份種質(zhì)材料，包括加拿大的2份種質(zhì)和美國(guó)的5份種質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性是生物所攜帶的遺傳信息總和，是每種生物所固有的特性，也是其生存、發(fā)展和進(jìn)化的基礎(chǔ)［36］。一個(gè)種群遺傳多樣性越高或越豐富，在環(huán)境發(fā)生變化時(shí)生存下來的可能性就越大，越容易擴(kuò)展其分布范圍和開拓新環(huán)境，可見物種或種群進(jìn)化潛力和適應(yīng)環(huán)境的能力取決于遺傳多樣性的大?。?7］。分子標(biāo)記能從DNA水平上檢測(cè)遺傳變異，是進(jìn)行物種遺傳多樣性、分類和親緣關(guān)系分析等方面研究的有力工具。ISSR標(biāo)記是一種基于PCR的分子標(biāo)記，結(jié)合了RAPD標(biāo)記技術(shù)和SSR標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，大多為顯性標(biāo)記，符合孟德爾遺傳規(guī)律，多態(tài)性很高，而且引物具有通用性，可以在多種植物中通用［38-39］，是一種重復(fù)性好、效率高的分子標(biāo)記，近年來在遺傳多樣性分析領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用［40-41］。ISSR比RAPD能檢測(cè)到更多的信息位點(diǎn)，更適用于紅三葉的遺傳多樣性分析。本研究利用ISSR技術(shù)對(duì)31份紅三葉種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行分析，從20條ISSR引物中篩選出5條多態(tài)性高、反應(yīng)穩(wěn)定的引物，共擴(kuò)增出61條帶，平均每條引物能擴(kuò)增出12.2條帶，其多態(tài)位點(diǎn)百分率（P）高達(dá)95.08%，Shannon信息指數(shù)（I）為0.3427，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.3162，Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）為0.2092，都反映出紅三葉種質(zhì)很高的遺傳多樣性。

圖3 31份紅三葉種質(zhì)基于ISSR的遺傳相似性UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA cluster analysis based on ISSR genetic identities among 31red clover germplasm

從相似系數(shù)看，31份紅三葉種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)分布在0.5902～0.9344之間，表明紅三葉的遺傳多樣性是比較豐富的，這與Ulloa等［42］利用RAPD標(biāo)記技術(shù)的研究結(jié)果相似。這種多態(tài)性將為紅三葉種質(zhì)資源異地保存、鑒定、適應(yīng)性評(píng)價(jià)以及生態(tài)型研究奠定可靠、穩(wěn)定的基因基礎(chǔ)。基于ISSR標(biāo)記，31份紅三葉種質(zhì)材料以遺傳相似系數(shù)0.806為分類界限，可以聚為5大類。從聚類圖上看，大多數(shù)來源地相同的紅三葉種質(zhì)資源聚在一起，如第Ⅰ類的材料全部來自加拿大，說明其親緣關(guān)系較近；李紅等［43］在研究苜蓿遺傳多樣性時(shí)也得到了相似的結(jié)論，即來自不同地區(qū)的種質(zhì)，大部分可按地理來源聚為一類。但也存在部分同一來源地的種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)差異較大無法聚為一類的情況，如來自加拿大的24號(hào)種質(zhì)材料單獨(dú)聚為一類。與其他種質(zhì)材料的遺傳距離較遠(yuǎn)，這與其獨(dú)特的表型相符，24號(hào)種質(zhì)材料具有葉片大、再生速度快、干草產(chǎn)量高等優(yōu)異特性。

作者對(duì)31份紅三葉種質(zhì)的形態(tài)特征和農(nóng)藝性狀也進(jìn)行了研究［44］，發(fā)現(xiàn)來自美國(guó)的材料葉片大、節(jié)間長(zhǎng)、干草產(chǎn)量高、再生速度快、種子千粒重；俄羅斯的種質(zhì)普遍分枝數(shù)多、葉片小、節(jié)間短、干草產(chǎn)量較低、種子也較小。根據(jù)形態(tài)特征的聚類結(jié)果把31個(gè)紅三葉種質(zhì)分成4類，表現(xiàn)優(yōu)良的23號(hào)和24號(hào)種質(zhì)聚為同一類。ISSR分子標(biāo)記將31份紅三葉種質(zhì)在遺傳相似系數(shù)0.806處聚為5類，24號(hào)種質(zhì)材料單獨(dú)聚為一類，與其他材料遺傳距離較遠(yuǎn)。雖然兩種聚類分析都可將大部分地理來源相近的種質(zhì)聚在一起，但I(xiàn)SSR標(biāo)記聚類的結(jié)果與基于形態(tài)特征聚類的結(jié)果仍然存在一些差別。這可能是由于ISSR標(biāo)記體現(xiàn)的是種質(zhì)材料間分子水平上的差異，而表型性狀的差異是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果，因此，檢測(cè)出的遺傳差異并不都與所觀測(cè)的表型差異相一致。作為傳統(tǒng)分類的補(bǔ)充，ISSR分子標(biāo)記可減少由形態(tài)描述和環(huán)境條件產(chǎn)生的誤差，從分子水平鑒定種質(zhì)資源之間的差異［45］，不受取材、時(shí)間及人為等因素的影響［46］，更容易把不同的種質(zhì)材料區(qū)分開。因此，ISSR標(biāo)記在一定程度上能更本質(zhì)地反映出紅三葉種質(zhì)資源間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。在實(shí)際應(yīng)用中可將ISSR分析結(jié)果直接應(yīng)用于品種選育，選擇遺傳距離較大、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的材料做親本，以增加后代的遺傳重組，提高雜種優(yōu)勢(shì)。